• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    基于血斑的9-CpG年齡推斷在浙江漢族中的驗(yàn)證及優(yōu)化

    2022-12-22 10:35:32高林林王科文李佑英徐紅偉周志全
    刑事技術(shù) 2022年6期
    關(guān)鍵詞:血斑甲基化定量

    高林林,王科文,李佑英,羅 俊,徐紅偉,周志全,王 琴,豐 蕾,*

    (1. 杭州市公安局刑事科學(xué)技術(shù)研究所,杭州 310006;2. 公安部鑒定中心,北京 100038;3. 杭州華碩司法鑒定中心,杭州 310006;4. 建德市公安局,浙江 建德 311600)

    個(gè)體的年齡推斷一直是法醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的研究熱點(diǎn),通過(guò)骨骼、牙齒等推斷個(gè)體年齡的方法[1-2],無(wú)法用于實(shí)際案件中遇到的各種組織及體液供者的年齡推斷;通過(guò)端粒長(zhǎng)度變化來(lái)推斷年齡的定量研究尚在摸索階段[3];通過(guò)DNA甲基化水平來(lái)推斷個(gè)體年齡的研究在國(guó)內(nèi)外均已有廣泛開(kāi)展[4-7]。本研究組前期通過(guò)不同年齡段的北方男性血液樣本建立了DNA甲基化水平的年齡推斷模型,通過(guò)質(zhì)譜方法可檢測(cè)9個(gè)CpG位點(diǎn)的甲基化值,該9-CpG年齡推斷模型與同類研究相比,不僅誤差值較小,且已有實(shí)戰(zhàn)應(yīng)用案例[8-9]。但由于原計(jì)算模型針對(duì)的是河北、北京、河南等北方漢族男性,對(duì)于如浙江等我國(guó)南部地區(qū)的人群,其生活習(xí)性和遺傳背景與北方漢族個(gè)體有顯著的差異,能否使用該模型推斷年齡尚需驗(yàn)證。隨著全國(guó)Y染色體STR數(shù)據(jù)庫(kù)的不斷建設(shè),在龐大復(fù)雜的家系排查中,若能推斷出現(xiàn)場(chǎng)遺留生物檢材所屬個(gè)體的年齡,則可大幅提升排查工作效率。因此本研究通過(guò)檢測(cè)血斑樣本,采用上述模型推斷浙江漢族個(gè)體的年齡,希冀驗(yàn)證并拓展9-CpG年齡推斷模型的適用性及范圍。儀、Quantif iler?Trio DNA定 量 試 劑 盒、NanoDrop 2000c分光光度計(jì)均購(gòu)自美國(guó)Thermo Scientif ic公司;Eppendorf Pro S PCR擴(kuò)增儀(Eppendorf公司,德國(guó));蝦堿性磷酸酶(Shrimp Alkaline Phosphatase,SAP)、 MassARRAY?Clean Resin、MassARRAY質(zhì)譜儀及EpiTYPER v1.3軟件均購(gòu)自美國(guó)Agena Bioscience公司。

    1 材料與方法

    1.1 樣本

    根據(jù)知情同意原則,采集浙江漢族男性及女性無(wú)關(guān)個(gè)體新鮮外周血樣本共196份(男100份,女96份),采樣經(jīng)公安部鑒定中心科研倫理委員會(huì)審核批準(zhǔn)。每份取約600 μL血液滴于三層折疊的白紗布上制成血斑紗布,陰干后室溫保存3~6個(gè)月。實(shí)戰(zhàn)中涉案人員的年齡分布大多集中在16~65歲,故采樣選取此年齡段個(gè)體且盡量每個(gè)年齡選取2人份,各年齡段樣本保持均等。樣本年齡段分組具體見(jiàn)圖1。

    圖1 樣本年齡分布Fig.1 Age distribution of sampled individuals (male/female:indicated with blue/mauve bar)

    1.2 主要試劑及儀器

    MagAttract?M48 DNA Manual 試 劑 盒(Qiagen公司,德國(guó));EZ DNA MethylationTM試劑盒(Zymo Research公司,美國(guó));QuantStudio5熒光定量PCR

    1.3 血斑DNA提取及定量

    剪取三層折疊血紗布上血斑約2.0 cm×2.0 cm,采 用MagAttract?M48 DNA Manual試 劑 盒 按 照 說(shuō)明書提取基因組DNA,洗脫體積為60 μL。采用NanoDrop 2000c分光光度計(jì)測(cè)定DNA濃度及純度,所有DNA模板保存至-20 ℃?zhèn)溆谩?/p>

    1.4 兩種定量方法的比較

    剪取男性及女性各13份樣本血紗布上血斑約1.0 cm×1.0 cm,采用1.3所述方法進(jìn)行DNA提取。取1 μL DNA模板采用NanoDrop 2000c分光光度計(jì)測(cè)定DNA質(zhì)量;取2 μL DNA模板采用Quantif iler?Trio DNA定量試劑盒以QuantStudio5實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀按照試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行DNA質(zhì)量測(cè)定。

    1.5 DNA甲基化轉(zhuǎn)化及定量

    取1 μg DNA樣本,若總量不足1 μg,則取45 μL DNA樣本,按照EZ DNA MethylationTM試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行重亞硫酸鹽處理,轉(zhuǎn)化后的DNA采用30 μL純水洗脫,并再次采用NanoDrop 2000c分光光度計(jì)測(cè)定轉(zhuǎn)化后的DNA質(zhì)量。

