糞腸球菌感染小鼠單核巨噬細胞外泌體分泌量及其在人源性腸上皮細胞中的傳遞情況觀察

蔡瀟瀟，鮑欣欣，徐純子，李天來，王秋紅，李海波

糞腸球菌感染小鼠單核巨噬細胞外泌體分泌量及其在人源性腸上皮細胞中的傳遞情況觀察

蔡瀟瀟1，2，鮑欣欣1，徐純子1，李天來1，王秋紅1，2，李海波1，2

1 南通市婦幼保健院檢驗科，江蘇南通 226018；2 南通市婦幼保健院生殖與遺傳研究所

觀察糞腸球菌OG1RF感染小鼠單核巨噬細胞raw264.7的外泌體分泌量，進一步觀察OG1RF感染的raw264.7細胞分泌的外泌體在人源性腸上皮細胞NCM460中的傳遞情況。取raw264.7細胞分為A、B兩組。其中A組加入OG1RF感染1 h，后加入DMEM完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)；B組為對照組，不進行處理。培養(yǎng)24 h時，收集細胞上清液，提取鑒定外泌體，BCA法測算兩組外泌體含量，觀察外泌體分泌情況。取raw264.7細胞，5×105/孔的密度鋪至6孔板過夜后，分為1、2、3組，三組加入OG1RF感染1 h，然后1、2組分別加入DMSO + 10 μmol/L的外泌體抑制劑GW4869、DMSO + 20 μmol/L GW4869，對照組加入同體積DMSO，培養(yǎng)24 h時測算三組上清液外泌體含量，觀察外泌體分泌情況。取A組提純后外泌體，加入4 μmol/L的PKH67標記，將標記后外泌體與人源性腸上皮細胞NCM460細胞共同培養(yǎng)3 h，電鏡下觀察NCM460細胞中的外泌體情況，觀察外泌體在NCM460細胞中的傳遞情況。培養(yǎng)24 h時，A、B組細胞上清液外泌體含量分別為（0.783 ± 0.07）、（0.123 ± 0.056）μg，二者比較，<0.05；1、2、3組細胞上清液外泌體含量分別為（0.592 ± 0.06）、（0.488 ± 0.09）、（0.778 ± 0.07）μg，與3組比較，1、2組細胞上清液外泌體含量低（均<0.05）；與1組比較，2組細胞上清液外泌體含量低（<0.05）。OG1RF感染raw264.7細胞后分泌的外泌體可進入NCM460細胞質中。OG1RF感染可促進raw264.7細胞外泌體的分泌，該作用可被GW4869抑制。OG1RF感染后raw264.7細胞分泌的外泌體可進入NCM460細胞中。

外泌體；巨噬細胞外泌體；糞腸球菌感染；結腸癌；直腸癌；細胞實驗

結直腸癌（Colorectal cancer， CRC）是一種胃腸道惡性腫瘤，發(fā)病率和病死率分別居惡性腫瘤中的第3、2位［1］。在中國，結直腸癌是發(fā)病率上升最快的惡性腫瘤之一［2］。結直腸癌的病因目前尚未完全明確。研究［3］發(fā)現，糞腸球菌和大腸桿菌引起的慢性炎癥是結直腸癌發(fā)病的主要風險因素之一。糞腸球菌可定植在結腸黏膜固有層巨噬細胞中，通過旁觀者效應誘導相鄰腸道上皮細胞癌變，最終導致結直腸癌的發(fā)生發(fā)展［4-5］。OG1RF是臨床常用的實驗用糞腸球菌。研究［6-9］表明，腫瘤相關巨噬細胞（ tumor associated macrophages， TAMs）可以通過外泌體途徑，轉運microRNA、蛋白等內容物至周圍癌細胞中，影響癌細胞的生長。糞腸球菌感染結直腸粘膜固有層巨噬細胞后，是否通過分泌外泌體的形式誘導相鄰腸道上皮細胞癌變，最終導致結直腸癌的發(fā)生發(fā)展，目前尚不明確。為此，我們觀察了OG1RF感染對結腸黏膜巨噬細胞外泌體分泌的影響，現報告如下。

