多重雜質(zhì)吸附結(jié)合液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜測定寵物飼料中?；撬?/h1>
2022-12-23 08:04:22索德成肖志明王繼彤劉曉露
中國飼料 2022年22期
索德成， 肖志明， 王 石， 王繼彤， 姚 婷， 劉曉露， 范 理， 樊 霞*
（1.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)與檢測技術(shù)研究所，北京 100081；2.北京市獸藥飼料監(jiān)測中心，北京 100101）
?；撬幔═aurine）又稱β-氨基乙磺酸，是一種含硫的非蛋白氨基酸，作為機(jī)體的條件必需氨基酸，多以游離態(tài)廣泛存在于動(dòng)物體內(nèi)各組織器官，并以小分子二肽或三肽的形式存在于中樞神經(jīng)系統(tǒng)，具有多種生理活性和營養(yǎng)作用（李衛(wèi)娟等，2006；劉惠芳等，2003）。牛磺酸雖然不直接參與機(jī)體蛋白質(zhì)合成，但其可通過影響胱氨酸和半胱氨酸的代謝從而參與新陳代謝（何曉芳等，2022）。人和一些動(dòng)物機(jī)體可以從膳食中攝取或經(jīng)自身合成牛磺酸，但對于犬貓等動(dòng)物特別是貓科動(dòng)物來說，體內(nèi)不能合成?；撬幔荒芤揽繌耐饨鐢z?。ɡ钚l(wèi)娟等，2006；黃天珍，1994）。如果貓沒有獲得足夠的?；撬幔瑫?huì)出現(xiàn)如視網(wǎng)膜退化、視力衰退、擴(kuò)張型心肌癥消化疾病、生殖功能衰竭、免疫功能失調(diào)、發(fā)展遲緩等健康病癥（吳興利等，2006；趙建偉等，1999；黃天珍，1994）。因此，寵物飼料生產(chǎn)過程中會(huì)額外加入牛磺酸以保證動(dòng)物機(jī)體的健康生長，我國農(nóng)業(yè)農(nóng)村部公告第20號中的《寵物飼料標(biāo)簽規(guī)定》也將?；撬嶙鳛楫a(chǎn)品標(biāo)簽中成分分析保證值的強(qiáng)制性標(biāo)示參數(shù)。
目前寵物飼料中?；撬岬臋z測分析與食用動(dòng)物飼料采用的方法一致，主要包括比色法（李詠梅等，2013；楊涓等，2005）、高效液相色譜法（殷秋妙等，2016；楊曦等，2014、2013；張曉鳳等，2012）、氨基酸分析儀測定法（王洪健等，2012）等，其中高效液相色譜法是最常用的檢測方法，但其檢測過程需要使用丹磺酰氯、鄰苯二甲醛、二硝基氟苯等進(jìn)行衍生，操作復(fù)雜；此外，寵物飼料成分復(fù)雜，動(dòng)物源性原料如肉類、動(dòng)物油脂類含量高，與傳統(tǒng)食用動(dòng)物飼料基質(zhì)存在較大差別，提取后雜質(zhì)干擾大，影響衍生效率和色譜定量，檢測重復(fù)性差，無法滿足寵物飼料中牛磺酸的準(zhǔn)確定量要求。液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法（LC-MS/MS）靈敏度高，選擇性和特異性好，近年來已被廣泛應(yīng)用于氨基酸類化合物檢測（陳曉峰等，2015；鄧其馨等，2014；李鵬飛等，2013、2012）。配合多重雜質(zhì)吸附技術(shù)可在前處理過程中凈化寵物飼料基質(zhì)中的雜質(zhì)干擾。本實(shí)驗(yàn)旨在建立多重雜質(zhì)吸附結(jié)合LC-MS/MS定性定量分析寵物飼料中?；撬岬姆椒ǎ瑸閺?fù)雜的寵物飼料基質(zhì)中?；撬岬臋z測分析提供技術(shù)參考。
1 材料與方法
1.1實(shí)驗(yàn)材料 寵物飼料樣品由國家飼料質(zhì)量檢驗(yàn)檢測中心（北京）提供，固體樣品全部粉碎過0.45 mm孔徑篩，所有樣品全部混合均勻。
鹽酸（分析純，北京化工廠）；甲酸、乙腈、甲醇（色譜純，美國Fisher ChenAlert Guide公司）；?；撬釋φ掌罚兌取?9%，上海源葉生物科技有限公司）；實(shí)驗(yàn)用水為Milli-Q純化后的一級水（＞18.2 MΩ）。
