藍(lán)影試劑在法醫(yī)血痕DNA檢驗(yàn)中的適用性

嚴(yán)安心，凃 政，趙禾苗，彭 柱，徐 珍

(公安部鑒定中心，法醫(yī)遺傳學(xué)公安部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100038）

藍(lán)影試劑（Blueblood reagent），也稱(chēng)為藍(lán)影血液追蹤試劑，是一種新型的潛血痕顯現(xiàn)劑，能夠使?jié)撗鄢尸F(xiàn)藍(lán)色。與法醫(yī)物證鑒定常用的四甲基聯(lián)苯胺、魯米諾等[1]潛血痕發(fā)現(xiàn)試劑相比，藍(lán)影試劑比四甲基聯(lián)苯胺顯色更迅速、顏色更清亮、背景更清晰、無(wú)擴(kuò)散[2]；其與魯米諾相比，顯現(xiàn)過(guò)程不需要暗視場(chǎng)，且一旦著色，能持久顯現(xiàn)，便于觀(guān)察和記錄[3]。目前，藍(lán)影試劑已應(yīng)用于公安現(xiàn)場(chǎng)勘查[2]。多數(shù)情況下，現(xiàn)場(chǎng)發(fā)現(xiàn)的潛血痕需進(jìn)行后續(xù)DNA檢驗(yàn)，但當(dāng)前還罕有藍(lán)影試劑對(duì)DNA檢驗(yàn)影響的研究報(bào)道。本文從顯色特異性、靈敏度以及對(duì)人血紅蛋白（如FOB（fecal occult blood），即便潛血）金標(biāo)試劑條檢測(cè)、對(duì)DNA分型檢驗(yàn)的影響等方面就藍(lán)影試劑相關(guān)于DNA檢驗(yàn)的應(yīng)用性進(jìn)行綜合評(píng)估。

1 材料與方法

1.1 材料與設(shè)備

人樣本：血、精液、尿液、唾液樣本由志愿者提供，其中血樣本1份（3 mL）；精液、尿液樣本各1份，均為1 mL；唾液樣本6份（來(lái)自6名志愿者），0.5 mL/份。

非人樣本：馬、羊、牛、鴨、鵝、雞、貓、狗、兔等動(dòng)物血各1份，委托獸醫(yī)在動(dòng)物日常防疫時(shí)幫助采集；大、小鼠血各1份，由公安部鑒定中心實(shí)驗(yàn)動(dòng)物房提供；魚(yú)血1份，由實(shí)驗(yàn)人員在農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)收集；上述所有血樣均制作成濾紙片干血斑。葡萄、橙子、涼茶、可樂(lè)、醋、醬油、豆油、番茄、洗潔精、84消毒液等購(gòu)自超市；日用剪刀和拖把桿（均有銹蝕）。

藍(lán)影試劑：北京海洋海泰科技有限公司產(chǎn)品，每套藍(lán)影試劑由試劑A和試劑B組成，試劑A為含有顯色底物與保護(hù)劑（避免非血痕類(lèi)斑跡與藍(lán)影試劑發(fā)生藍(lán)色反應(yīng)）的水溶液，試劑B為3%雙氧水溶液，將A、B試劑充分混勻即形成實(shí)驗(yàn)用的藍(lán)影試劑[4]。

人血紅蛋白（FOB）檢測(cè)試劑條（北京芬格爾安科技有限責(zé)任公司）；VeriFilerTMPlus試劑盒（ThermoFisher Scientif ic）；自動(dòng)化核酸提取工作站（長(zhǎng)春市博坤生物科技有限公司）；ProFlexTM3×32-well PCR擴(kuò)增儀、3500xL遺傳分析儀（ThermoFisher Scientif ic）。

1.2 顯色特異性測(cè)試

1.2.1 樣本的制備

血痕樣本的制備：取10 μL人血滴在干凈的濾紙上，晾干備用；剪取適量含有動(dòng)物血樣的濾紙片，加100 μL純水振蕩浸泡30 min，取10 μL浸泡液滴在干凈的濾紙上，晾干備用。

非血跡樣本的制備：取精液、尿液、唾液1（牙齦無(wú)出血情況）、唾液2（牙齦有潛在出血情況）、葡萄汁、橙汁、涼茶、可樂(lè)、醋、醬油、豆油、番茄汁、洗潔精、84消毒液各10 μL滴在干凈的濾紙上，晾干備用。

