固相萃取/超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定白術(shù)中井岡霉素和丙環(huán)唑殘留量

張春榮，郭 鈐，孔麗萍，吳園園，林 琴，許振嵐，湯 濤

(浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全與營養(yǎng)研究所/農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全危害因子與風(fēng)險防控國家重點實驗室/農(nóng)業(yè)農(nóng)村部農(nóng)藥殘留檢測重點實驗室，浙江 杭州 310021)

白術(shù)為菊科蒼術(shù)屬多年生草本植物，以根莖部位入藥，具有健脾益氣、燥濕利水、止汗、安胎的功效[1]。白術(shù)在全國分布廣泛，主要集中在浙江、安徽等省種植，其中浙江白術(shù)產(chǎn)量占全國的 1/2 以上，是浙江地區(qū)主產(chǎn)的中藥材，為浙八味之一[2]。隨著白術(shù)種植年限的延長，其病蟲害發(fā)生日趨嚴(yán)重[3-4]，但白術(shù)生產(chǎn)中“無藥可用”及缺少相應(yīng)的殘留限量標(biāo)準(zhǔn)的問題較為突出，我國目前登記在白術(shù)上使用的農(nóng)藥品種僅10個[5]，且僅在國標(biāo)GB2763—2021[6]中制定了井岡霉素和二嗪磷的最大殘留限量值(MRL)，因此，加快開展白術(shù)上農(nóng)藥殘留評估及登記研究工作對保障其安全生產(chǎn)具有重要意義，而精準(zhǔn)的農(nóng)藥檢測方法是這項工作開展的前提。

井岡霉素主要活性物質(zhì)為井岡霉素A，具有良好的防治植物病害的作用，早期主要用于防治水稻紋枯病[7]，近些年研究表明井岡霉素對白術(shù)斑枯病、立枯病和白絹病亦具有較好的防治效果[7-8]，并已在白術(shù)使用上取得登記[5]，同時制定了白術(shù)中井岡霉素的最大允許殘留限量(MRL)為0.5 mg·kg-1[6]。丙環(huán)唑作為內(nèi)吸性三唑類殺菌劑，通過影響甾醇的生物合成，破壞病原菌的細胞膜功能，最終導(dǎo)致細胞死亡，從而起到殺菌、防病和治病的功效[9]。目前，丙環(huán)唑暫未在白術(shù)上取得登記，但其對白術(shù)白絹病和根腐病展現(xiàn)出了較好的防治效果[10-11]，后期有望在白術(shù)上登記使用。

關(guān)于井岡霉素和丙環(huán)唑在水稻、玉米、小麥等作物中的檢測方法已有較多報道[9，12-20]，但關(guān)于其在中藥材白術(shù)中的殘留檢測鮮有報道。屈浩然等[21]利用 GC-MS/MS 建立了白術(shù)中包括丙環(huán)唑在內(nèi)的農(nóng)藥多殘留檢測的方法，采用C18、PSA 以及石墨化炭黑材料的分散固相萃取法凈化，前處理步驟較多，部分農(nóng)藥回收率較低。凌淑萍等[7]建立了白術(shù)中檢測井岡霉素的高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法，該方法確立井岡霉素在白術(shù)中的檢測定量限(LOQ)為0.05 mg·kg-1。相比常規(guī)農(nóng)作物，中草藥樣品往往富含揮發(fā)油、多糖和蛋白質(zhì)等活性物質(zhì)，對其中待測目標(biāo)物的提取及凈化要求更高，檢測方法必須綜合考慮其高效性、通用性、靈敏性與專屬性等[22]。本研究擬探索建立井岡霉素和丙環(huán)唑在白術(shù)中的殘留分析方法，并選取中國4個白術(shù)主產(chǎn)區(qū)進行了田間規(guī)范殘留試驗，通過對實際樣品的檢測來驗證方法的可靠性及明確井岡霉素和丙環(huán)唑在白術(shù)中的殘留水平，以期為其在白術(shù)上科學(xué)合理施用提供理論依據(jù)，同時也為其在白術(shù)上的登記提供數(shù)據(jù)支撐。