前處理吸附材料：Cleanert S C18（粒徑50 μm）、Cleanert S中性氧化鋁（Alumina-N，粒徑150 μm）、Cleanert S活性碳（PestiCarb，粒徑120~400 mesh）、Cleanert S Nano Carb（粒徑10~20 nm），均購置于Agela Technologies公司；BONDESILSAX（粒徑40 μm）、BONDESIL-SCX（粒徑40 μm）、BONDESIL-PSA（粒 徑40 μm）、BONDESIL-FL（粒徑200 μm，均購置于美國Agilent Technologies公司）。
1.2儀器和設(shè)備Acquity超高效液相色譜：配備TQS三重四極桿質(zhì)譜儀（美國Waters公司）；MS2漩 渦 混 合 器 （德 國IKA公 司）；Centrifuge 5810離心機(jī)（德國Ependorf公司）。
1.3實(shí)驗(yàn)方法
1.3.1 樣品稀釋溶液 移取0.1 mL甲酸和10 mL乙腈，加水定容至100 mL。
1.3.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制 準(zhǔn)確稱取牛磺酸對照品，置于棕色容量瓶中，用水配成濃度約為100 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)貯備液；再準(zhǔn)確吸取牛磺酸貯備液，用樣品稀釋溶液稀釋成濃度為0.01~10 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)工作液。
1.3.3 多重吸附前處理吸附材料的配制 稱取10 g C18吸附材料，15 g中性氧化鋁吸附材料，10 g活性碳吸附材料于50 mL三角瓶中，混合均勻。
1.3.4 樣品前處理 準(zhǔn)確稱取2.0 g（精確至0.001 g）樣品，置于50 mL離心管中，準(zhǔn)確加入20 mL 0.5 mol/L鹽酸溶液，超聲提取30 min，然后于8000 r/min離心2 min，取2 mL上清液置于5 mL離心管中，加入50 mg多重吸附前處理吸附材料，漩渦混合30 s，于8000 r/min離心2 min。將1 mL上清液轉(zhuǎn)移至10 mL離心管中，加入9 mL水，漩渦混合30 s，過0.22 μm濾膜，供LC-MS/MS分析測定。若樣品中含量超出線性范圍，應(yīng)用樣品稀釋液稀釋至線性范圍后再進(jìn)行上機(jī)分析。
1.4色譜質(zhì)譜條件
1.4.1 色譜條件 色譜柱：ACQUITY UPLC BEH C18（150 mm×3.0 mm×1.7 μm）；流速：0.3 mL/min；柱溫：30℃；進(jìn)樣量：5 μL；流動(dòng)相及參考梯度洗脫程序見表1。
表1 流動(dòng)相及梯度洗脫程序
1.4.2 質(zhì)譜條件 質(zhì)譜采用電子噴霧離子源，正離子檢測方式，多反應(yīng)監(jiān)測（HRM）模式；噴霧電壓為3.0 Kv；霧化氣溫度為480℃；源溫度為150℃；霧化氣流速為600 L/hr；錐孔氣流速為5 L/hr；脫溶劑氣、錐孔氣、碰撞氣均為高純氮?dú)饧捌渌线m氣體，使用前應(yīng)調(diào)節(jié)各氣體流量以使質(zhì)譜靈敏度達(dá)到檢測要求。
2 結(jié)果與分析
2.1流動(dòng)相的優(yōu)化 參考鄧其馨等（2014）、李鵬飛（2013）和標(biāo)準(zhǔn)方法（GB 5009.169-2016和農(nóng)業(yè)部2483號公告-5-2016），分別選擇乙腈和甲醇作為流動(dòng)相進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。結(jié)果表明，當(dāng)使用甲醇作為流動(dòng)相的時(shí)候，在相同的條件下，離子化將受到不同程度的抑制，響應(yīng)值將會(huì)明顯的降低，導(dǎo)致靈敏度的下降；而使用乙腈作為流動(dòng)相時(shí)，離子化效率明顯優(yōu)于使用甲醇作為流動(dòng)相的情況，所以本實(shí)驗(yàn)采用乙腈為流動(dòng)相。使用優(yōu)化流動(dòng)相的典型色譜圖見圖1。
圖1 牛磺酸標(biāo)準(zhǔn)溶液（10 μg/mL）色譜質(zhì)譜圖
