• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    犬血斑STR直接擴(kuò)增體系研究

    2016-12-22 01:55:24杜蔚安劉超楊前勇葉俊華
    刑事技術(shù) 2016年4期
    關(guān)鍵詞:血斑單鏈基因座

    錢 水,杜蔚安,劉超,楊前勇,葉俊華

    (1.佛山市公安司法鑒定中心,廣東 佛山528000;2.南方醫(yī)科大學(xué)法醫(yī)學(xué)系,廣州510000;3.廣州市刑事科學(xué)技術(shù)研究所,廣州510080;4.公安部南昌警犬基地,南昌330100)

    犬血斑STR直接擴(kuò)增體系研究

    錢 水1,*,杜蔚安2,劉超3,楊前勇4,葉俊華4

    (1.佛山市公安司法鑒定中心,廣東 佛山528000;2.南方醫(yī)科大學(xué)法醫(yī)學(xué)系,廣州510000;3.廣州市刑事科學(xué)技術(shù)研究所,廣州510080;4.公安部南昌警犬基地,南昌330100)

    目的 構(gòu)建犬血斑DNA的直接擴(kuò)增體系。方法 依據(jù)犬17A STR熒光復(fù)合擴(kuò)增體系(包含基因座DAmel、PEZ1、PEZ2、PEZ3、PEZ5、PEZ6、PEZ8、PEZ12、PEZ15、PEZ20、PEZ21、FH2010、FH2054、FH2079、FH2132、FH2611以及VWFX),通過優(yōu)化PCR反應(yīng)組分和濃度,對(duì)犬血斑進(jìn)行直接擴(kuò)增,用ABI 3130遺傳分析儀檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物。結(jié)果 16個(gè)STR基因座和1個(gè)性別決定基因座均得到擴(kuò)增,整體平衡,結(jié)果 穩(wěn)定。結(jié)論 優(yōu)化后的犬17 ASTR基因座熒光復(fù)合擴(kuò)增體系可以對(duì)犬血斑進(jìn)行直接擴(kuò)增。

    犬;STR基因座;血斑;直接擴(kuò)增

    STR復(fù)合擴(kuò)增分析現(xiàn)已成為犬個(gè)體識(shí)別和親權(quán)鑒定的主要方法,在犬的檔案管理、遺傳育種及涉犬案件處理中發(fā)揮著重要作用[1-3]。

    犬血斑是目前犬類鑒定最常見的樣本來源,但其含有許多抑制PCR順利進(jìn)行的成分[4],如血紅素、血紅蛋白及載體雜質(zhì)等,因此在進(jìn)行常規(guī)PCR擴(kuò)增前必須對(duì)犬血斑進(jìn)行DNA提取純化以除去其中的抑制成分,但這個(gè)步驟將至少需要2~3h,且過程繁瑣又極易污染,會(huì)耗費(fèi)大量人力物力,不適合大規(guī)模的DNA檢測(cè)分析。

    本研究依據(jù)犬17A STR熒光復(fù)合擴(kuò)增體系,通過優(yōu)化PCR反應(yīng)組分配方,成功克服了上述PCR抑制因素的影響,可無需經(jīng)DNA提取和純化處理便對(duì)犬血斑進(jìn)行直接擴(kuò)增和檢測(cè)。

    1 材料和方法

    1.1 材料

    1.1.1 樣本

    80份犬血斑取自公安部南昌警犬基地,均在- 20℃保存。

    1.1.2 主要儀器

    MJ公司PTC200型溫度梯度PCR儀,ABI 3130遺傳分析儀。

    1.1.3 主要試劑

    犬17A STR熒光檢測(cè)試劑盒(無錫中德美聯(lián)生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品,內(nèi)含2.5×Reaction Mix、5×DPrimers 17A、5U/μL的 熱 啟 動(dòng)C-Taq酶 和AGCU Marker SIZ-500),SSB(單鏈結(jié)合蛋白,上海晶天生物)和BSA(小牛血清白蛋白,羅氏生物)。全部試劑均為分子生物學(xué)級(jí)。

    1.2 實(shí)驗(yàn)方法

    1.2.1 血斑處理

    于犬血斑兩邊浸透區(qū)域,用1.2 mm打孔器取下1片備用。同時(shí)采用Chelex-100法[5]提取基因組DNA作為對(duì)照。

    1.2.2 PCR 復(fù)合擴(kuò)增

    犬17A STR熒光復(fù)合擴(kuò)增檢測(cè)體系采用25μL標(biāo)準(zhǔn)反應(yīng)設(shè)置,其中含有10μ L Reaction Mix(各組分反應(yīng)終濃度為10 mmol/L Tris-HCl、50 mmol/L KCl、2.5 mmol/L MgCl2、0.25 mmol/L dNTP Mix),5μ L DPrimers 17A引物混合物以及1μ L熱啟動(dòng)C-Taq酶,1片1.2 mm犬血斑樣本或2μ L犬基因組DNA,在反應(yīng)體系中加入不同濃度的SSB和BSA(表1),以水補(bǔ)充至25μL,充分混勻后短暫離心。

