基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)探討加味導(dǎo)赤散治療心脾積熱證復(fù)發(fā)性口腔潰瘍的活性成分及作用機(jī)制

張 鴿，胡 月，王倩倩，李艷青，郭洪波

復(fù)發(fā)性口腔潰瘍(recurrent oral ulcer，ROU)又名復(fù)發(fā)性阿弗他潰瘍(recurrent aphthous ulcer，RAU)，是一種好發(fā)于唇、舌、頰和軟腭等部位的孤立的、圓形或橢圓形潰瘍，常伴有自發(fā)性疼痛，易反復(fù)發(fā)作，病程有自限性，是口腔黏膜病中最常見的潰瘍類疾病，患病率高，居口腔黏膜病之首位。發(fā)病機(jī)制可能與機(jī)體的免疫功能紊亂、口腔菌群失調(diào)、微量元素缺失、微循環(huán)障礙等有關(guān)，病因尚不十分明確[1]。復(fù)發(fā)性口腔潰瘍包括起始、初級(jí)損傷反應(yīng)、擴(kuò)展損傷反應(yīng)、潰瘍形成和修復(fù)5個(gè)階段，炎癥反應(yīng)貫穿整個(gè)過程?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)主要采用化學(xué)藥物治療，常用的藥物有維生素類、免疫調(diào)節(jié)類以及局部使用消炎類、激素類、止痛類藥物[2]，尚缺乏有效的根治方法。根據(jù)癥狀表現(xiàn)，中醫(yī)將復(fù)發(fā)性口腔潰瘍歸屬于口糜、口瘡范圍[3]，病因病機(jī)多為心火亢盛，火熱郁熾血脈，局部血敗肉腐，則為癰腫瘡瘍。郭洪波教授治療復(fù)發(fā)性口腔潰瘍心脾積熱證時(shí)以加味導(dǎo)赤散，多年臨證“驗(yàn)之事不忒”。導(dǎo)赤散出自宋代錢乙的《小兒藥證直訣》，由生地黃、木通、甘草、淡竹葉組成，主治心胸?zé)?，口渴面赤，意欲飲冷，口舌生瘡；或心熱移于小腸、小便赤澀刺痛、舌紅、脈數(shù)等心經(jīng)火熱證。用通草易關(guān)木通，再加生石膏而成，延續(xù)了導(dǎo)赤散利水而不傷陰，滋陰而不戀邪，既清熱又養(yǎng)陰之藥性，又增加了其清熱瀉火之力和斂瘡之功。本方藥僅5味，配伍嚴(yán)謹(jǐn)，在復(fù)發(fā)性口腔潰瘍發(fā)病過程中給予了綜合、針對(duì)性的治療，與辛寒之石膏同用，使心脾熱邪得寒而止。本研究將中醫(yī)學(xué)、現(xiàn)代醫(yī)學(xué)及生物信息學(xué)巧妙結(jié)合，旨在基于“心主血脈”“心部于表”及微循環(huán)障礙理論分析復(fù)發(fā)性口腔潰瘍的病因病機(jī)。在此理論指導(dǎo)下，選用加味導(dǎo)赤散治療本病，并從現(xiàn)代藥理及分子生物學(xué)等角度探討其作用機(jī)制，使用分子對(duì)接驗(yàn)證生地黃在改善微循環(huán)方面發(fā)揮的作用。

1 資料與方法

1.1 加味導(dǎo)赤散化學(xué)成分的篩選 借助中藥系統(tǒng)藥理學(xué)技術(shù)平臺(tái)(TCMSP)[4]收集加味導(dǎo)赤散中甘草、通草的化學(xué)成分，對(duì)化合物進(jìn)行篩選[5]，以口服利用度(oral bio availability，OB)≥30%、類藥性(drug-likeness，DL)≥0.18為篩選條件，在BATMAN-TCM(http://bionet.ncpsb.org/batman-tcm/)[6]數(shù)據(jù)庫收集淡竹葉、生地黃的化學(xué)成分，并以Score cutoff>20、P<0.05為篩選條件，文獻(xiàn)檢索石膏的化學(xué)成分，獲得5種中藥的化學(xué)成分。