1 材料與方法

1.1細胞培養(yǎng)及糞腸球菌擴增方法小鼠單核巨噬細胞系raw264.7和人源性腸上皮細胞（NCM460）均由南通市婦幼保健院生殖與遺傳研究所保存并提供。raw264.7和NCM460細胞分別在DMEM 培養(yǎng)基和RPMI 1640培養(yǎng)基（美國HyClone）中培養(yǎng)，均補充10%胎牛血清（美國Gibco）和1%青霉素/鏈霉素（HyClone）。細胞于37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。OG1RF由南通市婦幼保健院生殖與遺傳研究所保存并提供，取一環(huán)OG1RF加入40 mL營養(yǎng)肉湯（BHI）內，在搖床內37 ℃，55 rpm過夜，5 000 r/min離心10 min后棄上清，重復2次，5 mL PBS重懸后備用。

1.2OG1RF感染對raw264.7細胞外泌體分泌的影響觀察

1.2.1OG1RF感染的raw264.7細胞外泌體分泌量觀察

1.2.1.1raw264.7細胞分組及OG1RF感染方法取raw264.7細胞，5×105/孔的密度鋪至6孔板過夜后，分為A、B兩組，每組3孔。其中A組為感染組，以感染復數（MOI=500）的OG1RF感染raw264.7細胞1 h（該階段使用無雙抗的DMEM非完全培養(yǎng)基），PBS洗滌4次后，加入DMEM完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。B組3孔為對照組，不進行處理。繼續(xù)培養(yǎng)24 h。

1.2.1.2兩組細胞外泌體分泌情況觀察當細胞生長密度達到90%時，收集細胞上清液體，4 ℃下2 000 g離心30 min去除細胞碎片，取1 mL上清液置入干凈EP管，加入500 μL外泌體提取試劑，通過渦流將培養(yǎng)基/試劑混合均勻，4 ℃冰箱過夜；4 ℃下10 000 g離心10 min，棄上清，加入25 μL PBS液溶解獲得外泌體，-80 ℃保存。用PBS重懸提取外泌體，將溶液滴在網格直徑2 nm的碳包銅網格上，靜置2 min，除去多余液體，用濾紙將網格瀝干，用磷鎢酸負染一滴裝入網格，5 min后在室溫下烘干網格，JEOL JEM-1010透射電子顯微鏡下觀察外泌體。采用含有苯甲磺酰氟的免疫沉淀緩沖液從外泌體中提取蛋白質，觀察CD63、CD81蛋白表達，鑒定外泌體。采用BCA法測算外泌體蛋白，重復測量3次，取平均值。

1.2.2GW4869對OG1RF感染raw264.7細胞外泌體分泌的影響觀察

1.2.2.1raw264.7細胞分組及GW4869、OG1RF干預方法取raw264.7細胞，5×105/孔的密度鋪至6孔板過夜后，分為1、2、3組，每組3孔。三組均以感染復數（MOI=500）的OG1RF感染raw264.7細胞1 h（該階段使用無雙抗的DMEM非完全培養(yǎng)基），然后1、2組分別加入DMSO + 10 μmol/L GW4869、DMSO + 20 μmol/L GW4869，對照組加入同體積DMSO，每組加入含1%雙抗DMEM培養(yǎng)基（不含血清）培養(yǎng)24 h。

1.2.2.2各組細胞外泌體分泌情況觀察收集細胞上清液，采用BCA法測算各組外泌體蛋白，方法同“1.2.1.2”，重復測量3次，取平均值。

1.3OG1RF感染raw264.7細胞后分泌的外泌體在NCM460細胞中的傳遞情況觀察取“1.2.1.1”中A組提純后的外泌體，與4 μmol/L的PKH67一起孵育，并使用100-kDa過濾器去除多余染料。將標記后外泌體與NCM460細胞共培養(yǎng)3 h。然后根據說明書用4'，6-二脒基-2-苯吲哚（DAPI）標記這些細胞核。電鏡下藍色DAPI染料定位細胞核，綠色PKH67染料定位外泌體，觀察NCM460細胞中外泌體的分布情況。

2 結果

2.1OG1RF感染raw264.7細胞的外泌體分泌量A組細胞上清液中提取外泌體在透射電鏡下呈圓盤樣，外有膜狀結構包被，直徑50～150 nm，外泌體中表達CD63、CD81。培養(yǎng)24 h時A、B組細胞上清液外泌體含量分別為（0.783 ± 0.070）、（0.123 ± 0.056）μg，二者比較，<0.05。

1、2、3組細胞上清液外泌體含量分別為（0.592 ± 0.06）、（0.488 ± 0.09）、（0.778 ± 0.07）μg。與3組比較，1、2組細胞上清液外泌體含量低（<0.05）；與1組比較，2組細胞上清液外泌體含量低（<0.05）。