2.2監(jiān)測離子對的選擇 監(jiān)測離子對是串聯(lián)質(zhì)譜儀定性、定量的必要參數(shù)，因儀器型號不同而略有改變。以?；撬岬臉?biāo)準(zhǔn)溶液在ESI源正離子模式下掃描，選出信號相對較強(qiáng)的兩個(gè)碎片離子與其母離子分別組成兩對監(jiān)測離子對，在UPLC-MS/MS儀器的MRM模式下，實(shí)施對于錐孔電壓與碰撞能量等參數(shù)的進(jìn)一步優(yōu)化，優(yōu)化過后得到的MRM離子對和質(zhì)譜條件見表2。
表2 ?；撬豳|(zhì)譜參考值
2.3樣品前處理方法的確定
2.3.1 提取液及提取方式的選擇 由于?；撬崾撬苄晕镔|(zhì)，一般采用水溶液提取，但由于寵物飼料中蛋白質(zhì)、脂肪類物質(zhì)含量較高，簡單用水提取后，不能將?；撬岷偷鞍踪|(zhì)、脂肪類物質(zhì)有效分離，會(huì)影響檢測結(jié)果，故需要對前處理提取溶劑進(jìn)行篩選。蔡梅等（2013）研究發(fā)現(xiàn)，采用酸水解后將樣品基質(zhì)中的蛋白質(zhì)和脂肪等轉(zhuǎn)變?yōu)樗苄晕镔|(zhì)，可以提高回收率，但是過高的酸會(huì)影響檢測結(jié)果。因此，本實(shí)驗(yàn)比較了0.2~6 mol/L HCl溶液的提取效果，根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，最終選擇0.5 mol/L HCl作為提取液對樣品進(jìn)行提取，回收率和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差均能滿足方法學(xué)需要。確定了提取溶劑后，比較振蕩提取和超聲波提取對?；撬崽崛⌒实挠绊懀瑢Y(jié)果進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，2種提取方法無明顯差異。但為了節(jié)約時(shí)間，最終選用超聲處理。脂肪量低樣品或液體樣品中?；撬岬臏y定可用水提取或直接加水稀釋后測定。
2.3.2 凈化吸附材料的選擇 本實(shí)驗(yàn)選擇8種吸附材料（表3）對寵物飼料中的牛磺酸進(jìn)行吸附實(shí)驗(yàn)。稱取寵物飼料樣品25 g，加入100 mL提取液，離心，轉(zhuǎn)移至試劑瓶中。分別吸取3 mL提取液，加入0.3 mL 1 μg/mL?；撬針?biāo)準(zhǔn)溶液和50 mg吸附材料（材料比例），漩渦混合30 s，在搖床上振蕩10 min，離心5 min，取上清液過膜，上機(jī)檢測。同時(shí)吸取3 mL提取液，不加入吸附材料作為空白參考。用樣品溶液測定值與空白參考測定值的百分比值作為吸附率，吸附結(jié)果見圖2。
表3 吸附材料名稱與類型
圖2 不同吸附材料對寵物飼料中牛磺酸的保留率
結(jié)果表明，除了C18、Alumina和石墨碳外，其他大部分吸附材料對牛磺酸有一定的富集，但是其對?；撬嵛铰示陀?00%，無法作為富集材料使用。多重機(jī)制雜質(zhì)吸附（MIA）是一種基于基質(zhì)分散固相萃取的方法，該方法主要通過選擇多種功能化吸附材料，將樣品中的主要干擾雜質(zhì)吸附，有效地去除基體中可能存在的磷脂、色素等物質(zhì)，同時(shí)將被測物質(zhì)留在樣品溶液中，而達(dá)到凈化和富集的目的，可節(jié)省樣品前處理的時(shí)間（Suo，2021）。因此，選擇C18、Alumina和石墨碳作為多重機(jī)制雜質(zhì)吸附材料進(jìn)行下一步的研究。
2.3.3 前處理材料的比例和使用量的研究 根據(jù)不同材料的吸附特性，如石墨碳主要是物理性吸附，主要吸附氣體、色素類物質(zhì)；C18吸附填料主要吸附磷脂和中等極性的化合物；中性氧化鋁是物理性吸附，主要去除油脂類的類物質(zhì)。通過混合使用可以有效的去除寵物飼料的各種雜質(zhì)干擾，達(dá)到更好的凈化效果。從基質(zhì)凈化效果來看，石墨碳、C18和中性氧化鋁的比例為2∶2∶3，能有效地吸附雜質(zhì)，降低基質(zhì)效應(yīng)。