1.2 加味導(dǎo)赤散活性成分及潛在靶點(diǎn)預(yù)測 通過TCMSP、BATMAN-TCM數(shù)據(jù)庫及文獻(xiàn)檢索，獲取加味導(dǎo)赤散(石膏、淡竹葉、通草、生地黃、炙甘草)活性成分的作用靶點(diǎn)，并使用UniProt數(shù)據(jù)庫[7]對(duì)靶點(diǎn)名稱進(jìn)行轉(zhuǎn)換和矯正。

1.3 復(fù)發(fā)性口腔潰瘍疾病靶點(diǎn)預(yù)測 以“recurrent oral ulcer”為關(guān)鍵詞，在GeneCards數(shù)據(jù)庫進(jìn)行檢索，獲取全部的復(fù)發(fā)性口腔潰瘍疾病靶點(diǎn)。

1.4 加味導(dǎo)赤散治療復(fù)發(fā)性口腔潰瘍的靶點(diǎn)預(yù)測 使用Venny在線作圖工具(維尼2.1.0)將加味導(dǎo)赤散靶點(diǎn)與復(fù)發(fā)性口腔潰瘍作用靶點(diǎn)取交集得到加味導(dǎo)赤散治療復(fù)發(fā)性口腔潰瘍靶點(diǎn)。

1.5 構(gòu)建中藥-成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)及拓?fù)鋵傩苑治?利用獲取的交集靶點(diǎn)制作Network以及Type文件，并將準(zhǔn)備好的文件導(dǎo)入Cytoscape 3.8.2軟件制作中藥-成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖，并利用工具分析網(wǎng)絡(luò)屬性，導(dǎo)出屬性文件，進(jìn)行拓?fù)鋵傩苑治?，通過藥物與化合物及化合物與靶點(diǎn)連接情況，篩選出加味導(dǎo)赤散治療靶點(diǎn)作用于復(fù)發(fā)性口腔潰瘍的關(guān)鍵化合物和靶點(diǎn)，同時(shí)結(jié)合現(xiàn)有報(bào)道文獻(xiàn)進(jìn)行分析。

1.6 構(gòu)建蛋白相互作用(PPI)網(wǎng)絡(luò)及拓?fù)鋵傩苑治?將獲取的加味導(dǎo)赤散治療復(fù)發(fā)性口腔潰瘍的靶點(diǎn)上傳至STRING數(shù)據(jù)庫(https://string-db.org/)[8]，物種選擇為“Homo sapiens(智人)”，并設(shè)置條件“minimum required interaction score=0.4”和“hided is connected nodes in the network”，隨后導(dǎo)入輸出文件，利用Cytoscape 3.8.2軟件制作PPI網(wǎng)絡(luò)圖并進(jìn)行拓?fù)渚W(wǎng)絡(luò)分析，同時(shí)構(gòu)建藥物-化合物-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)，并利用Network Analyzer進(jìn)行拓?fù)浞治觥?/p>

1.7 基因本體(GO)富集與京都基因與基因組百科全書(KEGG)通路分析 采用DAVID6.8數(shù)據(jù)庫(https://david.ncifcrf.gov/)[9]對(duì)加味導(dǎo)赤散治療靶點(diǎn)進(jìn)行GO功能富集分析和KEGG通路富集分析，隨后導(dǎo)出富集分析結(jié)果文件，利用R語言進(jìn)行作圖實(shí)現(xiàn)結(jié)果可視化。

