缺血性卒中后小膠質(zhì)細(xì)胞的異質(zhì)性活化對腦內(nèi)皮細(xì)胞的作用

許瑤，周羅綺，秦川，田代實，王偉

卒中是目前導(dǎo)致人類死亡的主要疾病之一[1]，每年約795000 人新發(fā)或復(fù)發(fā)卒中，其中87%的患者為缺血性卒中發(fā)作[2]。小膠質(zhì)細(xì)胞作為中樞神經(jīng)系統(tǒng)（central nervous system，CNS）常駐巨噬細(xì)胞群中最豐富的一種[3]，是抵御CNS損害的第一道防線[4]。研究表明，小膠質(zhì)細(xì)胞在缺血性卒中疾病進(jìn)程中持續(xù)處于增殖、活化狀態(tài)，對小膠質(zhì)細(xì)胞表型異質(zhì)性的探索成為研究熱點(diǎn)。以單細(xì)胞RNA 測序（single cell RNA sequencing，scRNA-seq）為代表的高新技術(shù)不斷發(fā)展，促進(jìn)了在單細(xì)胞水平上對小膠質(zhì)細(xì)胞異質(zhì)性的認(rèn)知和理解[5]。小膠質(zhì)細(xì)胞、腦內(nèi)皮細(xì)胞和周細(xì)胞、星形膠質(zhì)細(xì)胞、神經(jīng)元突起、基底膜共同構(gòu)成神經(jīng)血管單元（neurovascular unit，NVU）[6]，腦血管內(nèi)皮細(xì)胞是血腦屏障（blood-brain barrier，BBB）的重要組成部分，NVU各組分之間的相互作用對于BBB完整性的破壞、腦損傷的發(fā)生與修復(fù)密切相關(guān)。近年來，小膠質(zhì)細(xì)胞的異質(zhì)性活化在缺血性腦卒中后微環(huán)境中發(fā)揮的作用逐漸引起重視。本文旨在綜述缺血性卒中時異質(zhì)性活化的小膠質(zhì)細(xì)胞對腦內(nèi)皮細(xì)胞的作用。

1 缺血性卒中時小膠質(zhì)細(xì)胞發(fā)生異質(zhì)性活化

作為CNS 的監(jiān)測者與防御屏障，根據(jù)小膠質(zhì)細(xì)胞的促炎或抗炎等細(xì)胞因子的表達(dá)水平，曾將生理情況下處于靜息狀態(tài)的小膠質(zhì)細(xì)胞定義為M0型，將疾病狀態(tài)下活化的小膠質(zhì)細(xì)胞定義為具有相對異質(zhì)性的兩種表型：釋放促炎介質(zhì)TNFα、IL-6 等的M1型，和釋放抗炎、促血管生成因子IL4、TGFβ等的M2型[7]。隨著以scRNA-seq 為代表的單細(xì)胞測序技術(shù)在神經(jīng)系統(tǒng)疾病的廣泛應(yīng)用，發(fā)現(xiàn)傳統(tǒng)的M1 型和M2 型小膠質(zhì)細(xì)胞的分型標(biāo)準(zhǔn)并不能闡明活化小膠質(zhì)細(xì)胞的異質(zhì)性，許多轉(zhuǎn)錄水平的標(biāo)記物通過單細(xì)胞測序被發(fā)現(xiàn)并用于小膠質(zhì)細(xì)胞亞群的定義[8]。