生銹物品的準(zhǔn)備：生銹的剪刀和拖把桿。

1.2.2 試驗(yàn)方法

每個(gè)制備樣本上均分別滴加40 μL藍(lán)影試劑、在生銹物品表面噴灑藍(lán)影試劑，觀(guān)察顯色情況。

1.3 顯色靈敏度測(cè)試

取健康成年人血液，稀釋成下列梯度：原液、1∶100、1∶200、1∶500、1∶1 000、1∶2 000、1∶4 000、1∶6 000、1∶8 000、1∶10 000、1∶20 000、1∶40 000、1∶80 000，分別取10 μL滴于濾紙上，自然晾干，制成血斑。同1.2.2試驗(yàn)與觀(guān)察顏色顯現(xiàn)。

1.4 顯色反應(yīng)對(duì)人血紅蛋白確證實(shí)驗(yàn)的影響

取血液原液、1∶100、1∶200的血液稀釋液各10 μL滴于濾紙上，自然晾干，制成血斑。在每個(gè)血斑上分別滴加40 μL藍(lán)影試劑，顯色15 min以上使顯色反應(yīng)完全。以不加藍(lán)影試劑的血斑為對(duì)照組。將血斑剪下置于1.5 mL離心管內(nèi)，加入300 μL純水浸泡，進(jìn)行FOB試劑條檢驗(yàn)，觀(guān)察檢驗(yàn)結(jié)果。

1.5 DNA分型檢測(cè)

在濾紙上滴加60滴志愿者血樣（每滴1 μL），制成60個(gè)干血斑，其中30個(gè)血斑噴灑藍(lán)影試劑，作為實(shí)驗(yàn)樣本；另外30個(gè)血斑不噴灑藍(lán)影試劑，作為對(duì)照樣本。采用磁珠法、Chelex-100法、樣本直擴(kuò)法制備PCR擴(kuò)增模板。使用VeriFilerTMPlus試劑盒對(duì)DNA溶液或直擴(kuò)樣本進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)體系總體積10 μL，擴(kuò)增程序與設(shè)置參照說(shuō)明書(shū)。應(yīng)用AB3500xL遺傳分析儀檢測(cè)、分析樣本的DNA分型。

磁珠法提取DNA：采用自動(dòng)化核酸提取工作站提取實(shí)驗(yàn)與對(duì)照樣本各10個(gè)的DNA，其中洗脫體積為60 μL。PCR擴(kuò)增所用模板量為1 μL。

Chelex-100法提取DNA：采用Chelex-100法提取實(shí)驗(yàn)與對(duì)照樣本各10個(gè)的DNA，其中5% Chelex的用量為100 μL。PCR擴(kuò)增所用模板量為4 μL。

樣本直擴(kuò)法：選擇實(shí)驗(yàn)與對(duì)照樣本各10個(gè)作為直擴(kuò)樣本。PCR擴(kuò)增時(shí)使用打孔器在血斑中心打孔作為模板。

2 結(jié)果

2.1 顯色特異性測(cè)試

藍(lán)影試劑不僅可顯現(xiàn)人血，而且能顯現(xiàn)馬、羊、牛、鴨、鵝、雞、大鼠、小鼠、魚(yú)、貓、狗、兔等動(dòng)物血，各種血斑均顯現(xiàn)藍(lán)色（見(jiàn)圖1），可見(jiàn)藍(lán)影試劑不能區(qū)分人血和動(dòng)物血。

圖1 藍(lán)影試劑對(duì)各種血跡的顯色情況（1：人；2：馬；3：羊；4：牛；5：鴨；6：鵝；7：雞；8：大鼠；9：小鼠；10：魚(yú)；11：貓；12：狗；13：兔）Fig.1 Origin-various bloodstains (1: human; 2: horse; 3: sheep; 4: ox; 5: duck; 6: goose; 7: chicken; 8: rat; 9: mouse; 10: f ish; 11: cat; 12:dog; 13: rabbit) developed by Blueblood reagent

由圖2可知，對(duì)于犯罪現(xiàn)場(chǎng)可能遇到的精液、尿液、葡萄汁、橙汁、涼茶、可樂(lè)、醋、醬油、豆油、番茄汁、洗潔精等非血痕類(lèi)斑跡，滴加藍(lán)影后均不顯現(xiàn)藍(lán)色；但對(duì)于唾液，若唾液所屬個(gè)體無(wú)牙齦出血情況，則藍(lán)影不會(huì)使其顯現(xiàn)藍(lán)色，若唾液所屬個(gè)體有牙齦出血情況（即便眼睛觀(guān)察不到血絲，但FOB試劑條檢測(cè)陽(yáng)性），則滴加藍(lán)影后顯現(xiàn)淺藍(lán)色；藍(lán)影試劑能與84消毒液反應(yīng)生成明亮的藍(lán)色物質(zhì)。在生銹物品上噴灑藍(lán)影試劑后，未觀(guān)察到顯色反應(yīng)（見(jiàn)圖3）。