    1.6 PCR擴(kuò)增及SAP純化

    9對(duì)擴(kuò)增引物均按照文獻(xiàn)[8]進(jìn)行合成。擴(kuò)增體系為5 μL,其中10×PCR 緩沖液0.5 μL,dNTP 0.04 μL,5U PCR 聚合酶0.1 μL, 2 μmol/L 引物2.0 μL,轉(zhuǎn)化后DNA(bisulfite converted DNA,BS-DNA)2.36 μL。與文獻(xiàn)方法[10]相比,引物濃度由1 μmol/L增加到2 μmol/L,PCR 聚合物從0.09 μL增加到0.1 μL。擴(kuò)增程序及SAP純化均 按照文獻(xiàn)[10]進(jìn)行。

    1.7 轉(zhuǎn)錄及T裂解

    轉(zhuǎn)錄及T裂解體系為5 μL,按文獻(xiàn)[10]配比混勻, 加入SAP純化后產(chǎn)物4 μL,37 ℃孵育3 h。4 ℃存儲(chǔ)。

    1.8 樣本純化及質(zhì)譜檢測(cè)

    96孔PCR板的每孔內(nèi)加入36 μL不含RNA酶的水以及T裂解產(chǎn)物9 μL,混勻后離心15 min,質(zhì)譜儀的樹(shù)脂盒內(nèi)加入適量純化樹(shù)脂,并將芯片放置于相應(yīng)位置,采用MassARRAY系統(tǒng)進(jìn)行檢測(cè)。

    1.9 數(shù)據(jù)分析與統(tǒng)計(jì)

    轉(zhuǎn)化回收率計(jì)算方法: 轉(zhuǎn)化后得到的單鏈DNA總量與轉(zhuǎn)化前加入的雙鏈基因組DNA總量的百分比值。

    所有甲基化值采用EpiTYPER v1.3軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理,并按照已建立的線性回歸方程[8]進(jìn)行個(gè)體年齡預(yù)測(cè)計(jì)算。將預(yù)測(cè)結(jié)果與人員實(shí)際年齡進(jìn)行比對(duì),計(jì)算個(gè)體預(yù)測(cè)年齡與實(shí)際年齡差值絕對(duì)值的平均值即平均絕對(duì)偏差(mean absolute deviation, MAD)值;計(jì)算個(gè)體預(yù)測(cè)年齡與實(shí)際年齡差值的平均值即平均誤差(mean error,ME),正值表示高估、負(fù)值表示低估,評(píng)估已建模型[8]對(duì)本研究樣本的適用性。采用R軟件 “l(fā)m”函數(shù)建立多元線性回歸模型,采用IBM SPSS Statistics 23對(duì)所有處理數(shù)據(jù)作t檢驗(yàn)、單因素方差分析等。

    2 結(jié)果

    2.1 DNA定量及轉(zhuǎn)化回收率結(jié)果比較

    26份樣本同時(shí)用兩種不同的定量方法進(jìn)行DNA質(zhì)量測(cè)定后發(fā)現(xiàn),NanoDrop 2000c分光光度計(jì)所測(cè)定的DNA質(zhì)量均值為(9.15±4.45)ng/μL,而實(shí)時(shí)熒光PCR定量法獲得的DNA質(zhì)量均值為(3.79±2.80)ng/μL,兩者之間具有顯著性差異(P<0.05)。前者所測(cè)定的DNA量均值是后者均值的2.4倍。

    所有樣本提取及轉(zhuǎn)化后的DNA定量結(jié)果(NanoDrop 2000c分光光度計(jì)測(cè)定)、轉(zhuǎn)化回收率見(jiàn)表1。不同樣本提取得到的DNA及轉(zhuǎn)化后得到的DNA總量存在顯著性差異,樣本間的甲基化轉(zhuǎn)化回收率也有明顯差異。血斑提取得到的DNA濃度最低為11.90 ng/μL,最高可達(dá)205.70 ng/μL,平均OD值(按A260/A280測(cè)算)為1.69±0.16;進(jìn)行重亞硫酸鹽轉(zhuǎn)化的DNA總量最低為535.50 ng(11.90 ng/μL×45 μL),重亞硫酸鹽轉(zhuǎn)化后DNA(bisulf iteconverted DNA,BS-DNA)總量最低為153.00 ng(5.10 ng/μL×30 μL)。

    表1 不同樣本提取與轉(zhuǎn)化后DNA定量以及轉(zhuǎn)化回收率的比較Table 1 Quantity range of extracted genome DNA, bisulf ite-converted DNA and recovery rates

    為進(jìn)一步分析最低的基因組DNA用量,以最終PCR擴(kuò)增所需的BS-DNA量結(jié)合轉(zhuǎn)化回收率進(jìn)行計(jì)算。BS-DNA最低濃度為5.10 ng/μL,每個(gè)PCR反應(yīng)加入2.36 μL,共7個(gè)PCR反應(yīng),因此最低需要BS-DNA 84.00 ng。按照平均轉(zhuǎn)化回收率43%計(jì)算,最低的基因組DNA用量為195.00 ng,如果按照最高轉(zhuǎn)化回收率計(jì)算,則為112.00 ng。如果使用熒光定量PCR方法定量,最低基因組DNA用量可降為46.00 ng。