研究發(fā)現(xiàn)，清除阿爾茲海默癥模型小鼠的腦小膠質(zhì)細(xì)胞，會增加病灶內(nèi)的微出血和β淀粉樣蛋白在血管壁上的沉積[13]，提示小膠質(zhì)細(xì)胞可能參與調(diào)控血管內(nèi)皮細(xì)胞的功能。于是，基于小膠質(zhì)細(xì)胞與血管內(nèi)皮細(xì)胞的位置關(guān)系，血管相關(guān)小膠質(zhì)細(xì)胞（vessel-associated microglia，VAM）這一概念也被提出。Koizumi等[11]通過體內(nèi)雙光子成像技術(shù)，證實了一類與腦微血管穩(wěn)定作用的分支狀髓系細(xì)胞正是高表達(dá)Iba1和Cx3cr1的小膠質(zhì)細(xì)胞。這群小膠質(zhì)細(xì)胞與位于膠質(zhì)界膜外血管周圍間隙的血管旁巨噬細(xì)胞不同，它們存在于腦實質(zhì)中，高度富集于脈管系統(tǒng)并與腦微血管并列，主要通過胞體與血管內(nèi)皮細(xì)胞產(chǎn)生穩(wěn)定的作用。Császár 等[12]發(fā)現(xiàn)VAM 的突起可以穿透NVU 的星形膠質(zhì)細(xì)胞終足進(jìn)而與腦血管內(nèi)皮細(xì)胞產(chǎn)生直接接觸，還可以通過ATP-P2Y12R 與腦內(nèi)皮細(xì)胞產(chǎn)生直接聯(lián)系來調(diào)控腦內(nèi)皮細(xì)胞的線粒體功能。因此，缺血性卒中發(fā)生時BBB的破壞、腦損傷的發(fā)生、NVU的修復(fù)等過程都與小膠質(zhì)細(xì)胞調(diào)控腦內(nèi)皮細(xì)胞功能改變密切相關(guān)，體現(xiàn)了異質(zhì)性活化的小膠質(zhì)細(xì)胞中VAM這一亞群的重要地位。

2 VAM在缺血性卒中時影響B(tài)BB的通透性

BBB主要由腦內(nèi)皮細(xì)胞通過緊密連接相關(guān)蛋白組成，而血管周小膠質(zhì)細(xì)胞、腦內(nèi)皮細(xì)胞和周細(xì)胞、星形膠質(zhì)細(xì)胞、神經(jīng)元突起、基底膜共同構(gòu)成NVU[6]，在調(diào)節(jié)微血管通透性、離子梯度、物質(zhì)運(yùn)輸和腦血流動力學(xué)方面發(fā)揮重要的生理作用[9]。急性缺血性腦卒中后，血管內(nèi)皮細(xì)胞功能受損，BBB 通透性增加，活化的血管相關(guān)小膠質(zhì)細(xì)胞具有吞噬清除受損的血管內(nèi)皮細(xì)胞的能力[10]，從而影響B(tài)BB 的結(jié)構(gòu)與功能。小膠質(zhì)細(xì)胞還可以在發(fā)生急性血管損傷時通過延伸突起，堵塞血管滲漏從而恢復(fù)血管完整性[14]。選擇性消融VAM 可以減輕BBB 通透性的改變和腦損傷程度[15]。此外，Kerkhofs 等[16]用CSF1R 抑制劑PLX5622 清除小膠質(zhì)細(xì)胞后發(fā)現(xiàn)，VAM的減少阻止了BBB滲漏，改善了血管認(rèn)知性障礙的預(yù)后。Haruwaka 等[15]以系統(tǒng)性紅斑狼瘡的小鼠疾病模型為研究對象，證實了在系統(tǒng)性炎癥的條件下小膠質(zhì)細(xì)胞和腦血管的共定位，進(jìn)一步確定了VAM的存在。在炎癥早期，小膠質(zhì)細(xì)胞在血管內(nèi)皮細(xì)胞分泌的趨化因子配體5（CCL5）的趨化作用下向血管周邊遷移，VAM 數(shù)量顯著增加?；罨腣AM 在CCL5-CCR5通路的激活，高表達(dá)緊密連接蛋白Claudin5并過向基底膜伸出突起與腦內(nèi)皮細(xì)胞直接接觸從而增加BBB 的完整性。注射CCR5 抑制劑DAPTA 將會延遲疾病早期小膠質(zhì)細(xì)胞向血管遷移和CLaudin5 的表達(dá)，導(dǎo)致VAM 顯著減少和BBB 滲漏增加。隨著炎癥進(jìn)展，小膠質(zhì)細(xì)胞向更為活躍的形態(tài)學(xué)發(fā)生改變并逐漸轉(zhuǎn)化為高表達(dá)CD68 的吞噬表型，由于過度吞噬星形膠質(zhì)細(xì)胞終足從而導(dǎo)致BBB通透性增加，加重了神經(jīng)炎癥水平。研究報道，活化的小膠質(zhì)細(xì)胞還可能通過下調(diào)Claudin5、Occludin、ZO-1等緊密連接相關(guān)蛋白導(dǎo)致BBB受損。這些研究結(jié)果表明，VAM 對于BBB 通透性的改變具有雙向作用。疾病早期VAM對于BBB具有保護(hù)作用；隨著疾病進(jìn)展，吞噬表型小膠質(zhì)細(xì)胞的表達(dá)會導(dǎo)致BBB通透性的增加和腦損傷的產(chǎn)生。