2.2OG1RF感染raw264.7細胞后分泌的外泌體在NCM460細胞中的傳遞情況NCM460細胞質中存在PKH67陽性標記的外泌體。

3 討論

世界范圍內結直腸癌發(fā)病率為4%～5%［10］。接受治療后結直腸癌患者的病死率約為45%［11］。年齡、慢性病史和不良生活方式等因素是結直腸癌發(fā)病的危險因素。腸道微生物群失調可引起慢性炎癥，從而誘導結直腸癌的發(fā)生發(fā)展。研究［12］表明，結直腸癌組織中大腸桿菌菌株水平明顯增加，可能與腫瘤的發(fā)病有關，大腸桿菌產生的細菌素具有促腫瘤特性，可引起DNA雙鏈斷裂和染色體不穩(wěn)定，導致更高的惡性轉化風險［13］。糞腸球菌通過產生遺傳毒性過氧化物［14］及其對細胞周期行為和多倍體沉淀的影響［15］直接介導癌癥過程。我們前期研究［16-17］證實，糞腸球菌可定植在結腸粘膜固有層的巨噬細胞，誘導巨噬細胞NF-kB信號通路和COX-2的表達并釋放炎癥性細胞因子和內源性誘變劑，導致相鄰的腸道上皮細胞發(fā)生DNA損傷、基因突變、染色體不穩(wěn)定性、以及致瘤性轉化，從而形成結直腸癌。我們將糞腸球菌的這種作用稱為微生物誘導的旁觀者效應。

巨噬細胞可通過釋放的外泌體，將其內容物轉運至肝癌、胃癌、乳腺癌細胞等腫瘤細胞［18-20］，調節(jié)靶基因的表達進而影響受體細胞相關蛋白的合成，這種作用可對機體生物功能產生影響，進而影響疾病的進程。至于巨噬細胞釋放的外泌體在結直腸癌發(fā)生過程中的作用相關報道較少。大腸桿菌可刺激腦微血管內皮細胞分泌外泌體，活化星形膠質細胞，使之顯著上調表達一系列炎癥因子和趨化因子，如促進星形膠質細胞的CXCL3、IL8顯著上調表達，還可通過磷酸化Erk1/2信號通路上調VEGFA的表達［21］，但外泌體在介導腸道微生物誘導的旁觀者效應中的作用目前尚無研究。本研究發(fā)現，在無外界刺激情況下raw264.7細胞可分泌少量外泌體，OG1RF感染后，raw264.7細胞外泌體分泌量明顯增大，由此推測OG1RF感染后巨噬細胞來源的外泌體可能參與了結直腸癌微生物誘導的旁觀者效應。

GW4869是一種外泌體抑制劑，可抑制細胞外泌體的分泌。但在不同細胞中，GW4869的抑制作用均不同，可在某些階段抑制外泌體內容物的分泌，但對細胞不具有普適性。KOBINA等［22］發(fā)現，GW4869抑制巨噬細胞通過外泌體釋放TNF-α、IL-1β、IL-6等促炎因子，有助于敗血癥中心功能障礙的治療。KOSAKA等［23］等研究發(fā)現，GW4869抑制HEK293細胞分泌多種外泌體microRNAs。JIANG等［24］研究發(fā)現，GW4869抑制上皮間質細胞外泌體分泌（總蛋白的量），導致小鼠牙器官發(fā)育不全。M2型巨噬細胞培養(yǎng)上清中提取的外泌體按不同濃度梯度與骨髓間充質干細胞共培養(yǎng)后，骨髓間充質干細胞的成骨分化效應與M2型巨噬細胞來源外泌體的質量濃度和作用時間相關［25］，這表明外泌體的濃度和作用時間對周圍細胞生物活性的影響不同。本研究中，我們用不同濃度的GW4869處理感染后的raw264.7細胞，發(fā)現隨著GW4869的處理濃度越高，外泌體分泌量越少，即GW4869可抑制raw264.7巨噬細胞中外泌體的分泌。后續(xù)我們可以通過控制GW4869的處理濃度調節(jié)raw264.7細胞外泌體的分泌，以便于觀察不同水平的外泌體對NCM460細胞表觀遺傳等生物活性改變的影響。

