牛病毒性腹瀉病毒全球基因型與亞型流行情況

諶 婕，左之才，才冬杰，*，付星鑫，劉玲利，張義琳，2，茍麗萍，王 婭，任志華，鄧俊良

(1.四川農(nóng)業(yè)大學(xué) 動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，動(dòng)物疫病與人類健康四川省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川 成都611134；2.羅平縣農(nóng)業(yè)農(nóng)村局動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，云南 曲靖655800)

牛病毒性腹瀉(bovine viral diarrhea，BVD)是由牛病毒性腹瀉病毒(Bovineviraldiarrheavirus，BVDV)引起的一種接觸傳染性動(dòng)物傳染病。BVDV屬于黃病毒科(Flaviviridae)瘟病毒屬(Pestivirus)，同屬的病毒還有豬瘟病毒(Classicalswinefevervirus，CSFV)和邊界病病毒(Borderdiseasevirus，BDV)[1]。BVDV根據(jù)抗原性和基因組的差異可分為BVDV-1、BVDV-2和BVDV-3(又稱Hobi-like瘟病毒)等不同的基因型，并且毒株之間無(wú)血清型差異[1]。目前，已報(bào)道的BVDV-1有22個(gè)基因亞型(1a～1v)，BVDV-2有4個(gè)基因亞型(2a～2d)，報(bào)道的BVDV-3型毒株有D32/00、Italy-129/07、Italy-83/10-cp、Italy-83/10-ncp等。大多數(shù)反芻動(dòng)物都可感染BVDV，牛最易感。動(dòng)物感染BVDV后的表現(xiàn)包括免疫抑制和生殖障礙，臨床癥狀主要有發(fā)熱、嗜睡、厭食、腹瀉、潰瘍、出血綜合征等。由于BVDV可以透過(guò)胎盤屏障，因此感染后也可能引起妊娠期母牛子宮內(nèi)感染，出現(xiàn)生殖損失，妊娠早期感染可導(dǎo)致流產(chǎn)、產(chǎn)出畸形胎或木乃伊胎等。根據(jù)BVDV能否引起細(xì)胞病變，可將其生物型分為致細(xì)胞病變型(CP)和非致細(xì)胞病變型(NCP)，兩者皆可導(dǎo)致宿主的急性感染；但是NCP型可在懷孕母牛妊娠期通過(guò)胎盤感染50～120日齡的胎兒，導(dǎo)致產(chǎn)出對(duì)BVDV免疫耐受的持續(xù)感染動(dòng)物(persistent infection，PI)[1]。部分PI動(dòng)物能像正常動(dòng)物一樣生長(zhǎng)發(fā)育至成年，但其生長(zhǎng)發(fā)育狀況和繁殖性能比同齡健康動(dòng)物低很多，且在其生長(zhǎng)過(guò)程中會(huì)向環(huán)境中不斷排出BVDV，是傳染牛群BVDV的病源。因此，查明和清除PI動(dòng)物對(duì)該病的預(yù)防和控制至關(guān)重要。

BVDV廣泛流行于全球的多個(gè)國(guó)家，會(huì)導(dǎo)致牛群生產(chǎn)性能下降，從而造成嚴(yán)重經(jīng)濟(jì)損失。目前全球各國(guó)平均每年因BVDV每頭牛損失約46.5美元，而每頭普通奶牛直接損失比每頭肉牛高出24.85美元。來(lái)自歐洲的數(shù)據(jù)顯示，每年因此造成的損失平均每頭高達(dá)87美元[2]。中國(guó)目前尚未有BVDV感染導(dǎo)致經(jīng)濟(jì)損失的相關(guān)統(tǒng)計(jì)。由于BVDV給養(yǎng)殖業(yè)造成的嚴(yán)重后果，世界動(dòng)物衛(wèi)生組織(Office International Des Epizooties，OIE)將其列為法定報(bào)告的牛傳染病，我國(guó)在進(jìn)出口動(dòng)物檢疫法規(guī)中也已將BVD定為二類傳染病。疫苗免疫對(duì)該病的預(yù)防有所幫助，但由于BVDV的基因變異，導(dǎo)致對(duì)同源株有效的疫苗在預(yù)防變異株上可能失去效果，繼而引起疾病的失控。