3 小膠質(zhì)細(xì)胞在缺血性卒中時參與調(diào)控腦血流

Bisht 等[17]使用體內(nèi)雙光子成像技術(shù)發(fā)現(xiàn)一類分枝狀CX3CR1+小膠質(zhì)細(xì)胞的胞體和腦毛細(xì)血管存在直接接觸，PLX3397清除小膠質(zhì)細(xì)胞后毛細(xì)血管直徑發(fā)生增加，說明小膠質(zhì)細(xì)胞參與調(diào)節(jié)血管結(jié)構(gòu)。此外，小膠質(zhì)細(xì)胞可以通過受嘌呤激活后由PANX1通道釋放的P2RY12來調(diào)控血管功能，在生理狀態(tài)下維持血管的舒縮反應(yīng)性和腦血流動力學(xué)。Császár 等[12]在研究神經(jīng)血管耦合機(jī)制的小鼠胡須刺激模型中，通過CSF1R抑制劑PLX5622 消融小膠質(zhì)細(xì)胞后發(fā)現(xiàn)小膠質(zhì)細(xì)胞缺失導(dǎo)致對側(cè)皮質(zhì)腦血流反應(yīng)性降低，抑制P2Y12R 可以得到與之一致的結(jié)果。在吸入10%CO22 min 后的血管舒張反應(yīng)中，小動脈和微血管旁小膠質(zhì)細(xì)胞形態(tài)發(fā)生明顯改變、鈣活動顯著增強(qiáng)，小膠質(zhì)細(xì)胞突起和血管周星形膠質(zhì)細(xì)胞終足存在大量接觸，腦內(nèi)皮細(xì)胞、小膠質(zhì)細(xì)胞生成不同嘌呤能產(chǎn)物，而小膠質(zhì)細(xì)胞P2Y12R可以聚集在血管周釋放的ATP。用PLX5622清除小膠質(zhì)細(xì)胞后高碳酸血癥引起的血管舒張顯著減少，這說明小膠質(zhì)細(xì)胞可以調(diào)節(jié)血管的舒縮反應(yīng)[12]。

此外，在頸總動脈閉塞低灌注模型中發(fā)現(xiàn)，病理狀態(tài)下VAM活性顯著增強(qiáng)，突起形態(tài)明顯改變，清除VAM會影響腦血流恢復(fù)。從遺傳學(xué)和藥理學(xué)方面抑制P2Y12R時得到了一致的結(jié)果，這表明小膠質(zhì)細(xì)胞P2Y12R 參與了低灌注后腦血流的恢復(fù)過程[12]。因此，小膠質(zhì)細(xì)胞不僅在生理情況下可以和NVU的腦內(nèi)皮細(xì)胞建立直接的嘌呤能接觸，通過P2Y12R 參與調(diào)節(jié)腦血管的結(jié)構(gòu)與舒縮功能，還可能在腦血管疾病低灌注的病理狀態(tài)下實現(xiàn)對腦血流的調(diào)控。