    表1 反應(yīng)體系中SSB和BSA的反應(yīng)終濃度Table 1 Final concentrations of SSB and BSA in reaction solution

    1.2.3 PCR 擴(kuò)增程序

    95℃預(yù)變性2min;94℃變性1min,62℃退火1min,72℃延伸1min,共10個(gè)循環(huán);90℃變性1min,60℃退火1min,72℃延伸1min,共20個(gè)循環(huán);最后60℃延伸45min。

    1.2.4 PCR 產(chǎn)物檢測(cè)及數(shù)據(jù)收集

    擴(kuò)增產(chǎn)物10000 r/min離心1min,取1μ L加入到10μL上樣緩沖液中(內(nèi)含9.5μL去離子甲酰胺和0.5μL分子量?jī)?nèi)標(biāo)AGCU Marker SIZ-500),振蕩混勻,在ABI 3130遺傳分析儀上進(jìn)行毛細(xì)管電泳檢測(cè),使用GeneMapperv3.2軟件對(duì)電泳結(jié)果進(jìn)行分型。

    2 結(jié)果

    犬基因組提取的DNA,經(jīng)犬17A STR熒光復(fù)合擴(kuò)增常規(guī)體系擴(kuò)增可以得到完整分型,而血斑直擴(kuò)則完全得不到分型結(jié)果。但當(dāng)體系中同時(shí)加入SSB和BSA,隨著這兩種加入物質(zhì)的濃度不斷提高,血斑樣本各基因座的擴(kuò)增效率也逐漸提高。在SSB反應(yīng)濃度達(dá)4mg/mL、BSA的為0.3 mg/mL時(shí),血斑的直接擴(kuò)增結(jié)果達(dá)最佳,各基因座分型均衡,整體效果與Chelex-100法提取的犬基因組DNA相當(dāng)(圖1)。不過,SSB和BSA濃度再增加,即便至6 mg/mL和0.6 mg/mL時(shí),直擴(kuò)效果卻并不再有顯著變化。

    圖1 1.2mm狗血斑隨不同SSB和BSA濃度增加的擴(kuò)增結(jié)果(提取的狗基因組DNA不加SSB和BSA的直接擴(kuò)增結(jié)果作為對(duì)照)Fig.1 Amplification of the 1.2mm-diameter dog's bloodstain with the addition of concentration-different SSB and BSA into its PCR reactions (controlled by the Chelex-100-extracted dog genomic DNA without addition of SSB and BSA)

    因而,可確定犬血斑直擴(kuò)體系中SSB和BSA的反應(yīng)終濃度分別為4 mg/mL和0.3 mg/mL。按此對(duì)80份犬血斑進(jìn)行直接擴(kuò)增,結(jié)果顯示16個(gè)STR基因座和1個(gè)性別決定基因座均得到擴(kuò)增,且各個(gè)基因座擴(kuò)增均衡,無非特異性峰(圖2),與采用Chelex-100法提取的犬基因組DNA擴(kuò)增結(jié)果沒有明顯差異。

    3 討論

    DNA提取和純化是STR復(fù)合擴(kuò)增除去PCR抑制劑的最常用方法。相關(guān)方法已多有報(bào)道[6],市面上也有很多商業(yè)化的試劑盒,如Promega公司的DNA IQTM系統(tǒng)。但DNA提取純化是一個(gè)極其耗費(fèi)人力、物力的過程,而且還會(huì)增加樣本之間的污染。目前公安機(jī)關(guān)在建立犯罪人員DNA數(shù)據(jù)庫(kù)時(shí)均采用商品化的免提取直接擴(kuò)增試劑盒,但犬血斑DNA的直接擴(kuò)增罕有研究和報(bào)道。

    犬血斑所含的血紅素、血紅蛋白和載體雜質(zhì)等非DNA成分會(huì)影響DNA聚合酶和模板DNA的結(jié)合,或者因其螯合Mg2+而使DNA聚合酶失去活性,從而阻止DNA新鏈[7]的合成。

