表觀遺傳修飾影響花青苷合成研究進(jìn)展

張楊景暉，常沛瑤，楊紫淑，薛宇航，李雪奇，張旸

綜 述

表觀遺傳修飾影響花青苷合成研究進(jìn)展

張楊景暉，常沛瑤，楊紫淑，薛宇航，李雪奇，張旸

東北林業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，哈爾濱 150040

花青苷是廣泛存在于植物中的一類重要的類黃酮化合物，對植物生長、代謝、應(yīng)激等方面具有重要作用。在植物生長發(fā)育過程中，花青苷使植物的花和果實(shí)呈現(xiàn)出豐富色彩的顏色，從而吸引昆蟲傳粉和動(dòng)物采食，便于結(jié)種和傳播；在植物代謝應(yīng)激反應(yīng)中，花青苷使植物具有抵御低溫、干旱、真菌感染，防御紫外線傷害、蟲害等能力?；ㄇ嘬丈锖铣赏肥芟嚓P(guān)結(jié)構(gòu)基因和轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控機(jī)制已被解析得十分清楚，近幾年研究發(fā)現(xiàn)，植物花青苷生物合成相關(guān)基因受到表觀調(diào)控，從而影響花青素苷的合成。表觀遺傳學(xué)是目前生命科學(xué)領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)之一，本文結(jié)合最新的植物花青苷合成表觀遺傳學(xué)研究進(jìn)展，綜述了花青苷合成過程中的表觀遺傳修飾以及基因編輯技術(shù)在表觀遺傳學(xué)研究中的應(yīng)用，以期利用表觀遺傳手段為花色育種改良提供新思路。

花青苷；表觀遺傳修飾；CRISPR/dCas9

花青苷(anthocyanin)，又名花色素苷，屬于黃酮類化合物，是花青素發(fā)生糖基化后形成的，使花青素能夠穩(wěn)定在植物細(xì)胞的液泡中。自然界中常見的花青素主要有6種：天竺葵色素、矢車菊色素、芍藥色素、飛燕草色素、錦葵色素和矮牽牛色素[1]，是一類在植物中廣泛存在的水溶性色素，能夠賦予植物豐富的色彩，同時(shí)增強(qiáng)植物應(yīng)對外界脅迫的能力?；ㄇ嘬兆鳛橐活愔匾闹参锎紊x產(chǎn)物，其生物學(xué)功能包括抵御低溫、干旱、真菌感染?；ㄇ嘬盏纳锖铣墒芙Y(jié)構(gòu)基因和調(diào)節(jié)基因的共同調(diào)控，其中結(jié)構(gòu)基因編碼其生物合成途徑中所需要的酶，調(diào)節(jié)基因參與調(diào)控結(jié)構(gòu)基因的時(shí)空表達(dá)?；ㄇ嘬蘸铣山Y(jié)構(gòu)基因的表達(dá)存在一定的協(xié)同效應(yīng)，且結(jié)構(gòu)基因的表達(dá)受MYB、bHLH和WD40這3類轉(zhuǎn)錄因子組成的MBW (MYB-bHLH-WD40) 轉(zhuǎn)錄復(fù)合體的調(diào)控[2]。近年來研究發(fā)現(xiàn)，另一類作用于基因表達(dá)水平上的調(diào)控——表觀遺傳調(diào)控與花青苷合成調(diào)控也有密切聯(lián)系。

表觀遺傳學(xué)是指DNA核苷酸序列不發(fā)生變化而基因的表達(dá)發(fā)生了可遺傳的改變。表觀遺傳修飾是指DNA與染色體上發(fā)生的一類與轉(zhuǎn)錄調(diào)控相關(guān)的修飾，可以誘發(fā)穩(wěn)定的表型改變，在有絲分裂或減數(shù)分裂中遺傳。近年來，多種植物的生命活動(dòng)和表觀遺傳修飾的聯(lián)系逐漸被發(fā)掘，從而揭示了環(huán)境因子和植物相互作用的復(fù)雜機(jī)制。

近年來隨著花青苷生物合成表觀遺傳學(xué)調(diào)控機(jī)制研究的逐漸深入，有關(guān)花青苷的生物合成通路及轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控花青苷生物合成的分子機(jī)制也在不斷完善。目前的表觀遺傳研究已經(jīng)證明多種表觀遺傳修飾類型調(diào)控植物花青苷的合成與積累。但是，表觀修飾的類型包括哪些？表觀修飾間如何聯(lián)系？環(huán)境因素如何影響表觀修飾？這些都是表觀遺傳學(xué)領(lǐng)域亟待回答的基本問題。本文總結(jié)了近幾年表觀遺傳修飾影響花青苷合成的研究進(jìn)展、存在的問題和發(fā)展前景，闡述了CRISPR/dCas9系統(tǒng)在植物表觀遺傳學(xué)研究中的應(yīng)用及其在植物育種上的價(jià)值，以期為植物花色、果色育種開辟新途徑。