本研究同時(shí)考察了吸附材料的使用量，比較了5、10、20、50、80、100 mg不同固體吸附劑加入量對2 mL飼料提取液中雜質(zhì)凈化效果的影響。結(jié)果表明，當(dāng)固體吸附材料加入量達(dá)50 mg時(shí)，繼續(xù)加大吸附劑的用量對樣品雜質(zhì)的凈化效果和回收率無明顯改善。因此將吸附材料加入量設(shè)定為50 mg。當(dāng)加入吸附劑吸附凈化后，可以有效地除去基質(zhì)中的干擾物對待測物色譜峰的影響，同時(shí)減少雜質(zhì)對儀器和色譜柱的損害。
2.4線性、檢出限和定量限 根據(jù)1.4.2配制標(biāo)準(zhǔn)溶液并上機(jī)測定，根據(jù)3倍信噪比確定檢出限（LOD）、10倍信噪比確定定量限（LOQ），牛磺酸的標(biāo)準(zhǔn)曲線、檢出限和定量限見表4。
表4 ?；撬岬臉?biāo)準(zhǔn)曲線、檢出限和定量限
2.5回收率和精密度 在確定樣品前處理方法后，選擇有代表性的6種空白寵物飼料樣品作為研究對象，進(jìn)行加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)，以考察方法的準(zhǔn)確度和重現(xiàn)性。配制10、100 mg/kg和500 mg/kg三個(gè)濃度的試樣，每批次內(nèi)同一濃度做6次平行實(shí)驗(yàn)，共重復(fù)3批次，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表5。
表5 不同寵物飼料添加回收結(jié)果 %
從表5中可以看出，建立的檢測方法回收率＞85%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差＜10%，該方法可適用于不同種類寵物飼料中?；撬岷康臏y定。
2.6實(shí)際樣品分析 基于以上條件建立的檢測方法，對從市場上采集到的20份不同的寵物飼料樣品進(jìn)行檢測，檢測結(jié)果見表6。大部分?；撬岬臏y定結(jié)果比標(biāo)示值高，其原因可能是企業(yè)考慮到?；撬崽砑雍蟮牟环€(wěn)定因素，為了保證終產(chǎn)品中?；撬釢M足標(biāo)識量要求，一般在設(shè)計(jì)配方和實(shí)際生產(chǎn)時(shí)會(huì)適當(dāng)超出一定量添加牛磺酸，導(dǎo)致樣品的檢測結(jié)果高于產(chǎn)品標(biāo)示值。
表6 典型寵物飼料中?；撬釞z測結(jié)果
3 結(jié)論
本研究中通過對前處理?xiàng)l件及儀器條件參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化，建立了多重機(jī)制雜質(zhì)吸附萃取凈化結(jié)合液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)測定寵物飼料中?；撬岬姆椒?，該方法可滿足寵物飼料中?；撬岬姆治鲆?，且操作簡便、分析效率高，可用于相關(guān)樣品的日常檢測及監(jiān)控分析。
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目前寵物飼料中?；撬岬臋z測分析與食用動(dòng)物飼料采用的方法一致，主要包括比色法（李詠梅等，2013；楊涓等，2005）、高效液相色譜法（殷秋妙等，2016；楊曦等，2014、2013；張曉鳳等，2012）、氨基酸分析儀測定法（王洪健等，2012）等，其中高效液相色譜法是最常用的檢測方法，但其檢測過程需要使用丹磺酰氯、鄰苯二甲醛、二硝基氟苯等進(jìn)行衍生，操作復(fù)雜；此外，寵物飼料成分復(fù)雜，動(dòng)物源性原料如肉類、動(dòng)物油脂類含量高，與傳統(tǒng)食用動(dòng)物飼料基質(zhì)存在較大差別，提取后雜質(zhì)干擾大，影響衍生效率和色譜定量，檢測重復(fù)性差，無法滿足寵物飼料中牛磺酸的準(zhǔn)確定量要求。液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法（LC-MS/MS）靈敏度高，選擇性和特異性好，近年來已被廣泛應(yīng)用于氨基酸類化合物檢測（陳曉峰等，2015；鄧其馨等，2014；李鵬飛等，2013、2012）。配合多重雜質(zhì)吸附技術(shù)可在前處理過程中凈化寵物飼料基質(zhì)中的雜質(zhì)干擾。本實(shí)驗(yàn)旨在建立多重雜質(zhì)吸附結(jié)合LC-MS/MS定性定量分析寵物飼料中?；撬岬姆椒ǎ瑸閺?fù)雜的寵物飼料基質(zhì)中?；撬岬臋z測分析提供技術(shù)參考。