    根據(jù)上述抑制劑的作用機(jī)理,本研究在犬STR復(fù)合擴(kuò)增反應(yīng)體系中加入單鏈結(jié)合蛋白SSB,由于它可以結(jié)合在DNA聚合酶復(fù)制叉前的單鏈區(qū),從而防止新變性生成的單鏈DNA復(fù)性回雙鏈,而同時(shí)加入的BSA作為一種蛋白保護(hù)劑又能抵抗血紅素、血紅蛋白等雜質(zhì)對(duì)DNA聚合酶的抑制作用,而維持其熱穩(wěn)定性[4],故在SSB和BSA這兩種添加劑最佳反應(yīng)濃度下,犬血斑直擴(kuò)的PCR抑制因素就被減弱或完全消除,保證了犬血斑免DNA提取的直接擴(kuò)增成功實(shí)現(xiàn)。

    圖2 1.2mm某犬血斑按最佳條件直擴(kuò)的結(jié)果圖譜Fig.2 Genotype of one dog's 1.2mm-diameter bloodstain subjected to direct PCR amplification under optimal conditions

    4 結(jié)論

    本研究經(jīng)自主構(gòu)建犬17A STR熒光復(fù)合擴(kuò)增體系,并在其中加入SSB(終濃度4 mg/mL)和BSA(終濃度0.3 mg/mL),實(shí)現(xiàn)了犬血斑無需DNA提取的直接擴(kuò)增,整體均衡,結(jié)果穩(wěn)定。

    [1] 李英碧, 吳謹(jǐn), 侯一平, 等. STR基因座熒光標(biāo)記復(fù)合擴(kuò)增檢測(cè)及其法醫(yī)學(xué)應(yīng)用[J]. 法醫(yī)學(xué)雜志, 2005, 21(2): 96-99.

    [2] 胡萌,姜成濤,葉健,等.犬3個(gè)STR基因座遺傳多態(tài)性研究[J]. 中國(guó)人民公安大學(xué)學(xué)報(bào), 2006, 2: 31-33.

    [3] K. De Munnynck, W. Van de Voorde. Forensic approach of fatal dog attacks: a case report and literature review[J]. Int. J. Legal Med, 2002, 116: 295-300.

    [4] A. Akane, K. Matsubara, H. Nakamura, et al. Identification of the heme compound co-purified with deoxyribonucleicacid (DNA) from bloodstains, a major inhibitor of polymerase chain reaction (PCR) amplification[J]. J. Forensic Sci., 1994, 39(2): 362-372.

    [5] 公安部第二研究所編寫組.法醫(yī)物證檢驗(yàn)技術(shù)及應(yīng)用[M] .北京: 人民法院出版社, 1997: 333.

    [6] Burckhardt J. Amplification of DNA from whole blood[J]. PCR Meth. Appl., 1994, 3: 239-243.

    [7] Yamamoto Y, Shinozuka T, Kameyama H, et al. DNA typing with drop PCR kit for human blood[in Japanese]. DNA Polymorphism, 1999, 7: 75-78.

    Direct Amplification of STRs from Canine Bloodstains

    QIAN Shui1, DU Weian2, LIU Chao3, YANG Qianyong4, YE Junhua4
    (1. Foshan Municipal Public Security Bureau, Foshan 528000, China; 2. Department of Forensic Medicine, Southern Medical University, Guangzhou 510000, China; 3. Guangzhou Institute of Criminal Science and Technology, Guangzhou 510080, China;
    4. Nanchang Police Dog Base, Ministry of Public Security, Nanchang 330100, China)

    Objective To establish a direct amplification system of STRs from canine bloodstains.Methods Based on canine 17A STR fluorescent multiplex amplification system consisting of the loci of DAmel, PEZ1, PEZ2, PEZ3, PEZ5, PEZ6, PEZ8, PEZ12, PEZ15, PEZ20, PEZ21, FH2010, FH2054, FH2079, FH2132, FH2611 and the VWFX, a sex determinant, the PCR was optimized at its reaction components and concentrations, and the STR genotypes of the dog's samples were detected with ABI 3130 Genetic Analyzer. Results All of the above 17 STR loci have been amplified with overall balance and reliance. Conclusion The optimal canine 17A STR loci fluorescent multiplex PCR system is capable of direct amplification for canine bloodstains.

    canine; short tandem repeats (STRs);bloodstains; direct amplification

    DF795.2

    A

    1008-3650(2016)04-0289-03

    2015-09-21

    格式:錢水,杜蔚安,劉超,等.犬血斑STR直接擴(kuò)增體系研究[J]. 刑事技術(shù),2016,41(4):289-291.