1 花青苷合成的表觀遺傳修飾

表觀遺傳學(xué)是研究基因的核苷酸序列不發(fā)生改變，基因表達(dá)發(fā)生可遺傳性變化的一門遺傳學(xué)分支學(xué)科，其發(fā)生與很多生物學(xué)過程密切相關(guān)[3]，例如基因組印跡的DNA甲基化調(diào)控影響被子植物胚乳的正常發(fā)育和種子育性。表觀遺傳機(jī)制主要包括DNA甲基化、非編碼RNA[4]、組蛋白修飾[5]、染色質(zhì)重塑[6]和核小體定位[7]等。其中，表觀修飾作用于DNA、組蛋白等參與基因表達(dá)的元件，從而對生物體內(nèi)多種生命活動(dòng)的基因表達(dá)產(chǎn)生調(diào)控。其中，植物花青苷合成是研究表觀遺傳調(diào)控生命活動(dòng)的方向之一。

花青苷作為重要的植物次生代謝產(chǎn)物，在植物色彩呈現(xiàn)、應(yīng)對脅迫等方面均具有重要作用。自20世紀(jì)90年代起，人們開始研究花青苷的合成機(jī)制以及花青苷的生物學(xué)功能，目前已較完整地解析了植物體內(nèi)花青苷的生物合成通路[8]。由苯丙氨酸到花青苷的生物合成包括3個(gè)階段：第一個(gè)階段，由苯丙氨酸到香豆酰-輔酶A，該步驟受苯丙氨酸解氨酶基因調(diào)控；第二階段，由香豆酰-輔酶A到二氫黃酮醇，其中查爾酮合成酶基因(chalcone synthase,)是第一個(gè)關(guān)鍵基因，其催化產(chǎn)生后續(xù)反應(yīng)的碳骨架查爾酮，然后在查爾酮異構(gòu)酶(chalcone isomerase, CHI)、黃烷酮-3-羥化酶(flavanone 3 hydroxylase, F3H)、類黃酮-3′,5′-羥基化酶(flavonoid-3′,5′-hydroxylase,F3′5′H)、類黃酮-3′-羥基化酶(flavonoid-3′-hydroxylase,F3′H)作用下合成三類二氫黃酮醇類物質(zhì)：二氫槲皮素、二氫山奈酚、二氫楊梅素[9]。不同的二氫黃酮醇類物質(zhì)在二氫黃酮醇還原酶(dihydroflavonol 4-reductase, DFR)催化下分別合成無色翠雀素、無色天竺葵色素、無色矢車菊素等無色花色素；第三階段，無色花色素在不同花青苷合成酶(anthocyanin synthase, ANS)作用下加氧轉(zhuǎn)變成有色的翠雀色素、天竺葵色素、矢車菊素，最后結(jié)合糖苷形成穩(wěn)定的花青苷。