1 BVDV基因組結(jié)構(gòu)

BVDV是一種小包膜單股正鏈RNA病毒，NCP型基因組全長(zhǎng)約為12.3 kb，CP型由于存在基因組重復(fù)和RNA插入等原因，其基因組全長(zhǎng)和具體毒株有關(guān)。BVDV基因組結(jié)構(gòu)包含5′端非編碼區(qū)(5′ untranslated region，5′UTR)、開(kāi)放閱讀框架區(qū)(open reading frame，ORF)和3′端非編碼區(qū)(3′ untranslated region，3′UTR)3個(gè)部分[3]，如圖1所示。BVDV 5′UTR區(qū)末端無(wú)甲基化的“帽子”結(jié)構(gòu)，具有保守穩(wěn)定的二級(jí)結(jié)構(gòu)，在各BVDV毒株間具有高度保守性，也是瘟病毒最保守的基因，因此可根據(jù)其序列合成引物，進(jìn)行BVDV的檢測(cè)和分型[3]。

ORF編碼的是一個(gè)大多聚蛋白，與病毒抗原性、復(fù)制能力的強(qiáng)弱、是否致細(xì)胞病變有關(guān)[4]，具體編碼的蛋白質(zhì)如圖1所示。Npro蛋白負(fù)責(zé)產(chǎn)生自身C末端的非結(jié)構(gòu)性病毒自蛋白酶；核衣殼蛋白C和3個(gè)包膜糖蛋白Erns、E1、E2分別代表BVDV的結(jié)構(gòu)蛋白。C、Erns、E1、E2是高度可變的，且在免疫上占優(yōu)勢(shì)的糖蛋白是中和抗體的主要靶點(diǎn)[4]；p7、NS2負(fù)責(zé)產(chǎn)生蛋白酶，可用于NS2和NS3之間切割肽鍵；NS3蛋白同時(shí)具有NTPase活性、絲氨酸蛋白酶活性和RNA解旋酶活性；NS4a是一種輔助蛋白，能協(xié)助NS3發(fā)揮作用；NS4b是膜整合蛋白，可與高爾基體接觸結(jié)合組成部分病毒復(fù)合體；NS5a是一種親水蛋白；NS5b[4]是RNA聚合酶。

圖1 BVDV基因組結(jié)構(gòu)示意圖

2 全球BVDV亞型分布統(tǒng)計(jì)

查閱大量國(guó)內(nèi)外文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)，不同國(guó)家占據(jù)主導(dǎo)地位的BVDV亞型不完全相同。部分國(guó)家的BVDV基因亞型統(tǒng)計(jì)結(jié)果如表1、表2所示。BVDV-1b是世界范圍內(nèi)流行的主要基因亞型，其次是BVDV-1a和BVDV-1c。從各大洲來(lái)看，BVDV-1b是美洲、亞洲和歐洲流行的主要基因亞型。BVDV-1毒株在歐洲和亞洲有21種基因亞型出現(xiàn)，而在美洲、澳洲和非洲卻僅有7種基因亞型出現(xiàn)，相比而言，BVDV-1毒株在美洲、澳洲和非洲比在歐洲和亞洲的變異程度更低。BVDV-2最初是在加拿大和美國(guó)被發(fā)現(xiàn)的，曾在20世紀(jì)90年代有過(guò)較高暴發(fā)率[2，5]，且2001—2021年此基因型在當(dāng)?shù)氐牧餍星闆r并沒(méi)有明顯變化[6]。

表1 BVDV在美洲、澳洲、非洲和歐洲的基因亞型分布

表2 BVDV在亞洲的基因亞型分布

Polak等[7]在2004年對(duì)波蘭流行的BVDV首次進(jìn)行分型，結(jié)果表明BVDV-1b是波蘭流行最廣的基因亞型，其次是BVDV-1d，無(wú)BVDV-1a流行。在1996年烏拉圭已發(fā)現(xiàn)BVDV流行，2000—2001年BVDV在牛群上的流行率為69%，但當(dāng)時(shí)并未對(duì)烏拉圭的BVDV毒株進(jìn)行基因亞型劃分[8]，直到2014年才首次劃分其流行的BVDV毒株基因亞型[9]。印度從2000年開(kāi)始對(duì)BVDV進(jìn)行血清監(jiān)測(cè)[10-11]，蒙古國(guó)在1980年首次診斷出BVDV，但當(dāng)時(shí)并未進(jìn)行基因亞型的劃分，直到2013年才正式有基因亞型分型相關(guān)數(shù)據(jù)報(bào)道[12]。