    10.16467/j.1008-3650.2016.04.008

    錢水(1979—),男,湖南湘鄉(xiāng)人,碩士,主檢法醫(yī)師,研究方向?yàn)榉ㄡt(yī)物證。E-mail:qshui_jj@163.com

    猜你喜歡
    血斑單鏈基因座
    濾紙干血斑用于脊髓性肌萎縮癥基因篩查方法的建立?
    新生兒遺傳代謝性疾病篩查干血斑制備及儲(chǔ)存影響因素研究*
    “新篩”干血斑在耳聾基因檢測(cè)中的應(yīng)用
    逐步添加法制備單鏈環(huán)狀DNA的影響因素探究*
    賽馬蹄血斑的發(fā)病原因分析與防治
    鹽酸克倫特羅生物素化單鏈抗體在大腸埃希氏菌中的表達(dá)
    急性淋巴細(xì)胞白血病單鏈抗體(scFv)的篩選與鑒定
    DXS101基因座稀有等位基因的確認(rèn)1例
    臨夏回族自治州撒拉族人群15個(gè)STR基因座遺傳多態(tài)性
    DYF387S1基因座分型異常現(xiàn)象
    食管疾病(2015年3期)2015-12-05 01:45:11
    男人的好看免费观看在线视频| 三级毛片av免费| 国产精品国产三级专区第一集| 国产一级毛片在线| 日韩亚洲欧美综合| 精品久久久久久电影网 | 国产三级中文精品| 中文在线观看免费www的网站| 免费搜索国产男女视频| 高清日韩中文字幕在线| 国产老妇女一区| 国产美女午夜福利| 免费播放大片免费观看视频在线观看 | 亚洲成人av在线免费| 建设人人有责人人尽责人人享有的 | 99久久成人亚洲精品观看| 欧美xxxx黑人xx丫x性爽| 波野结衣二区三区在线| 真实男女啪啪啪动态图| 麻豆国产97在线/欧美| 最近中文字幕2019免费版| 国产色爽女视频免费观看| 我要搜黄色片| 色综合亚洲欧美另类图片| 国产精品一区二区性色av| 久久久久久久久中文| 中文字幕亚洲精品专区| 男人的好看免费观看在线视频| 国产成人精品婷婷| 91久久精品电影网| 欧美激情国产日韩精品一区| 最近手机中文字幕大全| 欧美精品国产亚洲| 国产成人午夜福利电影在线观看| 午夜福利成人在线免费观看| 啦啦啦啦在线视频资源| 日韩制服骚丝袜av| 亚洲成人av在线免费| 老师上课跳d突然被开到最大视频| 亚洲欧美一区二区三区国产| av卡一久久| 青春草亚洲视频在线观看| 色噜噜av男人的天堂激情| 少妇高潮的动态图| 国产精品一区二区三区四区免费观看| 在线播放无遮挡| 九九爱精品视频在线观看| 一边亲一边摸免费视频| 欧美日韩一区二区视频在线观看视频在线 | 久久久久九九精品影院| 久久久久精品久久久久真实原创| 国产av一区在线观看免费| 日韩高清综合在线| 免费看美女性在线毛片视频| 久久欧美精品欧美久久欧美| 日韩一本色道免费dvd| 人人妻人人澡欧美一区二区| 国产精品国产高清国产av| videos熟女内射| 亚洲在线自拍视频| 久久草成人影院| 建设人人有责人人尽责人人享有的 | 波野结衣二区三区在线| 久久精品国产99精品国产亚洲性色| eeuss影院久久| 国产免费一级a男人的天堂| 国产精品久久久久久久电影| 中文亚洲av片在线观看爽| 中文在线观看免费www的网站| 能在线免费看毛片的网站| 成人特级av手机在线观看| 久久久久久伊人网av| 国产 一区精品| 91午夜精品亚洲一区二区三区| 欧美最新免费一区二区三区| av专区在线播放| 特大巨黑吊av在线直播| 免费观看性生交大片5| 在线免费观看的www视频| 亚洲成人精品中文字幕电影| 国产一级毛片七仙女欲春2| 亚洲欧美日韩东京热| 国产精品电影一区二区三区| 最近最新中文字幕大全电影3| 久久久国产成人精品二区| 欧美色视频一区免费| 少妇猛男粗大的猛烈进出视频 | 国内精品宾馆在线| 少妇猛男粗大的猛烈进出视频 | 久久这里有精品视频免费| 中文在线观看免费www的网站| 蜜桃亚洲精品一区二区三区| 熟女人妻精品中文字幕| 久久久精品94久久精品| 日本免费一区二区三区高清不卡| 女人久久www免费人成看片 | 2022亚洲国产成人精品| 亚洲成av人片在线播放无| 中文在线观看免费www的网站| 晚上一个人看的免费电影| 精品久久久久久成人av| 亚洲国产精品久久男人天堂| 午夜精品国产一区二区电影 | 又黄又爽又刺激的免费视频.