圖2 藍(lán)影試劑對(duì)不同斑跡的顯色情況（1：精液；2：尿液；3/4：唾液1/2（牙齦無(wú)/有出血情況）；5：葡萄汁；6：橙汁；7：涼茶；8：可樂(lè)；9：醋；10：醬油；11：豆油；12：番茄汁；13：洗潔精；14：84消毒液）Fig.2 Effect of color developing with Blueblood reagent sprayed onto different stains (1: semen; 2: urine; 3/4: saliva 1/2 from the donor suffering without/with gum hemorrhage; 5: grape juice; 6: orange juice; 7: cooled tea water; 8: coke juice; 9: vineger; 10: sauce; 11: bean oil;12: tomato juice; 13: detergent; 14: 84 disinfectant)

圖3 噴灑藍(lán)影試劑于生銹物體表面上的顯色情況（左：生銹的剪刀；中/右：生銹的拖把桿。箭頭指示鐵銹位置）Fig.3 Effect of color developing with Blueblood reagent sprayed onto the surface of rusted objects (left: scissors; middle/right: mop rod.Arrows indicate the rusting places)

2.2 顯色靈敏度測(cè)試

藍(lán)影試劑滴加到不同稀釋度的血斑上后，原液及1∶100、1∶200、1∶500、1∶1 000的 稀釋液能夠在數(shù)秒內(nèi)顯現(xiàn)藍(lán)色，繼續(xù)放置，在5 min內(nèi)1∶2 000、 1∶4 000、1∶6 000、1∶8 000、1∶10 000的稀釋液也能呈現(xiàn)出淺藍(lán)色，但未觀(guān)察到1∶20 000、1∶40 000、1∶80 000的稀釋液的顯色情況（圖4）。隨著血液濃度的降低，顯色深度逐漸變淺。

圖4 不同稀釋梯度血樣的顯色情況（著色時(shí)間5min）Fig.4 Effect of dilution-various blood samples on color developing with Blueblood reagent (color appearing within 5 minutes)

2.3 顯色反應(yīng)對(duì)FOB確證實(shí)驗(yàn)的影響

血液原液、1∶100和1∶200血液稀釋液經(jīng)藍(lán)影試劑著色后，立即進(jìn)行FOB試劑條檢驗(yàn)，均可觀(guān)察到陽(yáng)性結(jié)果；顯色15 min后（使顯色反應(yīng)更加充分）再進(jìn)行FOB試劑條檢驗(yàn)，血液原液、1∶100血液稀釋液可檢測(cè)到陽(yáng)性，但1∶100血液稀釋液的陽(yáng)性與對(duì)照組相比明顯較弱，1∶200血液稀釋液的檢測(cè)結(jié)果為陰性。

實(shí)驗(yàn)表明，血跡經(jīng)藍(lán)影試劑著色后，與抗人血紅蛋白抗體的反應(yīng)會(huì)受到抑制，可能出現(xiàn)FOB試劑條檢驗(yàn)假陰性的情況（如圖5）。

圖5 藍(lán)影著色15min后血跡的人血紅蛋白檢測(cè)Fig.5 Inf luence of Blueblood reagent dyeing (for 15 minutes) on detecting human hemoglobin from bloodstains

2.4 DNA分型檢測(cè)

實(shí)驗(yàn)樣本噴灑藍(lán)影試劑后，均呈現(xiàn)深藍(lán)色。Chelex-100法、樣本直擴(kuò)法與對(duì)照組相比，藍(lán)影著色血痕的DNA分型檢出率（用完整分型檢出率表示，下同）和平均峰高均明顯降低，表明藍(lán)影試劑對(duì)PCR擴(kuò)增有一定的抑制作用。磁珠法顯示，洗脫后的藍(lán)影著色血痕的DNA溶液呈無(wú)色透明狀，實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組的所有樣本均獲得了完整、正確的分型且兩組的平均峰高無(wú)明顯差異，表明磁珠法可有效去除藍(lán)影試劑中的PCR抑制成分。表1顯示三種DNA提取方法對(duì)藍(lán)影試劑著色血痕影響的具體情況。

表1 不同DNA提取方法對(duì)藍(lán)影著色血跡DNA分型檢驗(yàn)的影響Table 1 Effects of different DNA extra ctions on DNA genotyping from bloodstains developed with Blueblood reagent

3 討論

藍(lán)影試劑是一種無(wú)刺激氣味、淺黃綠色澄清水溶液，其與血痕發(fā)生顯色反應(yīng)的基本原理是血痕中的血紅蛋白具有類(lèi)似過(guò)氧化物酶活性，能將過(guò)氧化氫分解，釋放出新生態(tài)氧，將試劑中的顯色底物氧化成藍(lán)色[4]。藍(lán)影試劑能使人血和各種動(dòng)物血顯現(xiàn)藍(lán)色，但對(duì)精液、尿液、葡萄汁、橙汁、涼茶、可樂(lè)、醋、醬油、豆油、番茄汁、洗潔精等斑跡均不會(huì)顯現(xiàn)藍(lán)色，表明藍(lán)影試劑具有一定的血跡顯現(xiàn)特異性。