    2.2 9-CpG年齡推斷模型在浙江男性血斑樣本中的驗(yàn)證結(jié)果

    100份浙江漢族男性血斑樣本作為驗(yàn)證集,對(duì)已建立的9-CpG年齡推斷模型[8]進(jìn)行年齡驗(yàn)證,其驗(yàn)證結(jié)果見(jiàn)圖2。對(duì)于100份男性樣本來(lái)說(shuō),總體MAD值為2.95歲。按照年齡段分為5個(gè)組(A-E組),分 別 為16~25、26~35、36~45、46~55、56~65歲,分別統(tǒng)計(jì)MAD最小為2.70歲,最大為3.21歲,對(duì)于前4組(16~55歲),ME均為正值,第5組(56~65歲)為負(fù)值(見(jiàn)補(bǔ)充材料表S1)。從圖2可以看出,每組高估與低估的樣本個(gè)數(shù)基本相同。

    圖2 9-CpG年齡推斷原模型在男性樣本中實(shí)際年齡與預(yù)測(cè)年齡的散點(diǎn)圖Fig.2 Scattering dot plot obtained from actual age against the predicted with male samples by the 9-CpG age prediction model

    2.3 9-CpG年齡推斷模型在浙江女性血斑樣本中的驗(yàn)證結(jié)果

    96份浙江漢族女性血斑樣本在9個(gè)CpG位點(diǎn)測(cè)得的甲基化值采用已建立的9-CpG年齡推斷模型[8]進(jìn)行年齡計(jì)算,并與實(shí)際年齡進(jìn)行對(duì)比,總體MAD值為3.18歲(見(jiàn)圖3)。從補(bǔ)充材料表S2可以看出A—D組的個(gè)體推斷年齡均為高估,且每個(gè)組都只有個(gè)別樣本推斷年齡比實(shí)際年齡??;E組的預(yù)測(cè)年齡基本為低估,且ME值與前面四組比較,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=1.0×10-3)。為明確男性及女性樣本在模型驗(yàn)證中的差異,對(duì)男性及女性樣本各個(gè)位點(diǎn)的甲基化值進(jìn)行t檢驗(yàn),結(jié)果顯示CpG6、CpG7位點(diǎn)有顯著性差異(見(jiàn)補(bǔ)充材料表S3)。為進(jìn)一步優(yōu)化模型,在96份樣本中選取70%的樣本作為訓(xùn)練集,30%的樣本作為驗(yàn)證集,使用R軟件“l(fā)m”函數(shù)對(duì)原模型進(jìn)行調(diào)整優(yōu)化,優(yōu)化后的模型為:

    圖3 年齡推斷原模型在女性樣本中實(shí)際年齡與預(yù)測(cè)年齡的散點(diǎn)圖Fig.3 Scattering dot plot from actual age against the predicted with female samples by the 9-CpG age prediction model

    訓(xùn)練集和驗(yàn)證集的R2分別為0.94和0.93,MAD值分別為2.59歲和2.78歲(圖4)。對(duì)新模型與原模型的所有樣本預(yù)測(cè)年齡與實(shí)際年齡差值的絕對(duì)值進(jìn)行配對(duì)t檢驗(yàn),結(jié)果具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P=0.03),所有樣本采用新模型進(jìn)行年齡推斷計(jì)算所得總體MAD為2.65歲,其預(yù)測(cè)誤差值比原模型小0.53歲,新模型的預(yù)測(cè)準(zhǔn)確性更高。

    圖4 新建立的年齡推斷模型中實(shí)際年齡與預(yù)測(cè)年齡的散點(diǎn)圖Fig.4 Scattering dot plot from actual age against the predicted with the modif ied 9-CpG age prediction model

    在新模型中,96份女性樣本在上述的分組中,各組之間的MAD值較為均一,與原預(yù)測(cè)模型相比,其預(yù)測(cè)準(zhǔn)確度均有提升,且通過(guò)配對(duì)t檢驗(yàn),顯示MAD值在兩種預(yù)測(cè)模型中存在顯著性差異(見(jiàn)表2)。

    表2 兩種預(yù)測(cè)模型MAD的比較Table 2 Comparison of MAD between two prediction approaches

    3 討論

    本文采用EpiTYPER技術(shù)平臺(tái)對(duì)浙江漢族個(gè)體的血斑樣本進(jìn)行供者年齡推斷研究,驗(yàn)證以前建立的多元線性回歸模型的檢材適應(yīng)性與適用人群范圍?;贒NA甲基化的年齡推斷在法醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的研究已有很多報(bào)道,在不同的研究中,CpG位點(diǎn)的選擇與組合不盡相同,而且采用的預(yù)測(cè)模型也各有不同。有學(xué)者專門比較了基于血液樣本的6種預(yù)測(cè)模型,發(fā)現(xiàn)不同的預(yù)測(cè)模型,其預(yù)測(cè)準(zhǔn)確度存在差異。多元線性回歸模型可最大程度保留原始數(shù)據(jù),且應(yīng)用最為廣泛,適于低樣本量數(shù)據(jù)建模[11]。EpiTYPER技術(shù)平臺(tái)也是DNA甲基化研究中定量檢測(cè)常用的方法,通過(guò)交叉驗(yàn)證比較發(fā)現(xiàn)其所獲得的數(shù)據(jù)準(zhǔn)確性及重復(fù)性均較高[8]。