| 美女被艹到高潮喷水动态| 亚洲精品一区蜜桃| 成人性生交大片免费视频hd| 久久综合国产亚洲精品| 99热网站在线观看| 亚洲一级一片aⅴ在线观看| 一本—道久久a久久精品蜜桃钙片 精品乱码久久久久久99久播 | 精品一区二区免费观看| 国产精品综合久久久久久久免费| 亚洲国产精品合色在线| 熟妇人妻久久中文字幕3abv| 少妇熟女aⅴ在线视频| 熟女电影av网| .国产精品久久| 日本免费一区二区三区高清不卡| 91aial.com中文字幕在线观看| 亚洲av.av天堂| 高清av免费在线| 亚洲精品国产成人久久av| 97超视频在线观看视频| av播播在线观看一区| 永久网站在线| 成人一区二区视频在线观看| 亚洲不卡免费看| 欧美潮喷喷水| 人妻制服诱惑在线中文字幕| 夫妻性生交免费视频一级片| 啦啦啦观看免费观看视频高清| 亚洲精品456在线播放app| 极品教师在线视频| 一级爰片在线观看| 人人妻人人看人人澡| 九九爱精品视频在线观看| 99热6这里只有精品| 亚洲人与动物交配视频| 日韩 亚洲 欧美在线| 免费在线观看成人毛片| 麻豆av噜噜一区二区三区| 亚洲欧美一区二区三区国产| 亚洲欧美中文字幕日韩二区| 国产精品久久视频播放| 热99re8久久精品国产| 一边摸一边抽搐一进一小说| 少妇裸体淫交视频免费看高清| av在线天堂中文字幕| 狂野欧美激情性xxxx在线观看| 亚洲18禁久久av| 国产亚洲91精品色在线| av又黄又爽大尺度在线免费看 | 精品久久久久久久久av| 国产欧美另类精品又又久久亚洲欧美| 日韩欧美三级三区| 精品午夜福利在线看| 一本—道久久a久久精品蜜桃钙片 精品乱码久久久久久99久播 | 久久久久久久午夜电影| 亚洲国产欧洲综合997久久,| 亚洲国产精品专区欧美| 国产熟女欧美一区二区| 我的老师免费观看完整版| 亚洲精品日韩在线中文字幕| 人人妻人人澡欧美一区二区| 国产一区亚洲一区在线观看| 99久久精品热视频| 国产亚洲5aaaaa淫片| 伦理电影大哥的女人| 美女脱内裤让男人舔精品视频| 亚洲精品亚洲一区二区| 精品久久久久久久久亚洲| 国产精品精品国产色婷婷| 久久久久久大精品| 少妇裸体淫交视频免费看高清| 两个人视频免费观看高清| 国产亚洲精品久久久com| 中文字幕制服av| 欧美变态另类bdsm刘玥| 免费观看精品视频网站| 国产在线一区二区三区精 | 欧美一级a爱片免费观看看| 日日摸夜夜添夜夜添av毛片| 国产精品一区二区三区四区免费观看| 日韩欧美 国产精品| 亚洲av中文av极速乱| 日韩一本色道免费dvd| 亚洲精品日韩av片在线观看| 成人三级黄色视频| 高清av免费在线| 69人妻影院| 简卡轻食公司| 乱码一卡2卡4卡精品| 精品少妇黑人巨大在线播放 | 色哟哟·www| 亚洲精品国产成人久久av| 69人妻影院| 久久国内精品自在自线图片| 国产人妻一区二区三区在| 亚洲国产精品国产精品| 尾随美女入室| 国产免费福利视频在线观看| 欧美日韩在线观看h| 国产精品.久久久| 国产精品.久久久| 老师上课跳d突然被开到最大视频| 亚洲aⅴ乱码一区二区在线播放| 丰满人妻一区二区三区视频av| 日韩强制内射视频| av在线天堂中文字幕| av国产久精品久网站免费入址| 亚洲欧美日韩高清专用| 99热这里只有是精品在线观看| 亚洲图色成人| www.av在线官网国产| 国产精品.