創(chuàng)傷性股骨頭壞死動(dòng)物模型的研究進(jìn)展

王 巖，馬劍雄，董本超，田愛(ài)現(xiàn)，李 巖，孫 磊，靳洪震，盧 斌，王 穎，柏豪豪，馬信龍

股骨頭壞死（osteonecrosis of femoral head，ONFH）一直是骨科學(xué)領(lǐng)域一個(gè)復(fù)雜又很難治愈的常見(jiàn)疑難疾病，該疾病發(fā)病原因多樣，發(fā)病機(jī)制較為復(fù)雜[1]。因此，這也導(dǎo)致在臨床上處理該疾病時(shí)的不確定因素增加。同時(shí)，ONFH的初期發(fā)病較為隱匿，很難確切診斷，臨床中一旦發(fā)現(xiàn)往往已經(jīng)進(jìn)展到中后期，常常因?yàn)楦深A(yù)不及時(shí)而面臨進(jìn)行手術(shù)治療的風(fēng)險(xiǎn)。相關(guān)流行病學(xué)調(diào)查顯示，ONFH發(fā)病率逐年攀升，當(dāng)前全球已有約一千萬(wàn)人被該疾病所困擾[2]。根據(jù)發(fā)病因素可將ONFH分為創(chuàng)傷性和非創(chuàng)傷性兩大類，隨著社會(huì)的發(fā)展和進(jìn)步，創(chuàng)傷性股骨頭壞死(traumatic-induced osteonecrosis of femoral head，TIONFH)的發(fā)病率也在逐年攀升。前些年，大量研究都針對(duì)于非創(chuàng)傷性股骨頭壞死進(jìn)行探索。股骨頸骨折一般常發(fā)生在老年人群跌倒等外傷以后，老年人是TIONFH的高危人群，在非老年人中是一種少見(jiàn)的損傷，常由高能量的外界創(chuàng)傷引起[3]。據(jù)估計(jì)，隨著世界范圍內(nèi)老齡化人群的增加，到2050年，全世界髖部骨折的數(shù)量將從1990年的166萬(wàn)例增加到626萬(wàn)例，屆時(shí)將會(huì)給醫(yī)療衛(wèi)生行業(yè)帶來(lái)越來(lái)越大的負(fù)擔(dān)[4]。由于老年人群身體機(jī)能減退、常伴隨骨質(zhì)疏松癥和肌肉減少癥，出現(xiàn)老年髖部骨折后再進(jìn)行手術(shù)的預(yù)后不是十分理想，從臨床實(shí)際情況來(lái)看，老年髖部骨折的預(yù)防和治療也是當(dāng)前骨科疾病領(lǐng)域亟待解決的問(wèn)題。TIONFH是由髖關(guān)節(jié)脫位、股骨頸骨折等髖部創(chuàng)傷引起的最常見(jiàn)的無(wú)菌性O(shè)NFH，是股骨頸骨折的主要并發(fā)癥[5]。近年來(lái)，國(guó)內(nèi)外大量學(xué)者也開始重視對(duì)TIONFH的發(fā)病機(jī)制和診療手段的研究。研究該疾病的首要任務(wù)是需要建立一種理想可靠的動(dòng)物模型來(lái)模擬臨床中TIONFH的發(fā)病機(jī)制及臨床表現(xiàn)。雖然目前關(guān)于TIONFH的動(dòng)物模型建模方式有很多，但是仍然沒(méi)有找到一種理想的動(dòng)物模型建模方法來(lái)貼切地模擬臨床中不同病因引起的TIONFH，如若在選擇動(dòng)物模型時(shí)出現(xiàn)偏差將會(huì)導(dǎo)致該疾病的下一步研究嚴(yán)重受阻。因此，本文歸納總結(jié)了當(dāng)前關(guān)于TIONFH動(dòng)物模型的一些常用建模方法，并分析對(duì)比他們的優(yōu)缺點(diǎn)和適用性，為今后TIONFH的相關(guān)研究提供動(dòng)物模型的基礎(chǔ)，助力在TIONFH領(lǐng)域早日實(shí)現(xiàn)新的突破。