基于完整的花青苷合成通路，進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)了花青苷的合成調(diào)控因子，例如MYB-bHLH-WD40三元復(fù)合物(MBW)由R2R3-MYB轉(zhuǎn)錄因子(MYB75/PAP1、MYB90/PAP2、MYB113和MYB114)、bHLH轉(zhuǎn)錄因子(TT8、GL3和EGL3)和WD40蛋白TTG1組 成[10,11]，三者形成MBW復(fù)合物共同調(diào)控花青苷合成基因的表達(dá)。轉(zhuǎn)錄因子通過與花青苷合成基因啟動(dòng)子中的順式作用元件結(jié)合，影響合成途徑中的一個(gè)或多個(gè)關(guān)鍵酶基因的表達(dá)[12]，從而實(shí)現(xiàn)對花青苷合成途徑的直接調(diào)控?；谝阎腗BW復(fù)合物響應(yīng)外界信號(hào)的相關(guān)研究進(jìn)展，探索表觀遺傳修飾和花青苷合成之間的聯(lián)系成為近幾年的研究熱點(diǎn)，包括花青苷合成基因和轉(zhuǎn)錄因子的表觀修飾等。表觀遺傳修飾作用于啟動(dòng)子和特定DNA或組蛋白上，從而在轉(zhuǎn)錄水平上對花青苷的合成進(jìn)行調(diào)控。Wang等[13]在蘿卜(L.)中發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)座子在啟動(dòng)子甲基化修飾中發(fā)揮作用。這種可遺傳的表觀遺傳變化是由于CACTA轉(zhuǎn)座子的高甲基化，導(dǎo)致DNA甲基化擴(kuò)散到花青苷調(diào)控因子的啟動(dòng)子區(qū)，降低了基因表達(dá)，抑制了白肉突變體花青苷的生物合成。Jia等[14]在草莓(×Duch. cv. Hongjia)和番茄(L. cv. Lichun)中發(fā)現(xiàn)組蛋白甲基化抑制花青苷的積累。在翻譯后修飾中，Maier等[15]在擬南芥()中證明泛素化通過降解花青素合成蛋白(production of anthocyanin pigment, PAP)1和PAP2，從而調(diào)控花青苷的積累。目前，關(guān)于花青苷合成的表觀遺傳研究大致可分為以下幾類：DNA甲基化修飾、組蛋白修飾、泛素化修飾、SUMO化修飾等。其中DNA甲基化修飾抑制基因表達(dá)，組蛋白修飾根據(jù)修飾位點(diǎn)和類型的不同抑制或促進(jìn)基因表達(dá)，泛素化修飾通過降解轉(zhuǎn)錄因子抑制基因表達(dá)，而SUMO化則通過抑制泛素化作用穩(wěn)定基因表達(dá)。具體如圖1所示。

圖1 表觀修飾影響花青苷合成模型

A：DNA甲基化修飾(me)抑制花青苷合成基因表達(dá)。B：組蛋白修飾中，不同類型的修飾和同種類型不同程度的修飾會(huì)產(chǎn)生不同的效果。其中：①組蛋白抑制位點(diǎn)單甲基化修飾抑制花青苷合成基因表達(dá)；②某些賴氨酸位點(diǎn)(如H3K9me3、H3K27me3)的三甲基化修飾抑制花青苷合成基因表達(dá)；③某些賴氨酸位點(diǎn)(如H3K4me3、H3K36me3、H3K79me3)的三甲基化修飾促進(jìn)花青苷合成基因表達(dá)；④組蛋白乙酰化修飾(ac)促進(jìn)花青苷合成基因表達(dá)。C：泛素化修飾使轉(zhuǎn)錄因子降解從而抑制花青苷合成基因表達(dá)。D：SUMO化修飾使轉(zhuǎn)錄因子更穩(wěn)定從而促進(jìn)花青苷合成基因表達(dá)。