久久久| 插逼视频在线观看| 九九在线视频观看精品| 国产精品综合久久久久久久免费| 2022亚洲国产成人精品| eeuss影院久久| 亚州av有码| 嫩草影院精品99| av卡一久久| 1024手机看黄色片| 韩国高清视频一区二区三区| 亚洲国产成人一精品久久久| 国产色爽女视频免费观看| 天堂av国产一区二区熟女人妻| 搞女人的毛片| 免费av不卡在线播放| 国产女主播在线喷水免费视频网站 | 亚洲欧美中文字幕日韩二区| 国产视频内射| 亚洲人成网站高清观看| 在线观看66精品国产| 欧美bdsm另类| 18禁在线播放成人免费| 菩萨蛮人人尽说江南好唐韦庄 | 久久久精品94久久精品| 麻豆成人午夜福利视频| 啦啦啦观看免费观看视频高清| 欧美日韩一区二区视频在线观看视频在线 | av福利片在线观看| 精品人妻偷拍中文字幕| 日韩欧美三级三区| 一边摸一边抽搐一进一小说| 亚洲精品456在线播放app| 国产精品不卡视频一区二区| 高清午夜精品一区二区三区| 亚洲中文字幕一区二区三区有码在线看| 亚洲av二区三区四区| 亚洲第一区二区三区不卡| 国产三级在线视频| 国产一区二区亚洲精品在线观看| 春色校园在线视频观看| 国产又黄又爽又无遮挡在线| 欧美不卡视频在线免费观看| 亚洲第一区二区三区不卡| 婷婷色麻豆天堂久久 | 一区二区三区乱码不卡18| 欧美3d第一页| 老女人水多毛片| 国产高清不卡午夜福利| 久久亚洲精品不卡| 久久韩国三级中文字幕| 91精品国产九色| 国产精品人妻久久久久久| 日本-黄色视频高清免费观看| 美女国产视频在线观看| 成人无遮挡网站| 一级av片app| 国产亚洲精品av在线| 国产三级中文精品| 久久久久久久午夜电影| 国产片特级美女逼逼视频| 大又大粗又爽又黄少妇毛片口| 久久久久国产网址| 日本-黄色视频高清免费观看| 久久国产乱子免费精品| 噜噜噜噜噜久久久久久91| 久99久视频精品免费| 免费观看精品视频网站| 在线观看av片永久免费下载| 亚洲精品亚洲一区二区| 色噜噜av男人的天堂激情| 淫秽高清视频在线观看| 最近手机中文字幕大全| 亚洲人成网站在线播| 国产伦理片在线播放av一区| 边亲边吃奶的免费视频| 美女国产视频在线观看| 亚洲av熟女| a级毛色黄片| 国产大屁股一区二区在线视频| 亚洲在久久综合| 亚洲精品aⅴ在线观看| 久久精品久久久久久噜噜老黄 | 99热这里只有精品一区| 国产亚洲精品av在线| 三级国产精品欧美在线观看| 久久精品久久久久久噜噜老黄 | 欧美一级a爱片免费观看看| 少妇高潮的动态图| 久久欧美精品欧美久久欧美| 爱豆传媒免费全集在线观看| 丝袜美腿在线中文| 国产精品一二三区在线看| 青春草视频在线免费观看| 夫妻性生交免费视频一级片| 精品人妻视频免费看| 国产一区二区亚洲精品在线观看| 99久久九九国产精品国产免费| 联通29元200g的流量卡| 在线a可以看的网站| 美女国产视频在线观看| 日本一二三区视频观看| 久久久久久久久中文| 精品不卡国产一区二区三区| 亚洲精品日韩在线中文字幕| 七月丁香在线播放| 欧美成人一区二区免费高清观看| 亚洲图色成人| 网址你懂的国产日韩在线| 美女大奶头视频| 亚洲精品乱久久久久久| 观看美女的网站| 亚洲人与动物交配视频| 午夜精品一区二区三区免费看| 永久免费av网站大全| 日韩欧美三级三区| 久99久视频精品免费| 少妇的逼水好多| 日日啪夜夜撸| 最近中文字幕高清免费大全6| 综合色丁香网| 免费看日本二区| www.av在线官网国产| 精品一区二区免费观看| 一本一本综合久久| 看黄色毛片网站| 免费看a级黄色片| 18禁在线播放成人免费| 成人性生交大片免费视频hd| 国产免费又黄又爽又色| 精品国产露脸久久av麻豆 | 亚洲图色成人| h日本视频在线播放| 色综合亚洲欧美另类图片| 久久国内精品自在自线图片| 