1 材料與方法
1.1實(shí)驗(yàn)材料 寵物飼料樣品由國家飼料質(zhì)量檢驗(yàn)檢測中心（北京）提供，固體樣品全部粉碎過0.45 mm孔徑篩，所有樣品全部混合均勻。
鹽酸（分析純，北京化工廠）；甲酸、乙腈、甲醇（色譜純，美國Fisher ChenAlert Guide公司）；?；撬釋φ掌罚兌取?9%，上海源葉生物科技有限公司）；實(shí)驗(yàn)用水為Milli-Q純化后的一級水（＞18.2 MΩ）。
前處理吸附材料：Cleanert S C18（粒徑50 μm）、Cleanert S中性氧化鋁（Alumina-N，粒徑150 μm）、Cleanert S活性碳（PestiCarb，粒徑120~400 mesh）、Cleanert S Nano Carb（粒徑10~20 nm），均購置于Agela Technologies公司；BONDESILSAX（粒徑40 μm）、BONDESIL-SCX（粒徑40 μm）、BONDESIL-PSA（粒 徑40 μm）、BONDESIL-FL（粒徑200 μm，均購置于美國Agilent Technologies公司）。
1.2儀器和設(shè)備Acquity超高效液相色譜：配備TQS三重四極桿質(zhì)譜儀（美國Waters公司）；MS2漩 渦 混 合 器 （德 國IKA公 司）；Centrifuge 5810離心機(jī)（德國Ependorf公司）。
1.3實(shí)驗(yàn)方法
1.3.1 樣品稀釋溶液 移取0.1 mL甲酸和10 mL乙腈，加水定容至100 mL。
1.3.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制 準(zhǔn)確稱取牛磺酸對照品，置于棕色容量瓶中，用水配成濃度約為100 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)貯備液；再準(zhǔn)確吸取牛磺酸貯備液，用樣品稀釋溶液稀釋成濃度為0.01~10 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)工作液。
1.3.3 多重吸附前處理吸附材料的配制 稱取10 g C18吸附材料，15 g中性氧化鋁吸附材料，10 g活性碳吸附材料于50 mL三角瓶中，混合均勻。
1.3.4 樣品前處理 準(zhǔn)確稱取2.0 g（精確至0.001 g）樣品，置于50 mL離心管中，準(zhǔn)確加入20 mL 0.5 mol/L鹽酸溶液，超聲提取30 min，然后于8000 r/min離心2 min，取2 mL上清液置于5 mL離心管中，加入50 mg多重吸附前處理吸附材料，漩渦混合30 s，于8000 r/min離心2 min。將1 mL上清液轉(zhuǎn)移至10 mL離心管中，加入9 mL水，漩渦混合30 s，過0.22 μm濾膜，供LC-MS/MS分析測定。若樣品中含量超出線性范圍，應(yīng)用樣品稀釋液稀釋至線性范圍后再進(jìn)行上機(jī)分析。
1.4色譜質(zhì)譜條件
1.4.1 色譜條件 色譜柱：ACQUITY UPLC BEH C18（150 mm×3.0 mm×1.7 μm）；流速：0.3 mL/min；柱溫：30℃；進(jìn)樣量：5 μL；流動(dòng)相及參考梯度洗脫程序見表1。
表1 流動(dòng)相及梯度洗脫程序
1.4.2 質(zhì)譜條件 質(zhì)譜采用電子噴霧離子源，正離子檢測方式，多反應(yīng)監(jiān)測（HRM）模式；噴霧電壓為3.0 Kv；霧化氣溫度為480℃；源溫度為150℃；霧化氣流速為600 L/hr；錐孔氣流速為5 L/hr；脫溶劑氣、錐孔氣、碰撞氣均為高純氮?dú)饧捌渌线m氣體，使用前應(yīng)調(diào)節(jié)各氣體流量以使質(zhì)譜靈敏度達(dá)到檢測要求。