1.8 分子對(duì)接 通過PubChem數(shù)據(jù)庫[10]收集生地黃活性成分3D結(jié)構(gòu)，篩選生地黃作用的基因靶點(diǎn)中與微循環(huán)相關(guān)靶點(diǎn)：內(nèi)皮素-1(EDN1)、纖溶酶原激活劑(PLAT)、纖溶酶原(PLG)、整合素β-2(ITGB2)、蛋白激酶C-δ型(PRKCD)，并從PDB數(shù)據(jù)庫[11]篩選其最佳蛋白的晶體結(jié)構(gòu)(有配體、結(jié)構(gòu)相對(duì)完整)分別為：與EDN1復(fù)合的人內(nèi)皮素受體B型(5GLH)、雙苯甲脒人雙鏈組織型纖溶酶原活化劑復(fù)合物的催化結(jié)構(gòu)域(1A5H)、重組纖溶酶原KRingle 1的結(jié)構(gòu)和纖維蛋白結(jié)合位點(diǎn)(1PKR)、整合素β2亞基的PHE2和PHE3片段結(jié)構(gòu)(2P28)、磷酸酪氨酸結(jié)合結(jié)構(gòu)域(1YRK)。利用AutoDock Tolls 1.5.6軟件進(jìn)行分子對(duì)接，結(jié)合能(predicted binding affinity)越小則表明蛋白與配體對(duì)接活性越好，利用Pymol 2.3.0分別對(duì)結(jié)合能最低的對(duì)接模式進(jìn)行可視化處理。

2 結(jié) 果

2.1 加味導(dǎo)赤散中活性成分及靶點(diǎn)的篩選 在TCMSP數(shù)據(jù)庫中搜索加味導(dǎo)赤散各單味藥，基于ADME參數(shù)OB≥30%、DL≥0.18的條件初步篩選出91個(gè)活性成分，其中甘草88個(gè)，通草3個(gè)，重復(fù)成分1個(gè)，在BATMAN-TCM(http://bionet.ncpsb.org/batman-tcm/)數(shù)據(jù)庫檢索淡竹葉和生地黃，最終得到8個(gè)有效成分，其中淡竹葉4個(gè)，生地黃4個(gè)。文獻(xiàn)檢索得到石膏化學(xué)成分1個(gè)，綜合兩個(gè)數(shù)據(jù)庫及文獻(xiàn)檢索，共得到加味導(dǎo)赤散活性成分99個(gè)。最后用UniProt數(shù)據(jù)庫將TCMSP數(shù)據(jù)庫中得到的靶點(diǎn)名轉(zhuǎn)換為Gene symbol，得到5味藥物的靶點(diǎn)，去除重復(fù)值后，得到426個(gè)藥物靶點(diǎn)，包括甘草225個(gè)，地黃216個(gè)，石膏0個(gè)，淡竹葉7個(gè)，通草3個(gè)，其中25個(gè)重復(fù)靶點(diǎn)。

2.2 復(fù)發(fā)性口腔潰瘍疾病靶點(diǎn)的獲取 在GeneCards數(shù)據(jù)庫中以“recurrent oral ulcer”為關(guān)鍵詞，檢索疾病靶點(diǎn)，并3次計(jì)算Relevance score值的中位數(shù)，選擇大于中位數(shù)的疾病靶點(diǎn)，最終得到479個(gè)疾病靶點(diǎn)。

2.3 加味導(dǎo)赤散治療復(fù)發(fā)性口腔潰瘍的靶點(diǎn)預(yù)測 將藥物靶點(diǎn)和疾病靶點(diǎn)列表分別放入維尼2.1.0得到疾病與藥物的交集靶點(diǎn)，共93個(gè)交集。詳見圖1。

圖1 疾病與藥物的交集靶點(diǎn)Venn圖

2.4 中藥-成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建及分析結(jié)果 通過Cytoscape 3.8.2來構(gòu)建加味導(dǎo)赤散治療復(fù)發(fā)性口腔潰瘍的藥物-成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖(見圖 2)。圖中菱形代表共同靶點(diǎn)，圓形代表藥物及其有效活性成分，顏色越深，圖形越大，代表度值(degree)越大，連線越粗，連接越緊密。結(jié)果顯示，藥物-化合物-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)總共186個(gè)節(jié)點(diǎn)、791條邊，包括90個(gè)化合物節(jié)點(diǎn)，93個(gè)靶點(diǎn)節(jié)點(diǎn)，其中3個(gè)單味藥節(jié)點(diǎn)，依照交集結(jié)果，各單味藥度值從大到小排名為甘草(84)、淡竹葉(3)、生地黃(3)、通草(0)、石膏(0)。排名前5位的化合物為槲皮素(quercetin)、山奈酚(kaempferol)、甘草查爾酮A(licochalcone a)、柚皮苷(naringenin)、異鼠李素(isorhamnetin)。詳見表 1。網(wǎng)絡(luò)圖中度值排名前10位的靶點(diǎn)為前列素內(nèi)環(huán)氧化物合成酶2(PTGS2)、雌激素受體(ESR1)、雄激素受體(AR)、過氧化物酶體增殖物激活受體γ(PPARG)、誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(NOS2)、細(xì)胞周期蛋白A2(CCNA2)、凝血因子X(F10)、前列素內(nèi)環(huán)氧化物合成酶2(PTGS1)、二肽基肽酶-4(DPP4)、血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子受體2(KDR)。預(yù)測這些關(guān)鍵化合物和靶點(diǎn)在加味導(dǎo)赤散對(duì)復(fù)發(fā)性口腔潰瘍的治療調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中起著至關(guān)重要的作用。