3 全球BVDV基因亞型流行情況

我國(guó)最早于1980年從引入歐洲種牛的農(nóng)場(chǎng)中分離出BVDV-1b亞型，此后的一些研究數(shù)據(jù)也表明，1b亞型是我國(guó)主要流行的基因亞型之一[31，47]。2005—2015年，我國(guó)主要流行的基因亞型包括1a、1b、1m和2a，其中1b是我國(guó)流行分布最廣的基因亞型，其流行地區(qū)包括陜西、四川、吉林、新疆、廣西、北京、寧夏等地；1a基因亞型主要在陜西、山東和北京等地流行[47]；1m亞型曾在四川西昌的臨床健康牛中分離到，證明感染BVDV-1m亞型的?？赡懿槐憩F(xiàn)明顯臨床癥狀[38]。2009年，林燕清[39]對(duì)分離到的XJ-04株進(jìn)行遺傳發(fā)育分析，證明其屬于2a亞型，這也是BVDV-2型在我國(guó)的首次報(bào)道。2008年，新疆地區(qū)主要流行的基因亞型是1b。王國(guó)超[48]的研究結(jié)果表明，新疆地區(qū)同時(shí)存在BVDV-1型和BVDV-2型感染，這可能是北疆地區(qū)規(guī)?；B(yǎng)殖的興起、活體貿(mào)易和頻繁引種引起的。2017—2021年我國(guó)主要流行的基因亞型包括1b、1a、1m、1q、1c和2a[40-41]。2019年，四川省邛崍市和廣安市牛場(chǎng)發(fā)生腹瀉病例，Tian等[34]利用抗原ELISA試劑盒檢測(cè)了20份血液樣品，結(jié)果陽(yáng)性檢出率為10%，并分離到一株1b和一種新基因亞型毒株“1v”。2007—2019年，鄧宇等[38]對(duì)我國(guó)多個(gè)省份的田間豬樣品檢測(cè)，證明我國(guó)豬群中流行1a、1b和1m亞型。2013年，在我國(guó)西部地區(qū)雙峰駝群中發(fā)現(xiàn)存在BVDV感染，主要流行的基因亞型包括1a、1b、1c、1m、1o、1p和1q，這也是我國(guó)首次為中國(guó)西部雙峰駝自然感染高度分化的BVDV-1提供分子生物學(xué)證據(jù)[49]。