1 材料與方法

1.1 儀器與試材

UPLC-30A/LCMS-8050超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀(日本島津公司)、AB104-S電子天平(0.000 1 g，梅特勒-托利多國際貿(mào)易(上海)有限公司)、SPN402F型電子天平(0.01 g，梅特勒-托利多(常州)測量技術(shù)有限公司)、TD5A-WS臺式低速大容量離心機(金壇市金南儀器制造有限公司)、IKA T18分散機(德國IKA實驗室)、W201B型數(shù)控恒溫水浴鍋(上海申勝生物技術(shù)有限公司)、旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器R-201(上海申勝生物技術(shù)有限公司)、SHZ-D(Ⅲ)循環(huán)水式真空泵(鞏義市子華儀器責(zé)任公司)、12管固相萃取裝置(美國SUPELCL公司)、DHG9070A鼓風(fēng)電熱恒溫干燥箱(上海精宏實驗設(shè)備有限公司)、DJ-02粉碎機-切片機(上海淀久中藥機械制造有限公司)等。

99.1%井岡霉素A標(biāo)準(zhǔn)品(FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation)、99.0%丙環(huán)唑標(biāo)準(zhǔn)品(Dr.Ehrenstorfer GmbH)、甲酸(色譜純，美國ACS恩科化學(xué)試劑公司)、乙腈(色譜純，德國默克公司)、甲醇(分析純，上海凌峰化學(xué)試劑有限公司)、弗羅里硅土(Florisil)、C18粉末、N-丙基乙二胺(PSA)、石墨化炭黑(GCB)(農(nóng)殘級，天津博納艾杰爾科技有限公司)、Oasis HLB固相萃取小柱(200 mg，6 mL，美國Waters公司)、Cleanert AQ C18固相萃取小柱(500 mg，6 mL，博納艾杰爾科技有限公司)、屈臣氏飲用純凈水(廣東屈臣氏食品飲料有限公司)等。

1.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制及標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

準(zhǔn)確稱取99.1%的井岡霉素A標(biāo)準(zhǔn)品0.010 1 g于50 mL容量瓶中，用色譜純甲醇配成濃度為200 mg·L-1的標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液。然后分別用乙腈/水(2∶8，V/V)及白術(shù)空白基質(zhì)待測液將井岡霉素標(biāo)準(zhǔn)儲備液逐級稀釋成質(zhì)量濃度為 0.000 1、0.000 5、0.001、0.005、0.01、0.05、0.1 mg·L-1的標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。

準(zhǔn)確稱取99.0%的丙環(huán)唑標(biāo)準(zhǔn)品0.010 4 g于50 mL容量瓶中，用色譜純甲醇配成濃度為206 mg·L-1的標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液。然后分別用乙腈/水(8∶2，V/V)及白術(shù)空白基質(zhì)待測液將丙環(huán)唑標(biāo)準(zhǔn)儲備液逐級稀釋成質(zhì)量濃度為 0.000 1、0.000 5、0.001、0.005、0.01、0.05、0.1 mg·L-1的標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。

采用1.4節(jié)中的色譜條件進行檢測，每檔濃度進樣3次，獲得色譜響應(yīng)值，以濃度-峰面積繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線并按以下公式(1)計算基質(zhì)效應(yīng)ME。ME絕對值在10%以內(nèi)則基質(zhì)效應(yīng)可忽略不計，ME絕對值大于10%則表明存在一定的基質(zhì)效應(yīng)[23]。

ME(%)=(Kb-Ka)/Ka×100。

(1)