4 小膠質(zhì)細(xì)胞促進(jìn)缺血性卒中時內(nèi)皮細(xì)胞增殖和血管新生

Zhao 等[18]通過藥理學(xué)和遺傳學(xué)的方法說明了小膠質(zhì)細(xì)胞在生理情況下可以促進(jìn)血管新生，并且在疾病狀態(tài)下小膠質(zhì)細(xì)胞的這種功能尤為突出。研究發(fā)現(xiàn)，缺血性卒中時血管內(nèi)皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）持續(xù)、顯著上調(diào)，與鄰近血管內(nèi)皮細(xì)胞上的受體結(jié)合，引發(fā)血管生成反應(yīng)[19]。在卒中恢復(fù)期給予rhVEGF165 可有效促進(jìn)缺血半暗帶的血管形成和神經(jīng)修復(fù)[20]。此外，有研究表明在缺血性卒中疾病模型的第7～14 天，梗死邊緣區(qū)基質(zhì)金屬蛋白酶-9（matrix metalloproteinase，MMP）-9的上調(diào)與神經(jīng)元重塑、血管再生的標(biāo)記物發(fā)生了共定位。如果在卒中后第7天抑制MMP-9的活性，第14 天時觀察到神經(jīng)血管重塑不良、梗死灶增加[21]，并且MMP-13也有相似的雙向作用[22]。Giulian等[23]認(rèn)為小膠質(zhì)細(xì)胞活化后大量釋放的IL-1β可能在缺血性卒中的恢復(fù)期也發(fā)揮了促血管生成作用。此外，小膠質(zhì)細(xì)胞所分泌的腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子（brain derived neurophic factor，BDNF）等神經(jīng)營養(yǎng)因子可以通過促進(jìn)軸突重塑和神經(jīng)修復(fù)，對神經(jīng)周圍血管的再生間接發(fā)揮積極作用[24]。總之，在缺血性卒中發(fā)生時，抗炎表型的小膠質(zhì)細(xì)胞會大量分泌VEGF、血小板衍生生長因子（platelet derived growth factor，PDGF）、顆粒蛋白前體（progranulin）、MMP-9等具有血管重塑作用的分子，腦室內(nèi)注射抗炎表型小膠質(zhì)細(xì)胞也可以觀察到這些物質(zhì)的明顯上調(diào)和顯著的血管生成反應(yīng)[25]。

5 小結(jié)

小膠質(zhì)細(xì)胞是缺血性卒中發(fā)生時抵御腦損傷的第一道防線。研究結(jié)果表明，CNS疾病早期小膠質(zhì)細(xì)胞對于BBB具有保護(hù)作用。當(dāng)疾病進(jìn)展，吞噬表型小膠質(zhì)細(xì)胞的產(chǎn)生會導(dǎo)致BBB通透性增加和腦損傷。血管相關(guān)的小膠質(zhì)細(xì)胞還可以通過P2Y12R和腦內(nèi)皮細(xì)胞建立直接接觸從而參與疾病狀態(tài)下血管的舒縮和腦血流的調(diào)控，提示通過調(diào)控小膠質(zhì)細(xì)胞和腦內(nèi)皮細(xì)胞相互作用所依賴的關(guān)鍵信號通路可以影響B(tài)BB 通透性和缺血性卒中預(yù)后。隨著在缺血性卒中發(fā)生時，異質(zhì)性活化的VAM對腦血管內(nèi)皮細(xì)胞作用的進(jìn)一步研究，有望在疾病狀態(tài)下對這群異質(zhì)性活化的小膠質(zhì)細(xì)胞實現(xiàn)靶向干預(yù)，為研發(fā)缺血性卒中的治療開拓新思路。