圖2 中藥-成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖

表1 加味導(dǎo)赤散中主要有效化合物基本信息

2.5 PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建及關(guān)鍵靶點(diǎn)篩選 將加味導(dǎo)赤散的治療靶點(diǎn)基因?qū)隨TRING數(shù)據(jù)庫數(shù)據(jù)庫，設(shè)置篩選條件為智人，設(shè)置條件“minimum required interaction score=0.9”和“hided is connected nodes in the network”，保存得到的相應(yīng)結(jié)果文件，得出88個(gè)基因靶點(diǎn)，PPI網(wǎng)絡(luò)如圖 3所示，顏色越深，圖形越大，degree值越高，篩選排名前10位的靶點(diǎn)分別為信號(hào)傳導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活因子3(STAT3)、腫瘤壞死因子(TNF)、絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶1(AKT1)、白細(xì)胞介素6(IL6)、細(xì)胞腫瘤抗原p53(TP53)、血管內(nèi)皮生長因子-α(VEGFA)、 轉(zhuǎn)錄因子p65(RELA)、絲裂原激活蛋白激酶(MAPK)1、表皮生長因子受體(EGFR)、胰島素(INS)，提示這些靶點(diǎn)在加味導(dǎo)赤散治療復(fù)發(fā)性口腔潰瘍中可能具有重要作用。

圖3 PPI網(wǎng)絡(luò)圖

2.6 GO富集分析結(jié)果 利用DAVID6.8進(jìn)行GO分析，導(dǎo)出結(jié)果文件，并用R語言將結(jié)果可視化。結(jié)果得到GO生物學(xué)過程(biological process，BP)600個(gè)條目，前10個(gè)為生物學(xué)過程中RNA聚合酶Ⅱ的轉(zhuǎn)錄正調(diào)控、炎癥反應(yīng)、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、對(duì)缺氧的反應(yīng)、免疫反應(yīng)、對(duì)藥物的反應(yīng)、積極調(diào)控細(xì)胞增殖、對(duì)脂多糖的反應(yīng)、凋亡過程的負(fù)調(diào)控、轉(zhuǎn)錄的正調(diào)控，DNA模板。GO細(xì)胞組分(cellular component，CC)50個(gè)條目，前10個(gè)分別為細(xì)胞外空間、細(xì)胞質(zhì)、質(zhì)膜、細(xì)胞外區(qū)域、胞質(zhì)溶膠、細(xì)胞外泌體、膜、線粒體、質(zhì)膜的組成部分、細(xì)胞質(zhì)的核周區(qū)域。GO分子功能(molecular function，MF)85個(gè)條目，前10個(gè)分別為蛋白質(zhì)結(jié)合、相同的蛋白質(zhì)結(jié)合、蛋白質(zhì)均二聚活性、細(xì)胞因子活性、酶結(jié)合、血紅素結(jié)合、蛋白質(zhì)異二聚活性、鋅離子結(jié)合、受體結(jié)合、轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合。詳見圖 4～圖 6。