1.1 DNA甲基化與花青苷合成調(diào)控

1.1.1 DNA甲基化

DNA甲基化是指DNA序列中的胞嘧啶或腺嘌呤位點(diǎn)通過甲基轉(zhuǎn)移酶作用共價(jià)結(jié)合甲基基團(tuán)的一種修飾方式[16]，是表觀遺傳調(diào)控的重要組成。植物DNA甲基化通常指發(fā)生在DNA胞嘧啶第5位碳原子的甲基化修飾[17]，該過程與植物的生長發(fā)育調(diào)控密切相關(guān)[18]。根據(jù)植物基因組中胞嘧啶附近的序列組成，將甲基化分成CG、CHG和CHH三類(H指A、T、C中任意一種)。DNA在連接上一個(gè)小分子量且疏水的甲基后，通過改變?nèi)旧|(zhì)狀態(tài)，使DNA與蛋白質(zhì)等生命大分子活性物質(zhì)的相互作用發(fā)生改變，直接影響基因表達(dá)。DNA甲基化是由甲基化和去甲基化反應(yīng)動(dòng)態(tài)調(diào)控的，其中甲基化過程包括DNA從頭甲基化[19]和甲基化維持兩種形成途徑，該過程涉及多種甲基轉(zhuǎn)移酶。DNA從頭甲基化是由非編碼RNA介導(dǎo)的DNA甲基化(RNA-directed DNA methylation, RdDM)途徑，在此途徑中，SHH1 (Sawadee homeodomain homolog 1)招募RNA聚合酶IV (POL IV)等元件到基因組特定位點(diǎn)，并轉(zhuǎn)錄形成非編碼RNA，在RNA依賴的聚合酶II(RDR2)作用下合成雙鏈RNA(dsRNA)，并被DICER-LIKE PROTEIN 3 (DCL3)、DCL2和DCL4切割，產(chǎn)生24 nt小干擾RNA (small interfering RNAs, siRNAs)，siRNA與ARGONAUTE 4 (AGO 4)互補(bǔ)起支架作用的RNA結(jié)合，實(shí)現(xiàn)定位，使得與AGO4相互作用的甲基化酶DRM2 (domains rearranged methyltransferase 2)實(shí)現(xiàn)目標(biāo)DNA甲基化[20]。而甲基化維持在擬南芥中主要的3種甲基轉(zhuǎn)移酶包括MET1 (methyltransferase 1)維持CG甲基化、CMT3 (chromomethylase 3)維持CHG甲基化、DRM2維持CHH甲基化[21]。DNA去甲基化包括主動(dòng)去甲基化和被動(dòng)去甲基化兩種途徑。植物中DNA依賴4種去甲基化酶：ROS1 (repressor of silencing 1)、DME (Demeter)、DML2 (DME-like 2)和DML3[22]。DNA去甲基化酶主要通過主動(dòng)去甲基化途徑堿基切除修復(fù)機(jī)制來實(shí)現(xiàn)去甲基化，從而調(diào)控甲基化水平，并在此基礎(chǔ)上通過調(diào)節(jié)蛋白介導(dǎo)去甲基化酶與特異位點(diǎn)之間的結(jié)合來進(jìn)一步調(diào)節(jié)基因的表達(dá)與沉默[23]。當(dāng)去甲基化酶無法實(shí)現(xiàn)功能時(shí)，被動(dòng)去甲基化作為主要途徑，由核因子NF粘附甲基化的DNA，使粘附點(diǎn)附近的DNA不能被完全甲基化，從而阻斷甲基化酶DNMT1 (DNA methyltrans-ferase 1)的作用，防止甲基化進(jìn)行[24]。植物體內(nèi)的總體甲基化水平通過甲基化和去甲基化動(dòng)態(tài)過程控制，當(dāng)植物面臨生物脅迫和非生物脅迫時(shí)，基因組中DNA甲基化會(huì)發(fā)生改變，通過DNA甲基水平的傳遞實(shí)現(xiàn)表觀性狀的遺傳性改變。

1.1.2 DNA甲基化與花青苷合成

DNA甲基化作為最常見的表觀遺傳修飾方式，在多數(shù)植物花青苷合成中起重要調(diào)控作用。Deng等[25]為探究荷花(Gaertn)的著色機(jī)制，對紅白兩個(gè)品種的花瓣進(jìn)行甲基化水平分析，發(fā)現(xiàn)白色花瓣與高甲基化水平相偶聯(lián)，但并未定位到具體區(qū)域甲基化和花青苷的聯(lián)系。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)DNA甲基化直接影響花青苷合成基因或調(diào)控因子的表達(dá)，從而影響花青苷的積累。Wang等[26]在梨()中發(fā)現(xiàn)基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化抑制了花青苷的合成。Li[27]對蘋果(Borkh)的研究也發(fā)現(xiàn)，花青苷合成正調(diào)控因子上游啟動(dòng)子區(qū)受到甲基化影響，基因表達(dá)受到抑制。通過測定蘋果的甲基化組，發(fā)現(xiàn)蘋果中CHH的甲基化類型占主導(dǎo)地位。也有研究嘗試發(fā)現(xiàn)影響這些區(qū)域特異甲基化的因素，如環(huán)境因子是主要的影響因素。此外，Bai等[28]發(fā)現(xiàn)光照也是重要影響因子之一，通過遮光處理降低了基因上游區(qū)域甲基化水平并啟動(dòng)花青苷合成，顯著提高非紅蘋果品種中色素含量。綜上所述，DNA甲基化是花青苷合成表觀調(diào)控中一種重要的修飾類型。然而，花青苷合成基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化調(diào)控機(jī)制及如何精準(zhǔn)調(diào)控仍知之甚少。

甲基化作為重要的表觀遺傳標(biāo)記在花青苷合成中發(fā)揮重要作用。植物生命周期中積累的DNA甲基化作為表觀遺傳標(biāo)記可以傳遞給下一代，為植物的遺傳多樣性提供了新的來源。植物基因組DNA甲基化狀態(tài)會(huì)響應(yīng)脅迫，植物可以調(diào)整相關(guān)基因的表達(dá)狀態(tài)以應(yīng)對脅迫，并且由脅迫引起的大多數(shù)DNA甲基化變異在世代間可穩(wěn)定遺傳。