    血斑DNA樣本的甲基化檢測(cè)具有挑戰(zhàn)性。Suchiman等認(rèn)為采用EpiTYPER技術(shù)平臺(tái)檢測(cè)DNA甲基化時(shí),要想獲得較好的檢測(cè)結(jié)果,提取高純度及高分子量的基因組DNA非常重要,OD值比(A260/A280)應(yīng)在1.7~2.0之間[12]。由于附有紗布載體,本文中血斑DNA的OD值比平均為1.69±0.16,因此在進(jìn)行PCR擴(kuò)增時(shí),為了提高擴(kuò)增效率, 增加了0.05U聚合酶以及引物濃度調(diào)整為2.0 μmol/L。重亞硫酸鹽處理是甲基化檢測(cè)非常重要的一步,與常規(guī)血液樣本DNA相比,由于血斑提取到的DNA質(zhì)量較差,轉(zhuǎn)化回收率對(duì)于后續(xù)檢測(cè)更為重要。針對(duì)血液樣本DNA來(lái)說(shuō),Sam等學(xué)者比較了6種不同的重亞硫酸鹽轉(zhuǎn)化商業(yè)試劑盒,發(fā)現(xiàn)不同的試劑盒轉(zhuǎn)化回收率差異較大[13],但是對(duì)于血斑樣本DNA尚無(wú)相關(guān)報(bào)道。本文采用EZ DNA MethylationTM轉(zhuǎn)化試劑盒發(fā)現(xiàn)不同樣本間的DNA轉(zhuǎn)化回收率差異明顯,最高可達(dá)75.35%,最低僅為11.05%。

    本研究中100份浙江漢族男性血斑樣本推斷年齡MAD值為2.95歲,與基于血液樣本建立的北方地區(qū)男性個(gè)體年齡的預(yù)測(cè)準(zhǔn)確性(MAD=2.89歲)基本一致,而且不同年齡組間的MAD值無(wú)顯著性差異,顯示9-CpG年齡推斷適用于浙江地域的男性血斑樣本的年齡推斷。前期建立的9-CpG年齡推斷模型針對(duì)的是男性漢族個(gè)體,本研究發(fā)現(xiàn)直接使用該模型計(jì)算女性漢族個(gè)體的年齡普遍存在高估,因此性別會(huì)影響年齡推斷結(jié)果。盡管有一些研究結(jié)果與本文不一致,如:Bekaert通過(guò)4個(gè)年齡相關(guān)位點(diǎn)檢測(cè)了105份男性樣本和101份女性樣本發(fā)現(xiàn)所建立的年齡推斷模型無(wú)性別差異[14];Correia Dias等通過(guò)對(duì)51份葡萄牙人血液樣本(男性18份,女性35份)的檢驗(yàn),也未發(fā)現(xiàn)男女樣本間的MAD值有明顯差異[15];國(guó)內(nèi)孫曉萌等通過(guò)男女樣本各40例在年齡偏差上的對(duì)比,同樣顯示無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異[16],但筆者分析認(rèn)為可能與上述研究選取的樣本量小、CpG位點(diǎn)選取差異有關(guān)。有學(xué)者通過(guò)Illumina 450K陣列進(jìn)行全基因組甲基化測(cè)序,發(fā)現(xiàn)男性和女性個(gè)體與年齡相關(guān)的CpG位點(diǎn)不同,即使相同的CpG位點(diǎn),其相關(guān)系數(shù)也存在差異[17]。

    本研究中發(fā)現(xiàn)CpG6、CpG7這兩個(gè)位點(diǎn)的甲基化值在男性樣本與女性樣本間存在著顯著性差異,導(dǎo)致原模型不適用于女性樣本。使用96份女性樣本重建線性回歸模型,總體MAD下降了0.53歲,且不同年齡組間的MAD值較為均衡,最小為2.24歲,最大為2.90歲。

    本文采用分光光度計(jì)測(cè)定的單管PCR擴(kuò)增的BS-DNA量最低為12.0 ng,這個(gè)用量比LEE等[18]報(bào)道的采用SNaPshot技術(shù)進(jìn)行甲基化DNA檢測(cè)所需的BS-DNA量(>5.0 ng)稍高。但如果是采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR法進(jìn)行測(cè)定,其BS-DNA的量也能降為5.0 ng。分光光度計(jì)測(cè)定DNA質(zhì)量不僅快速且不需任何實(shí)驗(yàn)試劑耗材,在大批量樣本的研究中具有優(yōu)勢(shì),但其準(zhǔn)確度易受到RNA、蛋白質(zhì)的影響。而實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀在一線法醫(yī)DNA實(shí)驗(yàn)室中的使用更為普遍,其測(cè)量精度也較高,但是必須使用專門的定量試劑盒,定量成本較為昂貴。

    本文在研究大批量樣本中采用了分光光度計(jì),通過(guò)兩種不同定量方法的比較,能為一線DNA技術(shù)人員利用血斑樣本進(jìn)行DNA甲基化年齡推斷提供參考數(shù)據(jù)與借鑒。有效提高DNA轉(zhuǎn)化回收率將是我們下一步研究的內(nèi)容,期望可進(jìn)一步拓展9-CpG年齡推斷模型在現(xiàn)場(chǎng)血斑檢材和樣本中的應(yīng)用。

    補(bǔ)充材料

    與本文相關(guān)的補(bǔ)充數(shù)據(jù)見(jiàn):http://www.xsjs-cifs.com/CN/abstract/abstract6981.shtml。