圖4 GO-BP富集分析結(jié)果

圖5 GO-CC富集分析結(jié)果

圖6 GO-MF富集分析結(jié)果

2.7 KEGG通路分析結(jié)果 KEGG通路富集分析發(fā)現(xiàn)93個(gè)共同靶點(diǎn)有92個(gè)(98.9%)被富集，共105個(gè)通路，前20條通路主要富集為：乙型肝炎、癌癥的途徑、膀胱癌、缺氧誘導(dǎo)因子1(HIF-1)、TNF信號(hào)通路、恰加斯病、胰腺癌、利什曼病、前列腺癌、蛋白聚糖在癌癥中、瘧疾、弓形體病、磷脂酰肌醇-3-羥激酶(PI3K)-蛋白激酶B(Akt)信號(hào)通路、肺結(jié)核、細(xì)胞凋亡、炎癥性腸病、小細(xì)胞肺癌、非酒精性脂肪肝、核轉(zhuǎn)錄因子-κB(NF-κB)信號(hào)通路、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎。利用R語言作圖，詳見圖 7。

圖7 KEGG富集分析結(jié)果

2.8 分子對(duì)接結(jié)果 結(jié)合能較低的6對(duì)是PLAT與campesterol、PLG與Gamma-Aminobutyric Acid、EDN1與campesterol、PRKCD與campesterol、PLG與campesterol、ITGB2與campesterol；用Pymol 2.3.0軟件將分子對(duì)接可視化，最后兩組最低結(jié)合能狀態(tài)下無氫鍵形成。詳見表2、圖 8。

表2 生地黃有效成分-關(guān)鍵靶點(diǎn)分子對(duì)接結(jié)果

圖8 分子對(duì)接模式及結(jié)果

3 討 論

心主血脈，脈為血府，與心相連，在心氣充沛，血液充盈，脈道通利的情況，心氣才能推動(dòng)血液暢行脈中，環(huán)周不休。心、血、脈三者的正常是保證血運(yùn)暢通的條件。王麗丹等[12]經(jīng)理論研究得出血與脈的生理和病理與心關(guān)系密切。徐吉利等[13]認(rèn)為“心部于表”有兩方面涵義：其一，心氣的運(yùn)動(dòng)趨勢(shì)是向上向外，故主體表；其二表為“陽”意時(shí)，“心部于表”是指心的生理特性即心屬火、為陽中之陽臟。故而《外臺(tái)秘要》云：“口瘡者，心脾有熱，氣沖上焦，熏發(fā)口舌故作瘡也?！眳且詭X[14]認(rèn)為，中醫(yī)“絡(luò)脈”在形態(tài)和功能上與現(xiàn)代醫(yī)學(xué)的微血管和微循環(huán)相似，絡(luò)病的病理變化涉及現(xiàn)代醫(yī)學(xué)中血液流變學(xué)改變、局部微循環(huán)障礙、血流力學(xué)改變及細(xì)胞因子調(diào)控異常等。在復(fù)發(fā)性口腔潰瘍發(fā)生發(fā)展過程中均不同程度上有血流動(dòng)力學(xué)、血液流變學(xué)及微血管病變參與到微循環(huán)障礙的發(fā)生過程中，微循環(huán)障礙使局部組織細(xì)胞缺氧壞死，引起黏膜組織損傷，同時(shí)會(huì)使局部血管的通透性增加，導(dǎo)致免疫物質(zhì)滲出而引起自身免疫反應(yīng)。