式中：Kb—基質(zhì)匹配曲線斜率，Ka—純?nèi)軇?biāo)準(zhǔn)曲線斜率。

1.3 樣品前處理

1.3.1 提取

稱取白術(shù)鮮樣樣品5.0 g(干樣2.0 g，精確至0.01 g)于50 mL離心管中，加入25 mL 甲醇/水(9∶1，V/V)溶液，高速勻漿1 min，于40 00 r·min-1下離心5 min，上清液轉(zhuǎn)入具塞量筒中；樣品殘渣再加入20 mL 甲醇/水(9∶1，V/V)溶液復(fù)提1次，合并上清液，以甲醇/水(9∶1，V/V)定容至50 mL，混勻。取10 mL提取液2份(分別用于測定井岡霉素和丙環(huán)唑)，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器40 ℃下減壓濃縮后待凈化。

1.3.2 凈化

井岡霉素：先用5 mL甲醇、5 mL水活化Oasis HLB固相萃取小柱，將1.3.1節(jié)待凈化提取液用6 mL純凈水分2次溶解上樣，收集所有淋出液，淋出液用乙腈/水(5∶5，V/V)定容至10 mL，0.22 μm濾膜過濾，待測。

丙環(huán)唑：先用5 mL甲醇、5 mL水活化Cleanert AQ C18固相萃取小柱，將待凈化液樣品用5 mL甲醇/水(4∶6，V/V)分2次溶解上樣，3 mL甲醇/水(7∶3，V/V)淋洗，5 mL乙腈/水(8∶2，V/V)洗脫，收集洗脫液用乙腈/水(8∶2，V/V)定容至10 mL，0.22 μm濾膜過濾，待測。

1.4 儀器分析

1.4.1 色譜條件

色譜柱：Waters acquity UPLC?HSS T3(1.8 μm，2.1 mm×100 mm)；流速：0.25 mL·min-1；柱溫：40 ℃；進樣體積：2.0 μL；梯度洗脫程序1(井岡霉素)：A 為水，B為乙腈；0～1 min，30% B；1.0～1.5 min，30% B～90% B；1.5～3 min，90% B；3～3.5 min，90% B～30% B；3.5～6 min，30% B；梯度洗脫程序2(丙環(huán)唑)：A 為0.1%甲酸水，B為乙腈；0～1 min，50% B；1.0～1.5 min，50% B～90% B；1.5～4 min，90% B；4～4.5 min，90% B～50% B；4.5～7 min，50% B。

1.4.2 質(zhì)譜條件

電離方式：ESI+，采用MRM多反應(yīng)監(jiān)測；Interface電壓：4.0 kV；霧化氣流速：3.0 L·min-1；干燥氣流速：10.0 L·min-1；加熱氣流速：10.0 L·min-1；Interface溫度：300 ℃；DL溫度：250 ℃；Heat Block溫度：400 ℃。井岡霉素和丙環(huán)唑的質(zhì)譜參數(shù)見表1。

表1 井岡霉素和丙環(huán)唑的質(zhì)譜條件參數(shù)

1.5 田間試驗及樣品制備

2019年在浙江、安徽、湖南和河北4 地對白術(shù)田施用 24%井岡·丙環(huán)唑可濕性粉劑，田間試驗設(shè)置1個處理小區(qū)和1個對照小區(qū)，小區(qū)面積 100 m2，有效成分用藥量為 162 g·hm-2，施藥2次，施藥間隔期10 d，每667 m2用水量為30 L。樣品采集時間為末次施藥后28、35 d。樣品運回實驗室后，用流動的自來水洗凈備用。鮮樣樣品用不銹鋼刀具切片后粉碎機粉碎；干樣樣品用不銹鋼刀具切片后65 ℃連續(xù)烘干48 h，然后用粉碎機磨成粉狀。制備后的樣品裝入封口袋，置于冷凍(-18 ℃)條件下保存。

2 結(jié)果與討論

2.1 提取方法的選擇

選取高速勻漿和振蕩作為提取方法篩選，在白術(shù)鮮樣中井岡霉素和丙環(huán)唑的添加水平為2.0 mg·kg-1，3次重復(fù)，用甲醇/水(9∶1，V/V)25 mL與20 mL分2次提取，稀釋并過0.22 μm濾膜后進樣檢測，分別計算井岡霉素和丙環(huán)唑在2次提取液中的提取回收率。結(jié)果表明(圖1)，在勻漿提取方式下，提取率分別為96%(第1次為82%，第2次為14%)和97%(第1次為80%，第2次為17%)；在振蕩提取方式下，井岡霉素和丙環(huán)唑的提取率分別為70%(第1次為58%，第2次為12%)和75%(第1次為65%，第2次為10%)。因此本研究采用高速勻漿方式提取白術(shù)中的井岡霉素和丙環(huán)唑。