    猜你喜歡
    血斑甲基化定量
    濾紙干血斑用于脊髓性肌萎縮癥基因篩查方法的建立?
    新生兒遺傳代謝性疾病篩查干血斑制備及儲(chǔ)存影響因素研究*
    顯微定量法鑒別林下山參和園參
    “新篩”干血斑在耳聾基因檢測(cè)中的應(yīng)用
    當(dāng)歸和歐當(dāng)歸的定性與定量鑒別
    中成藥(2018年12期)2018-12-29 12:25:44
    10 種中藥制劑中柴胡的定量測(cè)定
    中成藥(2017年6期)2017-06-13 07:30:35
    犬血斑STR直接擴(kuò)增體系研究
    慢性HBV感染不同狀態(tài)下HBsAg定量的臨床意義
    鼻咽癌組織中SYK基因啟動(dòng)子區(qū)的甲基化分析
    胃癌DNA甲基化研究進(jìn)展
    一进一出抽搐gif免费好疼| 99热6这里只有精品| xxx96com| 白带黄色成豆腐渣| 亚洲国产精品sss在线观看| 亚洲熟妇中文字幕五十中出| 麻豆国产av国片精品| 欧洲精品卡2卡3卡4卡5卡区| 色老头精品视频在线观看| 亚洲精品一区av在线观看| 亚洲成av片中文字幕在线观看| 成人午夜高清在线视频 | 精品不卡国产一区二区三区| 两个人免费观看高清视频| 黄频高清免费视频| 国产真实乱freesex| 最近最新中文字幕大全电影3 | 淫秽高清视频在线观看| 国产成人av教育| 制服人妻中文乱码| 亚洲五月色婷婷综合| av在线播放免费不卡| 啦啦啦 在线观看视频| 久久天躁狠狠躁夜夜2o2o| 99久久综合精品五月天人人| 欧美精品啪啪一区二区三区| 亚洲精品久久成人aⅴ小说| 日本免费a在线| aaaaa片日本免费| 日日摸夜夜添夜夜添小说| 亚洲精品中文字幕在线视频| 亚洲成av片中文字幕在线观看| 99riav亚洲国产免费| 色av中文字幕| 老司机在亚洲福利影院| 久久天堂一区二区三区四区| 午夜福利视频1000在线观看| xxx96com| 亚洲一区二区三区色噜噜| 18禁国产床啪视频网站| 久久午夜亚洲精品久久| 国产激情偷乱视频一区二区| 午夜福利在线在线| 国产伦人伦偷精品视频| 欧美日韩亚洲国产一区二区在线观看| 亚洲精品一卡2卡三卡4卡5卡| 午夜福利欧美成人| 啪啪无遮挡十八禁网站| 国产aⅴ精品一区二区三区波| av免费在线观看网站| 一区福利在线观看| 在线观看免费日韩欧美大片| 国产精品电影一区二区三区| av天堂在线播放| 国产一区二区三区在线臀色熟女| 国产视频内射| 搞女人的毛片| 久久亚洲精品不卡| 国产av又大| 黄片播放在线免费| 妹子高潮喷水视频| 精品久久久久久久毛片微露脸| 国产麻豆成人av免费视频| 国产激情欧美一区二区| 亚洲精品在线观看二区| 最近最新中文字幕大全免费视频| 久久午夜综合久久蜜桃| 12—13女人毛片做爰片一| 老汉色av国产亚洲站长工具| 免费在线观看亚洲国产| 在线观看舔阴道视频| 亚洲 国产 在线| 国产精品日韩av在线免费观看| 国产极品粉嫩免费观看在线| 成人永久免费在线观看视频| 日韩欧美一区二区三区在线观看| 中国美女看黄片| 国产高清videossex| 久久国产精品影院| 免费高清视频大片| 很黄的视频免费| 欧美日本视频| 国产精品香港三级国产av潘金莲| 一区二区三区精品91| 精品第一国产精品| 亚洲av成人不卡在线观看播放网| 搡老妇女老女人老熟妇| 亚洲欧洲精品一区二区精品久久久| 在线观看66精品国产| 色综合亚洲欧美另类图片| 黄片大片在线免费观看| 99国产精品99久久久久| 久久狼人影院| tocl精华| 中文资源天堂在线| 亚洲国产毛片av蜜桃av| 人成视频在线观看免费观看| 日韩欧美在线二视频| 黄色成人免费大全| 99在线人妻在线中文字幕| 久99久视频精品免费| 热re99久久国产66热| 人人妻,人人澡人人爽秒播| 香蕉丝袜av| 女人被狂操c到高潮| 超碰成人久久| 国产精品,欧美在线| 两性夫妻黄色片| 国产精品野战在线观看| 美女大奶头视频| cao死你这个sao货| 久久国产精品人妻蜜桃| 欧美一区二区精品小视频在线| 91成年电影在线观看| 欧美丝袜亚洲另类 | 精品久久久久久久人妻蜜臀av| 国产精品久久久久久亚洲av鲁大| 免费搜索国产男女视频| 黄色毛片三级朝国网站| 男人舔奶头视频| 叶爱在线成人免费视频播放| 国产高清videossex| 色哟哟哟哟哟哟| 亚洲av日韩精品久久久久久密| 夜夜夜夜夜久久久久| 欧美 亚洲 国产 日韩一| 国产又色又爽无遮挡免费看| 国产熟女午夜一区二区三区| 不卡av一区二区三区| 草草在线视频免费看| 午夜免费激情av| 