從中藥-成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖中得出，治療復(fù)發(fā)性口腔潰瘍的有效成分為槲皮素、山奈酚、甘草查爾酮A、柚皮苷、異鼠李素?；A(chǔ)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，異鼠李素的消炎作用主要是抑制NF-κB途徑[15]。炎癥反應(yīng)各個(gè)階段的許多分子受NF-κB調(diào)節(jié)，包括TNF-α、白細(xì)胞介素1β(IL-1β)、白細(xì)胞介素2(IL-2)、IL6、白細(xì)胞介素8(IL-8)、白細(xì)胞介素12(IL-12)、誘導(dǎo)型一氧化氮合酶2(iNOS)、環(huán)氧化物酶2(COX2)、趨化因子、黏附分子、菌落刺激因素以及其他因素。另外，從體外研究和體內(nèi)動(dòng)物模型獲得的結(jié)果表明，柚皮苷可以下調(diào)幾種炎癥性標(biāo)志物的表達(dá)，如toll樣受體4(TLR4)、TNF-α、IL-1β、IL6、iNOS，通過減弱NF-κB通路和激活腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)來激活COX2，這與多種促炎信號(hào)通路的抑制作用有關(guān)[16]。山奈酚通過抑制蛋白激酶和轉(zhuǎn)錄因子對(duì)炎癥相關(guān)疾病(包括過敏、關(guān)節(jié)炎、糖尿病、心血管疾病、癌癥和神經(jīng)系統(tǒng)退化)具有治療作用。山奈酚能夠通過下調(diào)活性氧(ROS)依賴的MAPK-NF-κB和凋亡信號(hào)通路來減輕氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)[17]。槲皮素[18]可阻止巨噬細(xì)胞中細(xì)菌脂多糖引起的iNOS、IL-1β和TNF-α的分泌，RAW2647細(xì)胞中TNF-α的分泌，細(xì)胞因子刺激的血管細(xì)胞黏附分子1(VCAM-1)和細(xì)胞間黏附分子1(ICAM-1)的表達(dá)，以及人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞中的E-選擇。研究表明，甘草查爾酮A顯著上調(diào)小鼠巨噬細(xì)胞RAW 2647細(xì)胞中抗氧化酶血紅素氧合酶1(HO-1)和核因子紅系2相關(guān)因子2(Nrf2)[19]。這種上調(diào)與Nrf2核易位的誘導(dǎo)、Keap1蛋白表達(dá)的降低和抗氧化反應(yīng)元件(ARE)啟動(dòng)子活性的升高有關(guān)。由此可見，甘草的多種有效成分除消除炎癥反應(yīng)之外，還可從多方面改善復(fù)發(fā)性口腔潰瘍病人的微循環(huán)障礙。且度值較高的靶點(diǎn)中凝血因子X(F10)、血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子受體2(KDR)、誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(NOS2)均為與微循環(huán)障礙相關(guān)的靶點(diǎn)，由此可知，加味導(dǎo)赤散治療復(fù)發(fā)性口腔潰瘍時(shí)對(duì)其血液、血管的病理狀況可起到改善作用。

從PPI網(wǎng)絡(luò)圖分析得出，PTGS2和 PTGS1是炎性疾病的重要靶點(diǎn)，當(dāng)機(jī)體受脂多糖、真菌病原體和TNF-α、IL-1β等促炎癥因子刺激后，PTGS2和PTGS1的表達(dá)迅速增加，引起炎性反應(yīng)，導(dǎo)致組織損傷。MAPK14參與機(jī)體的免疫調(diào)節(jié)與炎癥反應(yīng)，可以調(diào)控 TNF-α、IL-1、IL-6等細(xì)胞因子的基因表達(dá)。DPP4是一種細(xì)胞表面糖蛋白，通過調(diào)節(jié)T細(xì)胞活化、細(xì)胞因子的水平、T細(xì)胞依賴性抗體的生成和B細(xì)胞免疫球蛋白參與介導(dǎo)機(jī)體免疫功能和疾病的發(fā)病機(jī)制，在巨噬細(xì)胞介導(dǎo)的炎癥、組織重塑和自身免疫性疾病中發(fā)揮重要作用。胰島素可以通過增加角質(zhì)形成細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞和成纖維細(xì)胞的再上皮化、血管生成和細(xì)胞外基質(zhì)分泌的速率來促進(jìn)愈合?？梢詺w因于胰島素作為一種生長因子在愈合事件中的合成代謝作用。胰島素作用于生長激素受體，增加人角質(zhì)細(xì)胞的遷移、再上皮化以及膠原含量、肉芽組織和纖維母細(xì)胞局部胰島素樣生長因子的產(chǎn)生[20]。IL6是一種由巨噬細(xì)胞、T細(xì)胞、B細(xì)胞等多種細(xì)胞產(chǎn)生的淋巴因子，能使B細(xì)胞前體成為產(chǎn)生抗體的細(xì)胞；與集落刺激因子協(xié)同，能促進(jìn)原始骨髓源細(xì)胞的生長和分化，增強(qiáng)自然殺傷細(xì)胞的裂解功能；能被TNF-α、IL-1等誘導(dǎo)且是急性期反應(yīng)的主要細(xì)胞因子。