在惡性實體瘤中，TAMs的形成是由巨噬細胞與癌細胞之間的膜分子直接接觸和旁分泌環(huán)實現的［26］。外泌體主要是體內多種細胞類型分泌到循環(huán)系統(tǒng)中的小囊泡，通過跨膜蛋白直接與靶細胞的信號受體相互作用；或與受體細胞的質膜融合，并將其內含物傳遞到細胞質中；也可以被近端或遠端細胞內化，并且這種內化具有靶向性。本研究中我們采用外泌體示蹤方法發(fā)現，raw264.7細胞分泌的外泌體融合進入NCM460細胞內，主要分布于細胞質內，該發(fā)現提示體內巨噬細胞分泌的外泌體轉移到周圍正常腸上皮細胞的可能性。當外泌體被受體細胞接收時，細胞的生物特性可以發(fā)生改變。這表明巨噬細胞與腸上皮細胞間的通訊中可能由外泌體所介導，為我們進一步研究外泌體在介導腸道微生物誘導的旁觀者效應中所起的作用奠定了良好的基礎。

然而，本研究仍然存在一些不足之處，由于外泌體的標記方式為細胞外染色，所以巨噬細胞分泌外泌體至臨近腸上皮細胞的直觀過程難以呈現，只能通過染色的外泌體與腸上皮細胞共同孵育的方式間接證明。另外，外泌體導致腸上皮細胞發(fā)生旁觀者效應的研究需進一步探索。

綜上所述，OG1RF感染raw264.7細胞可促進raw264.7細胞分泌外泌體。GW4869可抑制OG1RF感染raw264.7細胞分泌外泌體，且高濃度GW4869抑制效果較好。OG1RF感染raw264.7細胞分泌的外泌體可以內化進入正常腸上皮細胞內發(fā)揮作用。

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Secretion of exosomes from mouse mononuclear macrophages infected with enterococcus faecalis and its transmission in human intestinal epithelial cells

1，，，，，

1，，226018，

To observe the secretion of exosomes in mouse mononuclear macrophage raw264.7 infected by enterococcus faecalis OG1RF， and to further observe the transmission of exosomes secreted by raw264.7 cells in human intestinal epithelial cells NCM460.Raw264.7 cells were divided into groups A and B. The cells in the group A were infected with OG1RF for 1 h and then were cultured with DMEM medium. Group B was the control group and was not treated. After 24 h culture， the supernatant of cells was collected， and exosomes were extracted and identified. The content of exosomes in the two groups was measured by BCA method （to observe the secretion of exosomes）. Raw264.7 cells were taken and spread on 6-well plates at a density of 5×105/well overnight. The cells were then divided into three groups： groups 1， 2， and 3， which were infected with OG1RF for 1 h. Then， Dimethyl Sulfoxide （DMSO） +10 μmol/L exosome inhibitors GW4869 and DMSO+20 μmol/L GW4869 were added to groups 1 and 2， respectively， and the same volume of DMSO was added to the control group. The exosome content in the supernatant of the three groups was measured after culture for 24 h （to observe the secretion of exosomes）. The exosomes purified from group A were added with 4 μmol/L PKH67 labeling， and the labeled exosomes were co-cultured with human intestinal epithelial cells NCM460 cells for 3 h. The exosomes in NCM460 cells were observed under electron microscopy （to observe the exosomes transmission in NCM460 cells）.After 24-hour culture， the exosome content in supernatant of cells in the groups A and B was （0.783±0.07） μg and （0.123±0.056） μg， respectively， with statistically significant difference （<0.05）. The exosome content in cell supernatant of groups 1， 2 and 3 was （0.592±0.06） μg，（0.488±0.09） μg， and （0.778±0.07） μg， respectively. The exosome content of cell supernatant in the groups 1 and 2 was significantly lower than that in the group 3 （<0.05）. Compared with group 1， group 2 had a significantly lower exosome level （<0.05）. Exosomes secreted by raw264.7 cells which were infected with OG1RF， could enter the cytoplasm of NCM460.Raw264.7 cells infected with OG1RF can promote exosome secretion， which can be inhibited by GW4869. After OG1RF infection， exosomes secreted by raw264.7 cells can enter NCM460 cells.

exosomes； macrophage exosomes； enterococcus faecalis infection； colon carcinoma； rectal carcinoma； cell experiment

10.3969/j.issn.1002-266X.2022.33.009

R574

A

1002-266X（2022）33-0037-04

江蘇省第五期“333工程”培養(yǎng)資金項目。

蔡瀟瀟（1994-），女，碩士研究生，初級技師，主要研究方向為外泌體相關分子在腫瘤細胞微環(huán)境中的調節(jié)機制。E-mail： 22861645222@qq.com

李海波（1972-），男，博士研究生，主任技師，主要研究方向為臨床微生物。E-mail： ntlihaibo2015@163.com

（2022-03-25）