看免费av毛片| 国产真人三级小视频在线观看| 中国美女看黄片| 日韩大尺度精品在线看网址| 亚洲国产毛片av蜜桃av| 久久午夜亚洲精品久久| 亚洲最大成人中文| 一进一出好大好爽视频| 麻豆国产av国片精品| 国产亚洲精品av在线| 精华霜和精华液先用哪个| 国产精品 国内视频| 久久热在线av| 精品久久久久久,| 久久亚洲真实| 亚洲中文日韩欧美视频| 久久 成人 亚洲| 最好的美女福利视频网| 俺也久久电影网| 日日摸夜夜添夜夜添小说| 亚洲成人精品中文字幕电影| 国产av又大| 成人一区二区视频在线观看| 99re在线观看精品视频| 中文字幕人妻熟女乱码| 国产乱人伦免费视频| www.999成人在线观看| 国产麻豆成人av免费视频| 不卡av一区二区三区| 免费电影在线观看免费观看| 黄色片一级片一级黄色片| 一本大道久久a久久精品| 国内揄拍国产精品人妻在线 | 欧美精品亚洲一区二区| 91成年电影在线观看| 国产亚洲欧美精品永久| 午夜福利高清视频| 母亲3免费完整高清在线观看| 男女那种视频在线观看| 亚洲国产精品sss在线观看| 亚洲精品久久国产高清桃花| 亚洲国产欧美网| 午夜福利欧美成人| 精品无人区乱码1区二区| 国产精品国产高清国产av| 在线免费观看的www视频| 国产成人一区二区三区免费视频网站| 欧美成人午夜精品| 亚洲精品中文字幕一二三四区| 精品第一国产精品| 日韩 欧美 亚洲 中文字幕| 91国产中文字幕| 久久久久免费精品人妻一区二区 | www国产在线视频色| 中文亚洲av片在线观看爽| 视频区欧美日本亚洲| 成熟少妇高潮喷水视频| 嫩草影视91久久| 亚洲av熟女| 怎么达到女性高潮| 午夜福利一区二区在线看| bbb黄色大片| 成年版毛片免费区| 国产精品自产拍在线观看55亚洲| 一进一出抽搐动态| 亚洲av中文字字幕乱码综合 | 国产97色在线日韩免费| 亚洲成人久久性| 亚洲欧美一区二区三区黑人| 波多野结衣巨乳人妻| 久久精品夜夜夜夜夜久久蜜豆 | 首页视频小说图片口味搜索| 亚洲精品中文字幕在线视频| 日韩av在线大香蕉| 在线国产一区二区在线| 天堂动漫精品| www.熟女人妻精品国产| 在线视频色国产色| 午夜老司机福利片| 亚洲电影在线观看av| 少妇裸体淫交视频免费看高清 | 黄色毛片三级朝国网站| 免费av毛片视频| 午夜老司机福利片| 午夜两性在线视频| 国产一区二区三区在线臀色熟女| 精品久久久久久久久久免费视频| 久久人人精品亚洲av| 高清毛片免费观看视频网站| 岛国在线观看网站| videosex国产| 久久久久精品国产欧美久久久| 日韩免费av在线播放| 免费人成视频x8x8入口观看| 人妻丰满熟妇av一区二区三区| 久久久国产欧美日韩av| 一进一出抽搐动态| 亚洲国产高清在线一区二区三 | 欧美久久黑人一区二区| 亚洲第一av免费看| 97超级碰碰碰精品色视频在线观看| 亚洲精品一卡2卡三卡4卡5卡| 91成年电影在线观看| 久久午夜综合久久蜜桃| 99re在线观看精品视频| 十分钟在线观看高清视频www| 黑人巨大精品欧美一区二区mp4| 淫秽高清视频在线观看| 啦啦啦韩国在线观看视频| 美女免费视频网站| 18禁黄网站禁片午夜丰满| 又黄又爽又免费观看的视频| videosex国产| 观看免费一级毛片| 久热这里只有精品99| 国产日本99.免费观看| 久久精品91蜜桃| 欧美日韩乱码在线| 国内精品久久久久精免费| 99re在线观看精品视频| 国产精品亚洲av一区麻豆| 国产一级毛片七仙女欲春2 | 天天躁夜夜躁狠狠躁躁| 青草久久国产| 少妇 在线观看| 黄色视频,在线免费观看| 亚洲在线自拍视频| 国产精品久久久久久精品电影 | 久久中文看片网| 久久久久国产一级毛片高清牌| 麻豆久久精品国产亚洲av| 老鸭窝网址在线观看| netflix在线观看网站| 色综合亚洲欧美另类图片| 亚洲一区高清亚洲精品| 神马国产精品三级电影在线观看 | 黄色丝袜av网址大全| 欧美日本亚洲视频在线播放| 18禁黄网站禁片午夜丰满| 午夜两性在线视频| 国产精品久久视频播放| 亚洲一区二区三区不卡视频| 亚洲人成77777在线视频| 久久国产精品人妻蜜桃| 亚洲激情在线av| 狂野欧美激情性xxxx| 精品电影一区二区在线| 精品欧美国产一区二区三| 白带黄色成豆腐渣| 国产成人精品久久二区二区91| 色综合婷婷激情| 岛国视频午夜一区免费看| 国产亚洲欧美精品永久| 久久国产精品男人的天堂亚洲| 日韩有码中文字幕| 亚洲成人久久性| 俺也久久电影网| 亚洲色图av天堂| 国产精品av久久久久免费| 精品国产乱子伦一区二区三区| 少妇被粗大的猛进出69影院| 午夜福利成人在线免费观看| 