国产在视频线在精品| 看十八女毛片水多多多| 久久久成人免费电影| 日韩欧美精品免费久久| 最近最新中文字幕大全电影3| 边亲边吃奶的免费视频| 嫩草影院精品99| 女的被弄到高潮叫床怎么办| 国产av码专区亚洲av| 国产一区二区在线av高清观看| 亚洲欧美精品综合久久99| 色网站视频免费| 爱豆传媒免费全集在线观看| 亚洲精品国产av成人精品| 午夜精品一区二区三区免费看| 久久欧美精品欧美久久欧美| 噜噜噜噜噜久久久久久91| 人妻系列 视频| 亚洲最大成人中文| 国产精品,欧美在线| 国产人妻一区二区三区在| 日韩成人伦理影院| 亚洲欧美成人综合另类久久久 | 99热这里只有是精品50| 麻豆成人av视频| 日韩中字成人| 好男人视频免费观看在线| 久久久久久久亚洲中文字幕| 国产免费一级a男人的天堂| 中国国产av一级| 免费看av在线观看网站| 91狼人影院| 汤姆久久久久久久影院中文字幕 | 免费无遮挡裸体视频| 色综合亚洲欧美另类图片| 亚洲欧美清纯卡通| 99热精品在线国产| 神马国产精品三级电影在线观看| 嫩草影院新地址| 中文字幕免费在线视频6| 少妇高潮的动态图| 变态另类丝袜制服| 国产精品久久久久久久久免| 日本熟妇午夜| 五月伊人婷婷丁香| 亚洲国产精品成人综合色| 直男gayav资源| 久久精品91蜜桃| 国产精品久久久久久精品电影| 丝袜美腿在线中文| 亚洲欧美精品综合久久99| 岛国毛片在线播放| 男人舔女人下体高潮全视频| 国产高清有码在线观看视频| 内地一区二区视频在线| 精品国产一区二区三区久久久樱花 | 欧美性猛交╳xxx乱大交人| 色视频www国产| 久久鲁丝午夜福利片| 亚洲一级一片aⅴ在线观看| 精品无人区乱码1区二区| 亚洲经典国产精华液单| 亚洲av免费在线观看| 国产69精品久久久久777片| 欧美人与善性xxx| 亚洲怡红院男人天堂| 久久国内精品自在自线图片| 啦啦啦观看免费观看视频高清| 2022亚洲国产成人精品| 欧美xxxx黑人xx丫x性爽| a级一级毛片免费在线观看| 搡女人真爽免费视频火全软件| 国产精品久久久久久精品电影小说 | 亚洲婷婷狠狠爱综合网| 久久精品熟女亚洲av麻豆精品 | 看十八女毛片水多多多| 国产成人免费观看mmmm| 18禁裸乳无遮挡免费网站照片| 精品久久久久久久久久久久久| 深夜a级毛片| 午夜福利成人在线免费观看| 在线天堂最新版资源| 天美传媒精品一区二区| 久久久久久久亚洲中文字幕| 国产乱人视频| av卡一久久| 天堂av国产一区二区熟女人妻| 亚洲怡红院男人天堂| 国产中年淑女户外野战色| 欧美最新免费一区二区三区| 亚洲最大成人av| 精品人妻一区二区三区麻豆| 久久久午夜欧美精品| 性插视频无遮挡在线免费观看| 久久精品熟女亚洲av麻豆精品 | 国产欧美日韩精品一区二区| 日韩中字成人| 少妇人妻精品综合一区二区| 国产熟女欧美一区二区| 久久久久久久久久黄片| 非洲黑人性xxxx精品又粗又长| 亚洲色图av天堂| 国国产精品蜜臀av免费| 欧美另类亚洲清纯唯美| 三级国产精品欧美在线观看| 综合色丁香网| 亚洲人成网站高清观看| 国产午夜精品久久久久久一区二区三区| 丰满少妇做爰视频| 97超碰精品成人国产| 免费av毛片视频| 99热6这里只有精品| 在线天堂最新版资源| 精品免费久久久久久久清纯| 天堂av国产一区二区熟女人妻| 午夜a级毛片| 99在线视频只有这里精品首页| 麻豆成人av视频| 色吧在线观看| 99热这里只有是精品在线观看| 夫妻性生交免费视频一级片| 国产精品爽爽va在线观看网站| 亚洲精品乱码久久久v下载方式| 蜜臀久久99精品久久宅男| 日本一二三区视频观看| 日韩,欧美,国产一区二区三区 | 99久久人妻综合| 日本免费一区二区三区高清不卡| 18禁在线播放成人免费| 日本一本二区三区精品| 日本午夜av视频| 日韩 亚洲 