氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法檢驗乙蒜素

李 婧，何貴琴，褚瑩瑩，劉艷艷

(1. 安徽省公安廳物證鑒定中心，合肥 230061；2.蚌埠市公安司法鑒定中心，安徽 蚌埠 233000；3.安徽大禹儀器有限公司，合肥 230061)

乙蒜素（Ethylicin）是一種廣譜性殺菌劑，分子式為C4H10O2S2，分子量為154.251，CAS號為682-91-7。乙蒜素純品為微黃色或無色油狀液體，沸點為56 ℃，140 ℃易分解，在酸性溶液中穩(wěn)定，但在堿性條件下不穩(wěn)定，可溶于乙醚、氯仿、乙醇和苯等多種有機溶劑，有較強的腐蝕性，強揮發(fā)性，具有醋酸和大蒜臭味[1]。乙蒜素結構式見圖1，為我國首創(chuàng)農(nóng)藥新品種，價格低，按照我國農(nóng)藥毒性分級標準，屬于中等毒性，國內(nèi)中毒致死案例少見[2-3]。目前，國內(nèi)對乙蒜素常用檢測方法為氣相色譜/氫火焰離子化檢測器（GC/FID）[4]，氣相色譜/電子捕獲檢測器（GC/ECD）[5]和高效液相色譜（HPLC） 法[6]，由于其在140℃時易分解，所以國內(nèi)乙蒜素的GC-MS法相關報道很少，且質(zhì)譜定性時均缺少乙蒜素的關鍵特征離子碎片154[7-8]。本文利用GC-MS法對乙蒜素進行檢測研究，填補了國內(nèi)這方面檢驗的空白，并對乙蒜素農(nóng)藥中毒案件中相關檢材進行檢測，為案件偵查和定性提供技術支撐。

圖1 乙蒜素結構式Fig.1 The structure of ethylicin

1 材料與方法

1.1 儀器、試劑與材料

氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀GC-MS-QP 2010 plus（日本島津公司）。

乙蒜素標準品（98.4%，國家農(nóng)藥產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗中心）；二氯甲烷、氯仿、環(huán)己烷（均為分析純，汕頭市西隴化工廠有限公司）；乙醇（色譜純，上海阿拉丁生化科技股份有限公司）；磷酸氫二鈉（分析純，國藥集團化學試劑有限公司）；檸檬酸（分析純，煙臺市雙雙化工有限公司）。

1.2 分析條件

儀 器 條 件：RTX-5MS（30 m×0.25 mm×0.25 μm）彈性石英毛細柱；柱溫：初始溫度50 ℃，保持1 min，以10 ℃/min升至160 ℃，保持3 min；載氣：高純He，流速：1 mL/min，分流比：2∶1；進樣口溫度：140 ℃，傳輸線溫度：140 ℃，離子源溫度：200 ℃；電子轟擊離子源：70 eV，掃描方式：SCAN，質(zhì)量采集范圍：m/z45～200 amu，溶劑延遲：3 min。

1.3 標準溶液的配制

精確移取乙蒜素標準品適量，用乙醇配制成濃度為1.0 mg/mL的標準物質(zhì)儲備液，密封，置于冰箱中冷凍保存?zhèn)溆?，乙蒜素標準物質(zhì)工作液由儲備液配制得到。

1.4 樣品前處理

1.4.1 樣品前處理

取胃內(nèi)容物2.0 g，勻漿化，加入0.5 mL磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖溶液（pH=3.0），加入二氯甲烷6.0 mL，渦旋振蕩5 min，高速（8 000 r/min）離心10 min，提取有機相，重復提取一次，合并兩次提取的有機相于尖底試管中，氮氣吹至近干，加入0.1 mL乙醇定容，供GC-MS分析。

1.4.2 空白胃內(nèi)容物添加樣品前處理

取空白胃內(nèi)容物2.0 g（6份），分別添加一定量乙蒜素標準溶液，渦旋振蕩混合后，按照1.4.1進行操作。

2 結果與討論

2.1 樣品前處理條件的選擇

2.1.1 提取溶液的pH值的選擇

本文考察了pH分別為3.0、5.0和7.0的磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖溶液對乙蒜素的提取效果，實驗結果顯示，pH為3.0和5.0時，目標物的提取效果基本一樣，但明顯高于pH為7.0條件下的提取效果。這與乙蒜素的化學性質(zhì)有關，乙蒜素在酸性溶液中穩(wěn)定，但在堿性條件下不穩(wěn)定。后續(xù)實驗采取的是在磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖溶液（pH=3.0）體系下進行提取。

2.1.2 液液提取溶劑的選擇

本文考察了二氯甲烷、三氯甲烷和環(huán)己烷四種溶劑作為提取溶劑的提取效果。實驗結果表明：二氯甲烷作為提取溶劑得到的乙蒜素的總離子圖中峰面積最大，提取效果是二氯甲烷＞三氯甲烷＞環(huán)己烷，二氯甲烷提取效果最好，故后續(xù)實驗都采用二氯甲烷作為提取溶劑進行前處理。

2.2 GC-MS定性分析方法的優(yōu)化確立

2.2.1 儀器進樣口、傳輸線溫度和離子源溫度的優(yōu)化

本文考察了濃度分別為0.005、0.05、0.5、5.0和50.0 μg/mL的乙蒜素標準工作液在不同進樣口溫度、傳輸線溫度和離子源溫度條件下進樣出峰情況，結果見表1。