国产真人三级小视频在线观看| 老司机午夜十八禁免费视频| 天天躁夜夜躁狠狠躁躁| 在线观看免费午夜福利视频| 一进一出抽搐gif免费好疼| 嫁个100分男人电影在线观看| 曰老女人黄片| 两个人视频免费观看高清| 91在线观看av| 欧美日韩中文字幕国产精品一区二区三区| 99精品在免费线老司机午夜| 国产欧美日韩精品亚洲av| 国产片内射在线| 欧美一区二区精品小视频在线| 十八禁人妻一区二区| 婷婷亚洲欧美| 最近最新中文字幕大全免费视频| 在线十欧美十亚洲十日本专区| 听说在线观看完整版免费高清| 一级毛片女人18水好多| 十八禁网站免费在线| 伦理电影免费视频| 国产私拍福利视频在线观看| 丰满人妻熟妇乱又伦精品不卡| 日韩 欧美 亚洲 中文字幕| 亚洲免费av在线视频| 国内少妇人妻偷人精品xxx网站 | 色播亚洲综合网| 熟妇人妻久久中文字幕3abv| 少妇裸体淫交视频免费看高清 | 亚洲精品一卡2卡三卡4卡5卡| 亚洲欧美一区二区三区黑人| 757午夜福利合集在线观看| 天天添夜夜摸| av电影中文网址| 淫秽高清视频在线观看| 91在线观看av| 久久人妻福利社区极品人妻图片| 香蕉久久夜色| 91av网站免费观看| 不卡av一区二区三区| 欧美日韩亚洲综合一区二区三区_| 波多野结衣巨乳人妻| 99在线人妻在线中文字幕| 50天的宝宝边吃奶边哭怎么回事| 天堂√8在线中文| 日本一本二区三区精品| 亚洲熟妇中文字幕五十中出| 欧美最黄视频在线播放免费| 国产欧美日韩精品亚洲av| 国产在线精品亚洲第一网站| 国产91精品成人一区二区三区| 一卡2卡三卡四卡精品乱码亚洲| 美女免费视频网站| 亚洲精品国产一区二区精华液| 无遮挡黄片免费观看| e午夜精品久久久久久久| 99国产极品粉嫩在线观看| 国产麻豆成人av免费视频| 午夜福利高清视频| 久99久视频精品免费| 久久久久久免费高清国产稀缺| a在线观看视频网站| 久久国产精品影院| 大香蕉久久成人网| 一级黄色大片毛片| 91国产中文字幕| 一区二区三区激情视频| 国产欧美日韩一区二区精品| 少妇粗大呻吟视频| 午夜老司机福利片| 久久人人精品亚洲av| 亚洲免费av在线视频| 亚洲专区中文字幕在线| 三级毛片av免费| 18禁观看日本| 99热6这里只有精品| 神马国产精品三级电影在线观看 | 在线观看舔阴道视频| 露出奶头的视频| 亚洲av片天天在线观看| 少妇裸体淫交视频免费看高清 | 国产伦一二天堂av在线观看| 国产黄色小视频在线观看| 国产伦在线观看视频一区| 俄罗斯特黄特色一大片| 色婷婷久久久亚洲欧美| 久久天躁狠狠躁夜夜2o2o| 麻豆成人av在线观看| 精品久久久久久久末码| 国产亚洲精品久久久久久毛片| 嫁个100分男人电影在线观看| 日韩中文字幕欧美一区二区| 一本一本综合久久| 欧美一区二区精品小视频在线| 日韩有码中文字幕| av天堂在线播放| av片东京热男人的天堂| 18禁黄网站禁片免费观看直播| 精品日产1卡2卡| 中文字幕人成人乱码亚洲影| svipshipincom国产片| 国产欧美日韩一区二区三| 亚洲国产中文字幕在线视频| 欧美黑人精品巨大| xxx96com| 日本免费一区二区三区高清不卡| 黄片大片在线免费观看| 国产一区二区三区视频了| 欧美日韩乱码在线| 欧美乱码精品一区二区三区| 亚洲精品中文字幕一二三四区| 激情在线观看视频在线高清| 欧美成人一区二区免费高清观看 | 国产亚洲精品一区二区www| 岛国视频午夜一区免费看| 91大片在线观看| 中文字幕人妻丝袜一区二区| 成人欧美大片| 黄色视频,在线免费观看| 搞女人的毛片| 色精品久久人妻99蜜桃| 国产99白浆流出| 精品熟女少妇八av免费久了| 国产亚洲精品第一综合不卡| 成人三级做爰电影| 国产免费av片在线观看野外av| 成人18禁高潮啪啪吃奶动态图| 亚洲国产欧洲综合997久久, | 男女之事视频高清在线观看| av免费在线观看网站| 午夜福利视频1000在线观看| 久久精品人妻少妇| 免费在线观看亚洲国产| 女人高潮潮喷娇喘18禁视频| 欧美日韩亚洲国产一区二区在线观看| 午夜福利欧美成人| 亚洲国产中文字幕在线视频| 久久亚洲精品不卡| 高清在线国产一区| 国产又色又爽无遮挡免费看| 九色国产91popny在线| 一二三四社区在线视频社区8| 真人做人爱边吃奶动态| 天天添夜夜摸| 人人妻人人看人人澡| 亚洲av成人av| 搡老熟女国产l中国老女人| 嫩草影院精品99| 亚洲欧美日韩高清在线视频| 日韩欧美三级三区| 中文字幕高清在线视频| 两个人视频免费观看高清| 在线观看66精品国产| 制服诱惑二区| 最好的美女福利视频网| 国产久久久一区二区三区| 日韩欧美三级三区| 久久久久久久久中文| 