1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的選擇

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的選擇是動(dòng)物模型建模的關(guān)鍵首要步驟，也是醫(yī)學(xué)研究中必不可少的一環(huán)，用于建立TIONFH動(dòng)物模型的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物主要分為四足動(dòng)物和雙足動(dòng)物兩大類。四足動(dòng)物最為常用，包括小鼠、大鼠、兔子、犬、羊等，其中小鼠和大鼠易于飼養(yǎng)、價(jià)格便宜且抗病能力較強(qiáng)，但用于研究的目標(biāo)組織樣本較少，不利于后期的結(jié)果檢測(cè)[6]；兔子屬于中小型實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，其特點(diǎn)是價(jià)格便宜、易于獲取，但其抗病能力與大小鼠相比較差，在造模過(guò)程中死亡率遠(yuǎn)高于大鼠[7]；犬和羊等大型動(dòng)物的優(yōu)點(diǎn)在于髖關(guān)節(jié)和股骨頭較大，易于進(jìn)行手術(shù)造模操作，但缺點(diǎn)是費(fèi)用較高、對(duì)飼養(yǎng)環(huán)境要求較高。總的來(lái)說(shuō)四足動(dòng)物更常見(jiàn)且更容易獲取，但在模擬TIONFH的疾病進(jìn)程中，由于其四足行走的方式與人類雙足負(fù)重具有較大差異，因此不容易形成TIONFH后期的壞死塌陷等表現(xiàn)，不宜用于對(duì)該疾病后期的相關(guān)研究。雙足動(dòng)物與四足動(dòng)物相比最大的優(yōu)點(diǎn)就是雙下肢負(fù)重的方式與人類相似，髖關(guān)節(jié)周圍的生物力學(xué)環(huán)境更接近于人類，因此更易于模擬該疾病后期的表現(xiàn)，更適用于進(jìn)行TIONFH塌陷后的相關(guān)研究[8]。常用的雙足動(dòng)物有鴯鹋和猿猴等，但雙足動(dòng)物一般都不易于獲取且價(jià)格昂貴，這也就限制了其在TIONFH動(dòng)物模型方面的應(yīng)用。

2 血供受阻模型

TIONFH的主要誘因?yàn)轶y關(guān)節(jié)附近由于車禍、跌倒等外界創(chuàng)傷因素引起股骨頭周圍血供受到破壞導(dǎo)致股骨頭內(nèi)骨小梁組織和骨細(xì)胞等缺血，進(jìn)而出現(xiàn)股骨頭的壞死和進(jìn)一步塌陷。因此阻斷股骨頭周圍的血液供應(yīng)是建立TIONFH動(dòng)物模型的的一類經(jīng)典方法。此方法適用于模擬臨床中由于外界創(chuàng)傷因素所形成的TIONFH。

2.1 切斷圓韌帶并結(jié)扎股骨頸法 切斷圓韌帶并結(jié)扎股骨頸法具體造模方法為將實(shí)驗(yàn)動(dòng)物俯臥位固定，隨后在大轉(zhuǎn)子上的皮膚上做一個(gè)縱向切口，將實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的臀大肌和臀中肌分離開來(lái)，橫切髖關(guān)節(jié)囊，將股骨頭脫位，切斷圓韌帶并將股骨頭基底部股骨頸周圍進(jìn)行血管的阻斷，可以用縫合線進(jìn)行結(jié)扎，也可以用電凝裝置進(jìn)行阻斷股骨頸周圍血管，完成以后將股骨頭復(fù)位并分層縫合肌肉和皮膚。其中，單獨(dú)運(yùn)用切斷圓韌帶或結(jié)扎股骨頸周圍血運(yùn)的方法也能夠建立TIONFH動(dòng)物模型，但那樣將會(huì)增加造模的周期，降低效率，但死亡率會(huì)大幅降低，但如將以上兩種方法并用可以縮短建模周期，提高成模效率，更適用于需要快速建立大量模型時(shí)使用。此方法的缺點(diǎn)是對(duì)動(dòng)物造成的創(chuàng)傷較大，病情進(jìn)展較快，不利于進(jìn)行病情進(jìn)展的相關(guān)研究和觀察。Liu等[9]采用3月齡SD大鼠通過(guò)切除圓韌帶并用縫合線結(jié)扎股骨頸的方法成功建立了TIONFH動(dòng)物模型，建模5周后相關(guān)評(píng)價(jià)結(jié)果顯示模型組大鼠股骨頭大體外觀表面呈“蛀蝕”狀，組織形態(tài)學(xué)結(jié)果顯示股骨頭出現(xiàn)壞死表現(xiàn)且破骨細(xì)胞活性增強(qiáng)。Cheng等[10]對(duì)大鼠左髖進(jìn)行手術(shù)，采用前髖關(guān)節(jié)切開術(shù)，在不移除肌肉的情況下打開囊膜，橫切髖圓韌帶，隨后用電凝法去除股骨頸周圍血管，誘導(dǎo)TIONFH，8周后行Micro-CT掃描和定量計(jì)算，結(jié)果顯示模型組大鼠股骨頭出現(xiàn)明顯的空洞，骨小梁被異常組織替代，出現(xiàn)TIONFH的表現(xiàn)。Deng等[11]采用16只6～8周齡左右的約克郡公仔豬，橫切圓韌帶后，將縫合結(jié)扎緊繞股骨頸，通過(guò)手術(shù)誘導(dǎo)股骨頭缺血性骨壞死。在建模手術(shù)后2 d、2周和4周分別進(jìn)行了大體觀察、影像學(xué)和組織學(xué)評(píng)估分析，結(jié)果顯示4周后股骨頭外觀出現(xiàn)變形，病理學(xué)觀察到更多的空骨陷窩，而骨髓間隙顯示小血管、壞死頭部周圍的成纖維細(xì)胞和脂肪細(xì)胞浸潤(rùn)，破骨細(xì)胞活性增強(qiáng)以吸收壞死骨組織。