Olafson等[50]于1946年在紐約首次發(fā)現(xiàn)BVDV，當(dāng)時(shí)只被當(dāng)作一種導(dǎo)致牛發(fā)生腹瀉的傳染病報(bào)道。在1989年之前，已知的BVDV基因型只有一種，與如今發(fā)現(xiàn)的基因型相比，這種基因型顯示出明顯的遺傳差異性，因此Ridpath等[51]在1994年引入專業(yè)術(shù)語(yǔ)BVDV基因型1(舊)和BVDV基因型2(新)。BVDV在意大利主要流行的基因亞型為1b，同時(shí)意大利也存在2b亞型的流行[5]。BVDV在美國(guó)存在的基因亞型較少，僅有1a、1b和2a 3種，其中1b亞型最為流行[6，18]。加拿大對(duì)BVDV根除效果較好，僅存少量1a、1b和2a亞型的流行[2]。對(duì)2000—2020年的數(shù)據(jù)進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，BVDV-2在許多歐洲國(guó)家都存在，包括德國(guó)、法國(guó)、英國(guó)和奧地利，而進(jìn)一步的研究也揭示了BVDV-2更為廣泛的分布。BVDV-2a是BVDV-2在各大洲分布最廣的基因型，而B(niǎo)VDV-2c僅在歐洲和美洲發(fā)現(xiàn)。自2000年以來(lái)，在美國(guó)牛場(chǎng)由BVDV-2型引起的不同日齡牛發(fā)生急性BVD病例日益增多，且不斷能從病料中分離得到高毒力BVDV-2毒株[38]。截止2013年，發(fā)現(xiàn)的大部分BVDV-3都是從源自巴西的胎牛血清中分離出來(lái)的，如2004年首次報(bào)告的BVDV-3就是從巴西進(jìn)口的胎牛血清中分離出的，且后續(xù)的研究結(jié)果也表明，在歐洲測(cè)試的胎牛血清有30%以上均被來(lái)自南美的胎牛血清批次污染，推斷該病原體可能廣泛存在于南美的牛群中[52]。在東南亞和歐洲也有BVDV-3的相關(guān)報(bào)告，表明該病毒的流行不局限于南美洲。如奧地利在2009—2014年進(jìn)行的流行病學(xué)調(diào)查報(bào)告中也有BVDV-3基因型的出現(xiàn)[23]。由于各國(guó)對(duì)胎牛血清的需求日益增加，可能導(dǎo)致該地區(qū)感染源自胎牛血清的BVDV-3。如今，BVDV-3的流行日益廣泛，各國(guó)不斷有BVDV-3的相關(guān)報(bào)道出現(xiàn)。迄今為止，BVDV-3主要流行于阿根廷、巴西、美國(guó)、澳大利亞、奧地利、愛(ài)爾蘭、西班牙、英國(guó)和印度，其中印度的報(bào)道最多。

4 總結(jié)與展望

截止目前BVDV的基因型包括BVDV-1(1a-1v)、BVDV-2(2a-2d)、BVDV-3，有如D32/00、Italy-129/07、Italy-83/10-cp、Italy-83/10-ncp等Hobi-like毒株，但由于BVDV基因組的高度可變結(jié)構(gòu)，未來(lái)極大可能會(huì)有更多的基因亞型被報(bào)道。本文收集了全球已被發(fā)現(xiàn)的基因亞型種類和數(shù)量并加以總結(jié)分析，可以更直觀地看到BVDV的各個(gè)基因亞型在全球各地的分布。本文分析發(fā)現(xiàn)，不同地區(qū)BVDV流行株間存在一定差異，如BVDV-1m、1n、1o、1p、1q和1v這幾種基因亞型迄今為止只在亞洲發(fā)現(xiàn)，但BVDV-1e、1g、1h、1j、1l、1r、1s、1t和BVDV-2c這幾種基因亞型在亞洲各國(guó)卻未見(jiàn)報(bào)道，這也表明BVDV在適應(yīng)環(huán)境的過(guò)程中表現(xiàn)出高度突變頻率。BVDV的這種變異主要源于以下2個(gè)過(guò)程，一個(gè)是RNA聚合酶在聚合底物時(shí)發(fā)生錯(cuò)誤導(dǎo)致點(diǎn)突變并積累，另一個(gè)是同源與非同源的RNA重組[53]。BVDV每復(fù)制一個(gè)周期，就有一個(gè)點(diǎn)突變被引入到BVDV基因組中[53]。BVDV 5′UTR序列的平均進(jìn)化率為一年9.3×10-3個(gè)置換位點(diǎn)，此外，5′UTR和E1-E2區(qū)域的取代率分別為一年5.9×10-4和1.26×10-3個(gè)位點(diǎn)[53]。BVDV基因亞型的不斷增多是點(diǎn)突變隨時(shí)間積累的結(jié)果，也被稱為遺傳漂變。由于目前國(guó)際上尚未建立BVDV的標(biāo)準(zhǔn)化和普遍接受的遺傳分型系統(tǒng)，對(duì)同一段基因的不同區(qū)域或使用不同方法進(jìn)行分析可能導(dǎo)致分析結(jié)果出現(xiàn)紊亂，因此某些毒株基因亞型的劃分可能存在矛盾。制定國(guó)際統(tǒng)一的BVDV基因亞型鑒定規(guī)則更有利于減少毒株分型的不一致性，從而更好地防控BVDV。