精品免费久久久久久久清纯| 欧美成人午夜精品| 脱女人内裤的视频| 黑丝袜美女国产一区| 久久久久国产精品人妻aⅴ院| 一级片免费观看大全| 999久久久精品免费观看国产| 女警被强在线播放| 美女大奶头视频| 在线播放国产精品三级| 啦啦啦 在线观看视频| 女人爽到高潮嗷嗷叫在线视频| 亚洲av熟女| 夜夜看夜夜爽夜夜摸| 中文字幕人妻熟女乱码| 亚洲精品在线观看二区| 午夜福利成人在线免费观看| 99精品欧美一区二区三区四区| 久久国产亚洲av麻豆专区| 叶爱在线成人免费视频播放| 少妇 在线观看| 在线观看日韩欧美| 18禁黄网站禁片免费观看直播| 国产人伦9x9x在线观看| 国产精品九九99| 国产亚洲精品一区二区www| 男女视频在线观看网站免费 | 日韩三级视频一区二区三区| 国产精品亚洲美女久久久| 色精品久久人妻99蜜桃| 日韩免费av在线播放| 国产v大片淫在线免费观看| 亚洲成人国产一区在线观看| 啦啦啦韩国在线观看视频| 日韩欧美免费精品| 一级黄色大片毛片| 国产国语露脸激情在线看| 美女午夜性视频免费| 亚洲人成网站高清观看| 久久久精品欧美日韩精品| 午夜激情av网站| 久9热在线精品视频| 亚洲成人精品中文字幕电影| 最新美女视频免费是黄的| 亚洲中文av在线| 亚洲一卡2卡3卡4卡5卡精品中文| 日本免费一区二区三区高清不卡| 99久久国产精品久久久| 97碰自拍视频| 夜夜夜夜夜久久久久| 久久国产乱子伦精品免费另类| 亚洲第一欧美日韩一区二区三区| 国产成人系列免费观看| 精品日产1卡2卡| 丰满的人妻完整版| 久久国产精品人妻蜜桃| 天堂√8在线中文| 亚洲午夜理论影院| 91av网站免费观看| 欧美不卡视频在线免费观看 | 久久精品国产99精品国产亚洲性色| 一a级毛片在线观看| 国产av一区在线观看免费| 久久中文看片网| 中文字幕久久专区| 亚洲中文av在线| 女人爽到高潮嗷嗷叫在线视频| 免费女性裸体啪啪无遮挡网站| 超碰成人久久| 欧美黑人巨大hd| 日韩中文字幕欧美一区二区| 别揉我奶头~嗯~啊~动态视频| 成人国产一区最新在线观看| 亚洲人成伊人成综合网2020| 男女午夜视频在线观看| 亚洲欧美精品综合久久99| 两个人免费观看高清视频| 午夜久久久久精精品| 亚洲av成人av| 一级毛片高清免费大全| 90打野战视频偷拍视频| 热re99久久国产66热| АⅤ资源中文在线天堂| 中文字幕久久专区| 精品免费久久久久久久清纯| 老汉色∧v一级毛片| 精品久久蜜臀av无| 天堂√8在线中文| 亚洲国产精品合色在线| 欧美色视频一区免费| www日本黄色视频网| 免费观看精品视频网站| 99国产精品一区二区蜜桃av| 999久久久国产精品视频| 一卡2卡三卡四卡精品乱码亚洲| 亚洲精品粉嫩美女一区| 午夜激情av网站| 久久久精品国产亚洲av高清涩受| 一进一出好大好爽视频| 国产亚洲精品一区二区www| 亚洲五月婷婷丁香| 丁香欧美五月| 国产精品电影一区二区三区| 夜夜爽天天搞| 欧美+亚洲+日韩+国产| 亚洲avbb在线观看| 色综合站精品国产| 亚洲五月色婷婷综合| 国产亚洲欧美98| 国产成年人精品一区二区| 99国产精品一区二区三区| 麻豆成人午夜福利视频| 亚洲国产看品久久| 久久 成人 亚洲| 色精品久久人妻99蜜桃| 2021天堂中文幕一二区在线观 | 亚洲九九香蕉| 亚洲精品国产区一区二| 午夜福利成人在线免费观看| 女性生殖器流出的白浆| 少妇 在线观看| 97超级碰碰碰精品色视频在线观看| 在线免费观看的www视频| 欧美 亚洲 国产 日韩一| 一级作爱视频免费观看| 久久婷婷人人爽人人干人人爱| 黑人操中国人逼视频| 青草久久国产| 一a级毛片在线观看| 热re99久久国产66热| 午夜免费激情av| 18禁黄网站禁片免费观看直播| 丁香六月欧美| 丝袜人妻中文字幕| 天天躁狠狠躁夜夜躁狠狠躁| 国产精品电影一区二区三区| 中亚洲国语对白在线视频| 男女午夜视频在线观看| 高潮久久久久久久久久久不卡| 日韩av在线大香蕉| 国产精品影院久久| 亚洲人成网站高清观看| 亚洲aⅴ乱码一区二区在线播放 | 俄罗斯特黄特色一大片| 麻豆久久精品国产亚洲av| 国产久久久一区二区三区| 叶爱在线成人免费视频播放| 老司机靠b影院| 精品久久蜜臀av无| 国产精品日韩av在线免费观看| 日本a在线网址| 男人舔女人的私密视频| 精品久久久久久久久久久久久 | 久久国产亚洲av麻豆专区| 这个男人来自地球电影免费观看| 亚洲欧美日韩无卡精品| 国产激情偷乱视频一区二区| 久久久久九九精品影院| 啦啦啦免费观看视频1| 人人妻人人看人人澡| 欧美乱妇无乱码| 日韩欧美一区视频在线观看| 国产亚洲精品av在线|