2.2 栓塞法 采用栓塞法建立TIONFH動(dòng)物模型是通過(guò)阻斷和妨礙股骨頭周圍血供來(lái)建模的方法，近些年來(lái)開始被大家了解和使用。主要方法是通過(guò)注射栓塞劑造成股骨頭周圍血液循環(huán)障礙，最終形成TIONFH。該方法造模的發(fā)病機(jī)制清楚，動(dòng)物造模后成活率高，成模率高，而且能夠比較完整地模擬人類ONFH的病理過(guò)程。此方法的難點(diǎn)在于手術(shù)難度大，需要采用大型動(dòng)物來(lái)進(jìn)行建模，而且目前對(duì)于栓塞劑的研發(fā)并沒(méi)有取得理想的結(jié)果，因此對(duì)栓塞劑的選擇是該模型建模的關(guān)鍵點(diǎn)和困難點(diǎn)。馬坤等[12]于9只犬的股骨頭供血分支動(dòng)脈主干內(nèi)導(dǎo)入栓塞劑（平陽(yáng)霉素和明膠海綿顆粒混合物），栓塞劑注入成功后造影檢查顯示各分支動(dòng)脈出現(xiàn)閉塞。于造模后的第2、4、6周分別處死各組犬1只進(jìn)行相關(guān)檢測(cè)，術(shù)后4周的核磁共振檢查發(fā)現(xiàn)出現(xiàn)TIONFH的早期癥狀，組織形態(tài)學(xué)發(fā)現(xiàn)出現(xiàn)部分骨小梁斷裂情況，6周時(shí)癥狀加重。除此之外還有很多類型的栓塞劑，但是尚無(wú)十分理想的栓塞劑供建立激素性O(shè)NFH（SONFH）使用，同時(shí)介入手術(shù)操作復(fù)雜這些都限制了此方法的廣泛運(yùn)用。

3 骨折復(fù)位模型

TIONFH的直接因素是外界因素對(duì)髖關(guān)節(jié)造成創(chuàng)傷后出現(xiàn)股骨頸骨折，隨之股骨頭周圍血供和生物力學(xué)環(huán)境均出現(xiàn)異常，最終導(dǎo)致TIONFH的發(fā)生。因此，大多數(shù)TIONFH患者會(huì)有股骨頸骨折或髖關(guān)節(jié)外傷的既往病史。骨折復(fù)位模型主要用于模擬臨床中由于股骨頸骨折復(fù)位不良引起的TIONFH。具體造模方法為在股骨頭脫位或半脫位的情況下，用擺鋸造成股骨頸完全骨折。隨后重新解剖復(fù)位后再用內(nèi)固定物沿大粗隆下股外側(cè)皮質(zhì)向股骨頭中心點(diǎn)行內(nèi)固定，或手動(dòng)復(fù)位后直接縫合。Zhang等[13]用32只新西蘭大白兔進(jìn)行造模，無(wú)菌條件下于右側(cè)髖關(guān)節(jié)的后外側(cè)行5 cm切口，切開關(guān)節(jié)囊，露出股骨頭。然后用不銹鋼骨槽刀在股骨頸形成外力骨折，使股骨頭脫位，骨折分離2～3 min。隨后重新定位股骨頭并用縫線固定，不進(jìn)行任何固定。造模2周后行結(jié)果檢測(cè)，股骨近端橫截面顯示模型側(cè)股骨呈白色，表現(xiàn)為缺血性壞死；核磁共振檢查結(jié)果顯示出現(xiàn)“新月征”；組織形態(tài)學(xué)結(jié)果顯示骨小梁出現(xiàn)斷裂，骨小梁組織的空骨陷窩數(shù)量增多，出現(xiàn)骨壞死表現(xiàn)。