2 結(jié)果與分析
2.1流動(dòng)相的優(yōu)化 參考鄧其馨等（2014）、李鵬飛（2013）和標(biāo)準(zhǔn)方法（GB 5009.169-2016和農(nóng)業(yè)部2483號公告-5-2016），分別選擇乙腈和甲醇作為流動(dòng)相進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。結(jié)果表明，當(dāng)使用甲醇作為流動(dòng)相的時(shí)候，在相同的條件下，離子化將受到不同程度的抑制，響應(yīng)值將會(huì)明顯的降低，導(dǎo)致靈敏度的下降；而使用乙腈作為流動(dòng)相時(shí)，離子化效率明顯優(yōu)于使用甲醇作為流動(dòng)相的情況，所以本實(shí)驗(yàn)采用乙腈為流動(dòng)相。使用優(yōu)化流動(dòng)相的典型色譜圖見圖1。
圖1 牛磺酸標(biāo)準(zhǔn)溶液（10 μg/mL）色譜質(zhì)譜圖
2.2監(jiān)測離子對的選擇 監(jiān)測離子對是串聯(lián)質(zhì)譜儀定性、定量的必要參數(shù)，因儀器型號不同而略有改變。以?；撬岬臉?biāo)準(zhǔn)溶液在ESI源正離子模式下掃描，選出信號相對較強(qiáng)的兩個(gè)碎片離子與其母離子分別組成兩對監(jiān)測離子對，在UPLC-MS/MS儀器的MRM模式下，實(shí)施對于錐孔電壓與碰撞能量等參數(shù)的進(jìn)一步優(yōu)化，優(yōu)化過后得到的MRM離子對和質(zhì)譜條件見表2。
表2 ?；撬豳|(zhì)譜參考值
2.3樣品前處理方法的確定
2.3.1 提取液及提取方式的選擇 由于?；撬崾撬苄晕镔|(zhì)，一般采用水溶液提取，但由于寵物飼料中蛋白質(zhì)、脂肪類物質(zhì)含量較高，簡單用水提取后，不能將?；撬岷偷鞍踪|(zhì)、脂肪類物質(zhì)有效分離，會(huì)影響檢測結(jié)果，故需要對前處理提取溶劑進(jìn)行篩選。蔡梅等（2013）研究發(fā)現(xiàn)，采用酸水解后將樣品基質(zhì)中的蛋白質(zhì)和脂肪等轉(zhuǎn)變?yōu)樗苄晕镔|(zhì)，可以提高回收率，但是過高的酸會(huì)影響檢測結(jié)果。因此，本實(shí)驗(yàn)比較了0.2~6 mol/L HCl溶液的提取效果，根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，最終選擇0.5 mol/L HCl作為提取液對樣品進(jìn)行提取，回收率和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差均能滿足方法學(xué)需要。確定了提取溶劑后，比較振蕩提取和超聲波提取對?；撬崽崛⌒实挠绊懀瑢Y(jié)果進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，2種提取方法無明顯差異。但為了節(jié)約時(shí)間，最終選用超聲處理。脂肪量低樣品或液體樣品中?；撬岬臏y定可用水提取或直接加水稀釋后測定。
2.3.2 凈化吸附材料的選擇 本實(shí)驗(yàn)選擇8種吸附材料（表3）對寵物飼料中的牛磺酸進(jìn)行吸附實(shí)驗(yàn)。稱取寵物飼料樣品25 g，加入100 mL提取液，離心，轉(zhuǎn)移至試劑瓶中。分別吸取3 mL提取液，加入0.3 mL 1 μg/mL?；撬針?biāo)準(zhǔn)溶液和50 mg吸附材料（材料比例），漩渦混合30 s，在搖床上振蕩10 min，離心5 min，取上清液過膜，上機(jī)檢測。同時(shí)吸取3 mL提取液，不加入吸附材料作為空白參考。用樣品溶液測定值與空白參考測定值的百分比值作為吸附率，吸附結(jié)果見圖2。
表3 吸附材料名稱與類型
圖2 不同吸附材料對寵物飼料中牛磺酸的保留率