由實驗結果可以看出乙蒜素在表1序號1條件設置下，除0.005 μg/mL以外其余濃度乙蒜素均能檢出，能夠滿足實驗的要求。因為乙蒜素在140 ℃易分解，所以儀器各部分溫度對乙蒜素檢測影響比較大，所以設置進樣口溫度為140 ℃，傳輸線溫度為140 ℃，離子源溫度為200 ℃。

表1 乙蒜素在不同進樣口溫度、傳輸線溫度和離子源溫度條件下進樣出峰情況Table 1 Ethylicin determined under different temperatures at inlet, transmission line and ion source

2.2.2 升溫速率的選擇

本文考察了三種升溫速率對同一濃度下乙蒜素的分析效率和其他雜質(zhì)的分離效果：

1）初始溫度50 ℃，保持1 min，10 ℃/min，升至160 ℃，保持3 min。

2）初始溫度50 ℃，保持1 min，5 ℃/min，升至160 ℃，保持3 min。

3）初始溫度50 ℃，保持1 min，20 ℃/min，升至280 ℃，保持3 min。

實驗結果表明：在第一種程序升溫下對乙蒜素進行分離定性檢測，乙蒜素的保留時間為9.730 min，乙蒜素出峰效果很好，而且和基質(zhì)有很好的分離度。濃度為5 μg/mL的乙蒜素標準溶液GC-MS分析的總離子流圖見圖2a。將5 μg/mL乙蒜素標準工作液根據(jù)優(yōu)化后的條件取樣1 μL進行檢驗分析，乙蒜素的保留時間為9.730 min，特征離子碎片為154、95、77、61。所得質(zhì)譜圖如圖2b。

圖2 濃度為5μg/mL的乙蒜素GC-MS分析總離子流圖（a）和質(zhì)譜圖（b）Fig.2 Total ion-current chromatogram and mass spectrogram (EI) from GC-MS (5μg/mL ethylicin)

2.3 方法的標準曲線、檢出限、回收率和相對標準偏差

在空白胃內(nèi)容物中依次加入適量乙蒜素標準溶液，使得乙蒜素濃度分別為0.5、1.0、2.0、5.0、10.0、50.0 μg/g，按照1.4.1步驟進行操作，進樣分析。乙蒜素出峰良好。以乙蒜素的峰面積（y）為縱坐標，以乙蒜素標準樣品濃度（x，μg/g）為橫坐標作線性回歸。從表2可知，本方法對乙蒜素有良好的線性關系，采用在空白胃內(nèi)容物中添加目標化合物的方法，依3倍信噪比確定檢出限。

表2 GC-MS分析乙蒜素的線性方程、R2和檢出限Table 2 The linear equation, correlation coeff icient and LOD

使用在空白胃內(nèi)容中添加乙蒜素的方法測定加標回收率，評價方法的可靠性。添加乙蒜素0.5、5.0、20.0 μg/g 3個濃度，每個濃度分別取5份樣品進行平行實驗，按照1.4.1方法進行測定，結果見表3。

表3 空白胃內(nèi)容物中乙蒜素的回收率和相對標準偏差(n=5)Table 3 Recoveries and RSDs of ethylicin in the gastric contents (n=5)

3 案例應用

筆者于2021年10月受理一件案件，一名女性頭部被其丈夫用石頭砸傷，接著喝乙蒜素農(nóng)藥未被及時搶救最終死亡。辦案單位送來了農(nóng)藥瓶、嘔吐物、胃內(nèi)容物和血液等相關檢材，筆者按照本方法對檢材進行處理后，在農(nóng)藥瓶、胃內(nèi)容物和嘔吐物樣本中均檢出乙蒜素成分，但是在血中未檢出乙蒜素成分。配制乙蒜素系列濃度的空白血添加樣品進樣分析，經(jīng)1.4.1步驟操作，按照1.2分析條件檢測，在所有添加乙蒜素的空白血樣品中均未檢測出乙蒜素成分。

國內(nèi)服用乙蒜素自殺的案例雖有報道，但均是醫(yī)生對乙蒜素中毒搶救與救治體會的相關報道，乙蒜素在人體內(nèi)的藥物代謝動力學和理化檢驗在國內(nèi)外均無相關報道，可參考資料有限。經(jīng)查閱大量資料，F(xiàn)reema等[9]對大蒜素在血液、有機溶劑和模擬生物體液中的穩(wěn)定性研究一文中，發(fā)現(xiàn)大蒜素加入到血液中極不穩(wěn)定，立即損失83%，5 min后完全消失，這可能是大蒜素和血紅蛋白的二價鐵快速反應引起的。由于乙蒜素與大蒜素結構相似，是大蒜素的乙基同系物，由此推斷乙蒜素可能與血紅蛋白的二價鐵也會快速反應消失，造成血中檢不出乙蒜素成分。

4 結論

本實驗建立了胃內(nèi)容物中乙蒜素檢測的GC-MS方法，填補了國內(nèi)乙蒜素GC-MS檢測方法的空白。本方法簡便快捷，干擾少，且回收率高，重現(xiàn)性好，靈敏度高，可滿足此類涉毒案件定性的需要，給類似案件的實驗室檢驗提供GC-MS方法參考。同時對血中乙蒜素以及空白血中添加乙蒜素做了大量實驗研究，為血中乙蒜素的檢驗鑒定工作提供經(jīng)驗與參考，為刑事案件的定性提供有力支撐。