4 破壞性模型

破壞性模型主要是指對(duì)股骨頭內(nèi)部骨組織或細(xì)胞進(jìn)行破壞，造成股骨頭內(nèi)微循環(huán)障礙最終形成TIONFH。主要通過(guò)向股骨頭內(nèi)部或表面注射對(duì)骨組織或細(xì)胞能產(chǎn)生破壞性的藥物。此類方法雖然與臨床實(shí)際發(fā)病機(jī)制不是非常相似，但能夠在短時(shí)間內(nèi)快速大量建立TIONFH動(dòng)物模型，且可重復(fù)性好，適用于需要大量動(dòng)物模型進(jìn)行治療及預(yù)后方面的研究，不適用于針對(duì)發(fā)病機(jī)制方面的研究。

4.1 液氮冷凍法 液氮冷凍主要是通過(guò)在無(wú)菌條件下對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物髖關(guān)節(jié)行外側(cè)切口，剝離軟組織，打開關(guān)節(jié)囊并使股骨頭脫位，常規(guī)方法通過(guò)股骨頭上端用紗布蘸液氮冷凍，然后用溫鹽水重新恢復(fù)室溫，改良方法為采用特定裝置將液氮注入股骨頭內(nèi)造成TIONFH，最后復(fù)位股骨頭后逐層縫合切口。Liao等[14]采用80只新西蘭成年家兔進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，采用常規(guī)液氮冷凍法建立模型后2、4、6、8、10、12周進(jìn)行取材觀察，建模后第4周開始出現(xiàn)股骨頭表面異常等骨壞死表現(xiàn)。Wang等[15]采用改良液氮冷凍法對(duì)16只小尾寒羊進(jìn)行造模，首先分離皮膚、筋膜和肌肉層，顯露股骨頭頸接點(diǎn)，從股骨頭頸連接處下內(nèi)側(cè)向股骨頭中心方向鉆出直徑2 mm、深度10 mm的孔，用低溫液氮冷凍儀將液氮注入股骨頭內(nèi)冷凍6 min，然后用溫鹽水解凍6 min，反復(fù)進(jìn)行3次凍融循環(huán)，每只動(dòng)物用450 mL液氮。分別在造模后1、3、6個(gè)月進(jìn)行影像學(xué)檢查并行組織學(xué)評(píng)估，結(jié)果顯示各時(shí)間節(jié)點(diǎn)均有不同程度壞死表現(xiàn)；造模后1個(gè)月的組織學(xué)評(píng)估顯示，壞死改變占主導(dǎo)地位，骨小梁組織的空骨陷窩數(shù)量增多，造血細(xì)胞的數(shù)量出現(xiàn)下降的趨勢(shì)，成纖維細(xì)胞數(shù)量明顯變多。造模后3個(gè)月和6個(gè)月時(shí)，骨折小梁、成纖維細(xì)胞和新毛細(xì)血管增加，表明骨吸收和骨修復(fù)過(guò)程同時(shí)進(jìn)行。

4.2 微波加熱法 微波加熱法與液氮冷凍法建模方法類似，主要是通過(guò)對(duì)股骨頭內(nèi)部進(jìn)行微波加熱破壞股骨頭內(nèi)部組織結(jié)構(gòu)來(lái)建立TIONFH動(dòng)物模型。Li等[16]采用新西蘭大白兔48只分為3組進(jìn)行造模，Ⅰ組(50 ℃加熱10 min)、Ⅱ組(55 ℃加熱10 min)和Ⅲ組(60 ℃加熱10 min)，具體造模方法為在無(wú)菌條件下，從股骨頭下鉆孔至股骨頭中心，徑跡直徑為1.5 mm，深度為軟骨下8 mm，通過(guò)鉆孔軌道將微波天線置入股骨頭中心，對(duì)3組進(jìn)行加熱。分別在2、4、6、8、10和12周進(jìn)行X線檢查，發(fā)現(xiàn)股骨頭有囊性改變和塌陷。