本文針對(duì)6個(gè)志愿者的唾液斑進(jìn)行藍(lán)影顯現(xiàn)測(cè)試，有4個(gè)唾液斑不顯色、2個(gè)唾液斑顯藍(lán)色，隨后對(duì)6個(gè)唾液斑進(jìn)行人血紅蛋白檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)前4個(gè)唾液斑呈陰性、后2個(gè)唾液斑陽(yáng)性，表明經(jīng)藍(lán)影試劑檢測(cè)呈陽(yáng)性的原因是相關(guān)唾液中含有潛血。鐵銹能使四甲基聯(lián)苯胺、魯米諾的血痕預(yù)實(shí)驗(yàn)產(chǎn)生假陽(yáng)性[5]，而筆者所用的藍(lán)影試劑中由于加入了抑制鐵銹反應(yīng)的保護(hù)劑[4]，所以鐵銹不會(huì)使藍(lán)影試劑的血痕預(yù)實(shí)驗(yàn)產(chǎn)生假陽(yáng)性。

值得注意的是，藍(lán)影試劑與84消毒液會(huì)產(chǎn)生明亮的藍(lán)色反應(yīng)，故在現(xiàn)勘應(yīng)用中要觀(guān)察現(xiàn)場(chǎng)是否有84消毒液存在，若有，則要慎重使用藍(lán)影試劑。宋華杰等[2]的研究中，牛奶、雞蛋清會(huì)引起藍(lán)影試劑的假陽(yáng)性反應(yīng)，但筆者對(duì)牛奶和雞蛋清的多次檢驗(yàn)均未發(fā)現(xiàn)假陽(yáng)性反應(yīng)，對(duì)比實(shí)驗(yàn)過(guò)程，可能是使用的藍(lán)影試劑產(chǎn)自不同廠(chǎng)家所致，經(jīng)咨詢(xún)生產(chǎn)廠(chǎng)家，筆者使用的藍(lán)影試劑中的保護(hù)劑經(jīng)多次改良，能抑制多種非血跡類(lèi)物質(zhì)的假陽(yáng)性反應(yīng)。犯罪現(xiàn)場(chǎng)的斑跡種類(lèi)繁多，本文在此討論的斑跡種類(lèi)還十分有限，針對(duì)藍(lán)影試劑顯現(xiàn)特異性的研究還有待在今后的工作中進(jìn)一步完善。

藍(lán)影試劑能夠顯現(xiàn)稀釋倍數(shù)為10 000的血液稀釋樣本，表明其可用于痕量血跡的檢測(cè)。值得注意的是，當(dāng)血痕稀釋倍數(shù)為2 000～10 000時(shí)，其顯現(xiàn)所需時(shí)間略長(zhǎng)（但在5 min以?xún)?nèi)）且藍(lán)色較弱，這就提示在用藍(lán)影搜索極微量或陳舊血痕時(shí)應(yīng)當(dāng)延長(zhǎng)顯色時(shí)間，或可噴灑5 min后觀(guān)察，此時(shí)再?lài)姙⑸僭S并直接進(jìn)行觀(guān)察，顯現(xiàn)效果會(huì)更佳。在搜索深色或藍(lán)色物體上極微量血痕時(shí)，藍(lán)影試劑的顯現(xiàn)受背景影響較大，不易觀(guān)察，此時(shí)可以考慮使用紅外光源或魯米諾進(jìn)行血痕搜索[6-8]。藍(lán)影試劑對(duì)血跡染色后，會(huì)影響血紅蛋白與其抗體的反應(yīng)，因此微量血痕經(jīng)藍(lán)影試劑顯色后再進(jìn)行人血紅蛋白檢驗(yàn)，甚至?xí)霈F(xiàn)假陰性檢測(cè)結(jié)果。

藍(lán)影試劑中存在一定量的PCR抑制成分，磁珠法DNA提取過(guò)程可有效去除這些成分，藍(lán)影著色血跡經(jīng)磁珠法提取DNA后的分型檢出率要高于Chelex-100法和樣本直擴(kuò)法，因此，針對(duì)藍(lán)影著色后的血跡，建議采用磁珠法進(jìn)行DNA提取純化。

本文綜合分析了藍(lán)影試劑的血痕顯色特性和對(duì)后續(xù)DNA分型的影響，應(yīng)可為該試劑在DNA檢驗(yàn)中的應(yīng)用提供一定的技術(shù)參考。