欧美在线| 中文亚洲av片在线观看爽| 狠狠狠狠99中文字幕| 成人午夜精彩视频在线观看| 97超视频在线观看视频| 亚洲久久久久久中文字幕| 日韩av在线免费看完整版不卡| 亚洲va在线va天堂va国产| 国产探花极品一区二区| 丰满乱子伦码专区| 青春草视频在线免费观看| 日日撸夜夜添| 欧美另类亚洲清纯唯美| 成人三级黄色视频| 日韩 亚洲 欧美在线| 中文亚洲av片在线观看爽| 校园人妻丝袜中文字幕| 精品国内亚洲2022精品成人| 日韩中字成人| 精品人妻熟女av久视频| 高清午夜精品一区二区三区| 一二三四中文在线观看免费高清| 国产又色又爽无遮挡免| 亚洲内射少妇av| 亚洲在线自拍视频| 国产成人免费观看mmmm| 国产一级毛片在线| 男人舔奶头视频| 亚洲四区av| 亚洲经典国产精华液单| 一个人免费在线观看电影| 人人妻人人看人人澡| 精品久久国产蜜桃| 夜夜爽夜夜爽视频| 国产成人免费观看mmmm| 精品久久久久久成人av| 精品人妻视频免费看| 免费在线观看成人毛片| 久久久久久九九精品二区国产| 99久国产av精品国产电影| 精品不卡国产一区二区三区| 六月丁香七月| 免费看光身美女| 欧美一区二区亚洲| 大又大粗又爽又黄少妇毛片口| 日日撸夜夜添| 别揉我奶头 嗯啊视频| 国产精品无大码| 久久精品夜色国产| 成人毛片60女人毛片免费| 国产精华一区二区三区| 九九在线视频观看精品| 国产成人a∨麻豆精品| 亚洲最大成人中文| 嫩草影院新地址| 国产探花极品一区二区| 国产精品爽爽va在线观看网站| 国产精品电影一区二区三区| 高清日韩中文字幕在线| 晚上一个人看的免费电影| 自拍偷自拍亚洲精品老妇| 久久人人爽人人片av| 91午夜精品亚洲一区二区三区| 久久久国产成人免费| 1000部很黄的大片| 日韩亚洲欧美综合| 熟女电影av网| 色播亚洲综合网| 欧美激情国产日韩精品一区| 狂野欧美激情性xxxx在线观看| av专区在线播放| 国产国拍精品亚洲av在线观看| 国产精品麻豆人妻色哟哟久久 | 日产精品乱码卡一卡2卡三| 51国产日韩欧美| 国产爱豆传媒在线观看| 国产片特级美女逼逼视频| 亚洲国产高清在线一区二区三| 国产精品久久视频播放| 黄色日韩在线| av在线天堂中文字幕| a级一级毛片免费在线观看| 麻豆国产97在线/欧美| 青春草视频在线免费观看| av免费在线看不卡| 国产精品永久免费网站| 男人舔女人下体高潮全视频| 国产精品久久久久久久久免| 只有这里有精品99| 久久久久性生活片| 精品人妻偷拍中文字幕| 中文乱码字字幕精品一区二区三区 | 男人的好看免费观看在线视频| 亚洲精品乱码久久久久久按摩| 久久久久九九精品影院| 熟女电影av网| 国产精品熟女久久久久浪| 中文亚洲av片在线观看爽| 亚洲高清免费不卡视频| av天堂中文字幕网| 国产亚洲精品久久久com| 亚洲欧美精品自产自拍| 亚洲欧美清纯卡通| 亚洲欧美精品自产自拍| 久久久国产成人免费| 国产精品一区二区性色av| 欧美色视频一区免费| 人妻夜夜爽99麻豆av| 在线免费十八禁| 亚洲av中文av极速乱| 三级国产精品片| 亚洲激情五月婷婷啪啪| 欧美xxxx性猛交bbbb| 日韩av在线免费看完整版不卡| 非洲黑人性xxxx精品又粗又长| 亚洲av中文av极速乱| 热99re8久久精品国产| 亚洲乱码一区二区免费版| 久热久热在线精品观看| 国内揄拍国产精品人妻在线| 99久久成人亚洲精品观看| av又黄又爽大尺度在线免费看 | 国产白丝娇喘喷水9色精品| av卡一久久| 欧美区成人在线视频| 国产亚洲精品久久久com| 国产一级毛片七仙女欲春2| 男人和女人高潮做爰伦理| 国产精品综合久久久久久久免费| 国产精品一区www在线观看| 天天躁夜夜躁狠狠久久av| 建设人人有责人人尽责人人享有的 | 国产乱来视频区| 汤姆久久久久久久影院中文字幕 |