4.3 化學(xué)滅活法 化學(xué)滅活法主要是通過(guò)向?qū)嶒?yàn)動(dòng)物股骨頭內(nèi)注入化學(xué)試劑對(duì)股骨頭內(nèi)部組織和細(xì)胞造成滅火，從而形成TIONFH。該方法造模成模時(shí)間短、成功率高，操作簡(jiǎn)便，重復(fù)性高，缺點(diǎn)則是會(huì)在股骨頭內(nèi)殘留一些化學(xué)物質(zhì)影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果，而且同液氮冷凍法建模類似，由于不符合臨床TIONFH疾病的發(fā)病過(guò)程，因此只能用于TIONFH治療和預(yù)后方面的相關(guān)研究，不能用于發(fā)病機(jī)制相關(guān)的研究。該方法所用的化學(xué)試劑最常用的就是無(wú)水乙醇。陳東等[17]采用新西蘭大耳白兔于股骨大轉(zhuǎn)子外側(cè)切口剝離筋膜和周圍包括的肌肉、韌帶等軟組織，隨后用穿骨針鉆一個(gè)直徑為3 mm的孔道直通股骨頭中心，利用骨穿針套管將無(wú)水乙醇1 mL(注射速度為0.1 mL/min)緩緩注入股骨頭內(nèi)。大體觀察、影像學(xué)及組織形態(tài)學(xué)結(jié)果均顯示在第6周出現(xiàn)較為明顯的骨壞死表現(xiàn)，提示造模成功。范猛等[18]采用成年鴯鹋20只建模，通過(guò)提前定制好的注射探針插入股骨頭的附中區(qū)域，采用局部緩慢注射8 mL無(wú)水乙醇的方式造成TIONFH，并于造模后每隔2周進(jìn)行髖關(guān)節(jié)的磁共振檢查，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示直至12周在影像學(xué)與組織形態(tài)學(xué)均顯示出明顯的TIONFH表現(xiàn)，建模后24周觀察股骨頭已出現(xiàn)恢復(fù)趨勢(shì)。

5 總結(jié)與展望

隨著社會(huì)的發(fā)展和進(jìn)步，TIONFH的發(fā)病率逐年上升，大多數(shù)疾病高發(fā)于一些外界高能量創(chuàng)傷股骨頸骨折術(shù)后幾年內(nèi)，將對(duì)患者的生存質(zhì)量造成深遠(yuǎn)的影響，給社會(huì)和經(jīng)濟(jì)帶來(lái)嚴(yán)重的負(fù)擔(dān)。通過(guò)建立理想的動(dòng)物模型能夠貼切模擬臨床TIONFH的發(fā)病過(guò)程，從而為該疾病的病因、機(jī)制及診療方法的研究提供基礎(chǔ)。當(dāng)前關(guān)于TIONFH的動(dòng)物模型研究十分廣泛，最常見(jiàn)的是血供受阻模型，該方法主要模擬臨床中由于外傷引起的股骨頭周圍血供障礙導(dǎo)致的TIONFH；其次是骨折復(fù)位模型，該類模型主要從術(shù)后復(fù)位不良生物力學(xué)環(huán)境改變的角度模擬臨床中一些患者出現(xiàn)股骨頸骨折后復(fù)位不良造成的TIONFH；而破壞性模型的發(fā)病機(jī)制與臨床中該疾病相差甚遠(yuǎn)，因此主要用于該疾病診療于預(yù)后的相關(guān)研究。雖然目前關(guān)于TIONFH的動(dòng)物模型有很多類型，但是在開展相關(guān)研究前要根據(jù)研究目的來(lái)選擇對(duì)應(yīng)合適且能夠準(zhǔn)確模擬臨床現(xiàn)象的模型，借助動(dòng)物模型在該疾病相關(guān)領(lǐng)域的研究中實(shí)現(xiàn)新的突破，造?；颊?。