GO生物學(xué)過程中炎癥反應(yīng)、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、對(duì)缺氧的反應(yīng)、免疫反應(yīng)、對(duì)藥物的反應(yīng)、積極調(diào)控細(xì)胞增殖、對(duì)脂多糖的反應(yīng)、凋亡過程的負(fù)調(diào)控等與加味導(dǎo)赤散治療復(fù)發(fā)性口腔潰瘍的機(jī)制密切相關(guān)，GO分子功能中血紅素結(jié)合這一功能或可改善復(fù)發(fā)性口腔潰瘍病人的微循環(huán)障礙。KEGG富集分析發(fā)現(xiàn)，與本研究密切相關(guān)的通路有HIF-1、TNF信號(hào)通路、PI3K-Akt信號(hào)通路、細(xì)胞凋亡、NF-κB信號(hào)通路等。何璐[21]經(jīng)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，模型組γ干擾素(IFN-γ)和白細(xì)胞介素4(IL-4)水平都升高，加味導(dǎo)赤散高劑量組、中劑量組、低劑量組治療后血清IFN-γ和IL-4水平均降低，其中以高劑量組IFN-γ降低水平最為明顯。這一結(jié)果與GO富集分析研究高度吻合，由此可知，加味導(dǎo)赤散治療復(fù)發(fā)性口腔潰瘍或可通過改善細(xì)胞因子進(jìn)一步影響微循環(huán)。

李玲[22]經(jīng)臨床實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)復(fù)發(fā)性口腔潰瘍病人紅細(xì)胞聚集指數(shù)、全血切變率、全血低切相對(duì)指數(shù)、全血低切還原黏度較對(duì)照組呈上調(diào)表達(dá)，卡松黏度低于對(duì)照組，提示復(fù)發(fā)性口腔潰瘍的發(fā)生與血流變指標(biāo)異常導(dǎo)致的微循環(huán)障礙有關(guān)，并且指出了微循環(huán)障礙的主要因素是血流變紅細(xì)胞聚集性的增加。現(xiàn)代藥理研究發(fā)現(xiàn)，地黃根莖主要含β-谷甾醇與甘露醇，及少量豆甾醇、微量的菜油甾醇(Campesterol)，還含地黃素、生物堿、脂肪酸、梓醇與維生素A類物質(zhì)，地黃乙醇提取物對(duì)麻醉動(dòng)物有降低血壓及促進(jìn)血液凝固的作用[23]。從分子對(duì)接結(jié)果可知，菜油甾醇與這五種基因靶點(diǎn)結(jié)合均有最低結(jié)合能產(chǎn)生，且與PLAT的結(jié)合能最低，PLAT即纖溶酶原激活劑，通過水解纖溶酶原中的單個(gè) Arg-Val鍵，將豐富但無活性的酶原纖溶酶原轉(zhuǎn)化為纖溶酶。通過控制纖溶酶介導(dǎo)的蛋白水解，在組織重塑和降解、細(xì)胞遷移和許多其他病理生理事件中發(fā)揮重要作用。通草具有通利血脈、清熱利尿的功效，現(xiàn)代基礎(chǔ)藥理研究利用二氯甲烷和甲醇對(duì)通草進(jìn)行提取，結(jié)果表明，通草中80%的化合物和抗凝血酶Ⅲ類具有類似作用，從而表明通草具有預(yù)防血栓的作用[25]。

綜上所述，加味導(dǎo)赤散治療復(fù)發(fā)性口腔潰瘍是多種成分作用于多靶點(diǎn)、多通路，其中多個(gè)靶點(diǎn)及通路均涉及“絡(luò)病”的病理變化。本研究證實(shí)，生地黃、通草、甘草等的有效成分可明顯改善微循環(huán)障礙，這與微循環(huán)障礙多因素相互交錯(cuò)重疊的機(jī)制相契合，也表明了“心主血脈”“心部于表”及“絡(luò)病學(xué)”理論指導(dǎo)臨床用藥之意義重大，值得進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。