圖1 不同提取方式對井岡霉素和丙環(huán)唑的提取效率

2.2 凈化方法的選擇

白術(shù)基質(zhì)復(fù)雜，含多種生物活性物質(zhì)，主要有氨基酸、揮發(fā)油、內(nèi)酯類成分、苷類成分、多糖等[24]，因此對樣品有效凈化以去除或降低基質(zhì)效應(yīng)對定量的影響是關(guān)鍵步驟。本研究考察了不同吸附劑和SPE凈化小柱對白術(shù)基質(zhì)中井岡霉素和丙環(huán)唑的凈化效果。

首先考察了吸附劑Florisil、C18、PSA和GCB對溶劑中井岡霉素和丙環(huán)唑的吸附作用，結(jié)果表明，F(xiàn)lorisil對井岡霉素的吸附作用最強，井岡霉素回收率僅為14%～17%，其次為C18和PSA，回收率分別為47%～67%和69%～77%，GCB對井岡霉素的吸附作用最弱，回收率為79%～83%；4種吸附劑對丙環(huán)唑的吸附作用較弱，丙環(huán)唑的回收率在82%～104%。

根據(jù)上述結(jié)果，進一步考察了GCB對白術(shù)提取液中井岡霉素以及4種吸附劑混配對丙環(huán)唑的凈化效果和回收率，結(jié)果(圖2)顯示，不同量的GCB(20～100 mg)均不足以去除白術(shù)提取液中的復(fù)雜干擾物，凈化效果較差，且井岡霉素回收率較低(24%～32%)；Florisil(50 mg)、C18(50 mg)、PSA(20 mg)和GCB(20 mg)4種吸附劑的二元、三元和四元混配對白術(shù)提取液的凈化效果亦不理想，凈化后對丙環(huán)唑存在較強的基質(zhì)抑制效應(yīng)(85%)，回收率亦較低(5.8%～49%)。因此，該4種吸附劑不宜作為白術(shù)樣品中井岡霉素和丙環(huán)唑的凈化材料。

基于此，研究了適用于酸堿、中性農(nóng)藥的Oasis HLB和適用于非極性、弱極性以及中等極性農(nóng)藥的Cleanert AQ C18固相萃取小柱對白術(shù)提取液的凈化效果和回收率。白術(shù)基質(zhì)中加入井岡霉素和丙環(huán)唑標(biāo)樣后，按1.3.1節(jié)方法處理后以6 mL純水溶解上樣，隨即收集淋出液過膜后檢測。結(jié)果(圖2)表明，Oasis HLB 和Cleanert AQ C18對白術(shù)提取液均有較好的凈化效果，但回收率有顯著差異，Oasis HLB小柱對井岡霉素的回收率較高(72%～86%)，Cleanert AQ C18小柱對井岡霉素的回收率則較低(35%～44%)。通過調(diào)節(jié)上樣液、淋洗液以及洗脫液的溶劑組成和比例，Cleanert AQ C18對丙環(huán)唑有較好的凈化效果且回收率較高(>88%)，而Oasis HLB對丙環(huán)唑的回收率則較低(<60%)。綜上，本研究選擇Oasis HLB固相萃取小柱凈化井岡霉素，Cleanert AQ C18固相萃取小柱凈化丙環(huán)唑。