結(jié)果表明，除了C18、Alumina和石墨碳外，其他大部分吸附材料對牛磺酸有一定的富集，但是其對?；撬嵛铰示陀?00%，無法作為富集材料使用。多重機(jī)制雜質(zhì)吸附（MIA）是一種基于基質(zhì)分散固相萃取的方法，該方法主要通過選擇多種功能化吸附材料，將樣品中的主要干擾雜質(zhì)吸附，有效地去除基體中可能存在的磷脂、色素等物質(zhì)，同時(shí)將被測物質(zhì)留在樣品溶液中，而達(dá)到凈化和富集的目的，可節(jié)省樣品前處理的時(shí)間（Suo，2021）。因此，選擇C18、Alumina和石墨碳作為多重機(jī)制雜質(zhì)吸附材料進(jìn)行下一步的研究。
2.3.3 前處理材料的比例和使用量的研究 根據(jù)不同材料的吸附特性，如石墨碳主要是物理性吸附，主要吸附氣體、色素類物質(zhì)；C18吸附填料主要吸附磷脂和中等極性的化合物；中性氧化鋁是物理性吸附，主要去除油脂類的類物質(zhì)。通過混合使用可以有效的去除寵物飼料的各種雜質(zhì)干擾，達(dá)到更好的凈化效果。從基質(zhì)凈化效果來看，石墨碳、C18和中性氧化鋁的比例為2∶2∶3，能有效地吸附雜質(zhì)，降低基質(zhì)效應(yīng)。
本研究同時(shí)考察了吸附材料的使用量，比較了5、10、20、50、80、100 mg不同固體吸附劑加入量對2 mL飼料提取液中雜質(zhì)凈化效果的影響。結(jié)果表明，當(dāng)固體吸附材料加入量達(dá)50 mg時(shí)，繼續(xù)加大吸附劑的用量對樣品雜質(zhì)的凈化效果和回收率無明顯改善。因此將吸附材料加入量設(shè)定為50 mg。當(dāng)加入吸附劑吸附凈化后，可以有效地除去基質(zhì)中的干擾物對待測物色譜峰的影響，同時(shí)減少雜質(zhì)對儀器和色譜柱的損害。
2.4線性、檢出限和定量限 根據(jù)1.4.2配制標(biāo)準(zhǔn)溶液并上機(jī)測定，根據(jù)3倍信噪比確定檢出限（LOD）、10倍信噪比確定定量限（LOQ），牛磺酸的標(biāo)準(zhǔn)曲線、檢出限和定量限見表4。
表4 ?；撬岬臉?biāo)準(zhǔn)曲線、檢出限和定量限
2.5回收率和精密度 在確定樣品前處理方法后，選擇有代表性的6種空白寵物飼料樣品作為研究對象，進(jìn)行加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)，以考察方法的準(zhǔn)確度和重現(xiàn)性。配制10、100 mg/kg和500 mg/kg三個(gè)濃度的試樣，每批次內(nèi)同一濃度做6次平行實(shí)驗(yàn)，共重復(fù)3批次，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表5。
表5 不同寵物飼料添加回收結(jié)果 %
從表5中可以看出，建立的檢測方法回收率＞85%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差＜10%，該方法可適用于不同種類寵物飼料中?；撬岷康臏y定。
2.6實(shí)際樣品分析 基于以上條件建立的檢測方法，對從市場上采集到的20份不同的寵物飼料樣品進(jìn)行檢測，檢測結(jié)果見表6。大部分?；撬岬臏y定結(jié)果比標(biāo)示值高，其原因可能是企業(yè)考慮到?；撬崽砑雍蟮牟环€(wěn)定因素，為了保證終產(chǎn)品中?；撬釢M足標(biāo)識量要求，一般在設(shè)計(jì)配方和實(shí)際生產(chǎn)時(shí)會(huì)適當(dāng)超出一定量添加牛磺酸，導(dǎo)致樣品的檢測結(jié)果高于產(chǎn)品標(biāo)示值。
表6 典型寵物飼料中?；撬釞z測結(jié)果
3 結(jié)論
本研究中通過對前處理?xiàng)l件及儀器條件參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化，建立了多重機(jī)制雜質(zhì)吸附萃取凈化結(jié)合液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)測定寵物飼料中?；撬岬姆椒?，該方法可滿足寵物飼料中?；撬岬姆治鲆?，且操作簡便、分析效率高，可用于相關(guān)樣品的日常檢測及監(jiān)控分析。
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