圖2 不同吸附劑及固相萃取小柱對井岡霉素和丙環(huán)唑回收率的影響

2.3 色譜柱及流動相的選擇

白術(shù)鮮樣基質(zhì)中井岡霉素和丙環(huán)唑的添加水平為 0.1 mg·kg-1，分別考察了甲醇-水、乙腈-水、甲醇-0.1%甲酸水、乙腈-0.1%甲酸水、乙腈-2 mmol·L-1乙酸水作為流動相體系時，Waters的Hilic和HSS T3色譜柱對井岡霉素和丙環(huán)唑的分離效果和響應(yīng)強度。結(jié)果表明，井岡霉素在Hilic和HSS T3色譜柱上保留時間及峰型均較好，在乙腈-水體系中靈敏度最高；丙環(huán)唑在Hilic柱上保留時間較短，在5種流動相體系下均難以獲得良好的峰形，而在HSS T3色譜柱上，采用乙腈-0.1%甲酸水體系能獲得較好的峰型和靈敏度。綜合考慮，本研究選取HSS T3色譜柱分離待測物，乙腈-水和乙腈-0.1%甲酸水分別作為井岡霉素和丙環(huán)唑進樣檢測的流動相。

2.4 質(zhì)譜條件的優(yōu)化

使用1.0 mg·L-1的井岡霉素和丙環(huán)唑標(biāo)準(zhǔn)溶液，在連接兩通的條件下，流動相組成為乙腈/水(70∶30，V/V)，流速0.25 mL·min-1，進樣體積1 μL，在100～600m/z掃描范圍分別用正負離子模式(ESI+、ESI-)進行母離子全掃描。結(jié)果表明：井岡霉素和丙環(huán)唑在ESI+模式下的電離效果均最佳，信號強度均明顯高于ESI-模式，井岡霉素和丙環(huán)唑的[M+H]+準(zhǔn)分子離子峰分別為m/z498.1和m/z341.9。再分別對其進行二級質(zhì)譜掃描得到碎片離子，結(jié)果見圖3，井岡霉素選擇m/z498.1/178.2 和m/z498.1/124.3 分別為定量和定性離子對，丙環(huán)唑選擇m/z341.9/159.0 和m/z341.9/69.1 分別為定量和定性離子對。進而逐步優(yōu)化各離子對的Q1、Q3偏轉(zhuǎn)電壓和碰撞能量等參數(shù)，獲得測定井岡霉素和丙環(huán)唑的最佳質(zhì)譜條件。

圖3 井岡霉素和丙環(huán)唑的二級離子質(zhì)譜圖

2.5 方法的線性及基質(zhì)效應(yīng)分析

基質(zhì)效應(yīng)(matrix effect，ME)是指基質(zhì)成分和目標(biāo)分析物以外的其他成分對待測物測定值的影響，基質(zhì)主要影響目標(biāo)化合物的離子化，使其響應(yīng)信號增強或減弱，從而形成基質(zhì)增強或抑制效應(yīng)[25]。本研究采用基質(zhì)提取凈化液配制井岡霉素和丙環(huán)唑的系列基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)工作液，與相同濃度系列的溶劑標(biāo)準(zhǔn)工作液在同一儀器條件下進樣并繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)1.2節(jié)公式計算并評價基質(zhì)效應(yīng)。結(jié)果表明：在0.000 1～0.1 mg·L-1范圍內(nèi)，井岡霉素和丙環(huán)唑在溶劑及基質(zhì)提取液中均具有良好的線性關(guān)系(圖4和圖5)，R2≥0.999 6；井岡霉素在白術(shù)鮮樣和干樣中的ME分別為-62.2%、-66.3%，表明基質(zhì)成分對井岡霉素定量影響較大；丙環(huán)唑在白術(shù)鮮樣和干樣中的ME分別為-1.1%、-5.8%，其絕對值均小于10%，基質(zhì)效應(yīng)較小。因此本研究采用基質(zhì)標(biāo)匹配外標(biāo)法對井岡霉素進行定量、溶劑標(biāo)匹配外標(biāo)法對丙環(huán)唑進行定量。

圖4 井岡霉素A在溶劑和白術(shù)基質(zhì)提取液中的標(biāo)準(zhǔn)曲線

圖5 丙環(huán)唑在溶劑和白術(shù)基質(zhì)提取液中的標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.6 方法的準(zhǔn)確性和靈敏度

采用白術(shù)鮮樣和干樣空白樣品進行加標(biāo)回收率實驗，井岡霉素按照0.01、0.5 和 5.0 mg·kg-1，丙環(huán)唑按照0.005、0.1和1.0 mg·kg-1水平加標(biāo)，每個加標(biāo)水平重復(fù) 5 次。結(jié)果(表2)表明：在白術(shù)鮮樣和干樣中，井岡霉素回收率為72.4%～85.8%，RSD為 0.89%～6.2%，丙環(huán)唑回收率為88.1%～98.9%，RSD為1.4%～4.8%，該方法的準(zhǔn)確度與精密度符合農(nóng)藥殘留檢測的要求[26]。

表2 井岡霉素和丙環(huán)唑在白術(shù)空白樣品中的加標(biāo)回收率及相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(n=5)

井岡霉素和丙環(huán)唑的最小檢測量均為2.0×10-13g，定量限(LOQ)分別為0.01 mg·kg-1和0.005 mg·kg-1。與已建立的白術(shù)上井岡霉素和丙環(huán)唑殘留檢測分析方法[7，21]相比，本研究所建方法靈敏度及凈化效果較好，且不容易對儀器造成污染。

2.7 該方法在實際樣品殘留檢測中應(yīng)用

2019年在浙江省、湖南省、安徽省和河北省4個白術(shù)主產(chǎn)區(qū)，開展了24%井岡·丙環(huán)唑可濕性粉劑在白術(shù)上的田間規(guī)范殘留試驗，并采用本研究所建立的檢測方法對試驗樣品進行檢測。結(jié)果(表3)表明：24%井岡·丙環(huán)唑可濕性粉劑施藥2次，施藥間隔期10 d，距最后一次施藥后28 d和35 d，井岡霉素在白術(shù)鮮樣和干樣中均未檢出(殘留量<0.010 mg·kg-1)，丙環(huán)唑在白術(shù)鮮樣、干樣中的檢出范圍分別為0.005～0.046 mg·kg-1、0.010～0.12 mg·kg-1。4個點白術(shù)中井岡霉素的檢測值均低于我國制定的井岡霉素在白術(shù)中MRL值。參照我國制定的丙環(huán)唑在人參中(0.1 mg·kg-1)的限量要求，所測白術(shù)鮮樣樣品檢出值均小于國家限量標(biāo)準(zhǔn)。

表3 井岡霉素和丙環(huán)唑在白術(shù)中的殘留量

3 結(jié)論

本研究采用甲醇/水(9∶1，V/V)同步提取，Oasis HLB和Cleanert AQ C18固相萃取小柱分別凈化，HSS T3色譜柱分離及正離子模式和多反應(yīng)監(jiān)測模式，建立了白術(shù)鮮樣及干樣中井岡霉素和丙環(huán)唑殘留的超高效液相色譜-串聯(lián)三重四極桿質(zhì)譜檢測方法。在優(yōu)化條件下，該檢測方法在 0.0001～0.1 mg·L-1范圍內(nèi)線性良好，R2均大于 0.999 6；井岡霉素按照0.01、0.5 和 5.0 mg·kg-1，丙環(huán)唑按照0.005、0.1 和 1.0 mg·kg-1水平加標(biāo)，井岡霉素在白術(shù)鮮樣及干樣中的回收率為72.4%～85.8%，RSD為0.89%～6.2%，丙環(huán)唑回收率為88.1%～98.9%，RSD為 1.4%～4.8%，井岡霉素和丙環(huán)唑在儀器上的最小檢出量均為2.0×10-13g，最低定量限分別為0.01 mg·kg-1和0.005 mg·kg-1，方法的靈敏度較好。通過對實際樣品的檢測，表明該方法操作簡單，重復(fù)性好，準(zhǔn)確度、精密度及檢出限均可滿足農(nóng)藥殘留分析要求。