1.2 組蛋白修飾與花青苷合成調(diào)控

1.2.1 組蛋白修飾

與DNA甲基化類似，組蛋白修飾也是重要的表觀修飾方式。染色體的基本單位是核小體，核小體是由4對蛋白質(zhì)H2A、H2B、H3、H4構(gòu)成的八聚體結(jié)構(gòu)及纏繞的DNA組成，并由連接蛋白H1固定[29]。這些纏繞著DNA的核小體經(jīng)過復(fù)雜空間折疊形成染色質(zhì)，染色質(zhì)往往有兩種存在形式，常染色質(zhì)松散卷曲形態(tài)與基因表達(dá)有關(guān)，而異染色質(zhì)緊密卷曲形式與基因沉默有關(guān)。組蛋白修飾存在于構(gòu)成核小體的組蛋白八聚體的尾巴上，尤其是其氨基末端，在組蛋白修飾酶作用下發(fā)生各種甲基化、乙?；⒘姿峄?、糖基化等翻譯后修飾(histone post-translational modifications, PTMs)[30]。這些修飾通過影響組蛋白與DNA或與其他蛋白質(zhì)結(jié)合的緊密程度，改變?nèi)旧|(zhì)致密或松散狀態(tài)，從而促進(jìn)或抑制相關(guān)基因的表達(dá)。組蛋白甲基化的動(dòng)態(tài)調(diào)控依賴組蛋白甲基化轉(zhuǎn)移酶HMTs (histone methyltransferases)、組蛋白甲基化識(shí)別蛋白(histone methylation recognition proteins)、組蛋白去甲基化酶(histone demethylases)三者的共同作用[31]。目前研究較多的修飾位點(diǎn)包括H3組蛋白上賴氨酸甲基化修飾H3K9、H3K27、H3K4、H3K36等。在組蛋白賴氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶KMTs的作用下，可產(chǎn)生3種甲基化產(chǎn)物[32]：組蛋白賴氨酸單甲基化，雙甲基化和三甲基化。乙酰化和磷酸化是較為活躍的調(diào)控位點(diǎn)，相比甲基化通常是較為穩(wěn)定的修飾方式。其中H3K4和H3K36通常被認(rèn)為是活躍標(biāo)記，代表染色質(zhì)中活躍的轉(zhuǎn)錄區(qū)域；H3K9和H3K27甲基化通常被認(rèn)為是抑制標(biāo)記，代表染色質(zhì)中基因沉默區(qū)域[33]。但這種標(biāo)記并不是單一且絕對的，例如H3K9也可作為甲基化和乙?；母偁幷{(diào)控區(qū)域[29]。這些修飾作用于組蛋白，共同影響染色質(zhì)狀態(tài)，所以通常染色質(zhì)是受到多種蛋白修飾[34]。乙?；彩侵匾男揎楊愋椭唬c組蛋白甲基化類似，組蛋白乙?；芙M蛋白乙酰轉(zhuǎn)移酶HATs (histone acetyltransferases)和組蛋白脫乙酰酶HDACs (histone deacetylase)動(dòng)態(tài)平衡調(diào)控。擬南芥中編碼的12種乙酰轉(zhuǎn)移酶分為4大家族：CBP (CreB binding protein)、GNAT (Gcn5-related-N-termianl acetyltransferases)、MYST (MOZ，Ybf2/Sas3，Sas2，and Tip60-related)和TAF250 (TATA-binding protein- associated factor)；脫乙?；鞍卓梢员环譃?大家族：RPD3/HDA1 (REDUCED POTASSIUM Dep-endence3/Histone deacetylase-1)、HD2 (plant-specific HD2- type HDACs)和SIR2(NAD-dependent Sirtuin-like HDACs)。一般來說，組蛋白乙酰化與基因活躍有關(guān)，而組蛋白去乙酰化抑制基因表達(dá)[35]。在這些修飾下，組蛋白電荷狀態(tài)及染色質(zhì)結(jié)構(gòu)狀態(tài)發(fā)生改變，通過改變?nèi)旧|(zhì)致密或松散狀態(tài)，從而促進(jìn)或抑制相關(guān)基因的表達(dá)。如乙?；揎椏梢酝ㄟ^不帶電的乙?；B接賴氨酸上帶正電的氨基，中和組蛋白的賴氨酸殘基攜帶的正電荷，使染色質(zhì)有展開的趨勢，促進(jìn)基因表達(dá)。

1.2.2 組蛋白修飾與花青苷合成

組蛋白有H2A、H2B、H3、H4四種類型及其變體，組蛋白修飾通過改變組蛋白狀態(tài)從而調(diào)控基因表達(dá)。組蛋白經(jīng)過甲基化修飾后會(huì)使得染色質(zhì)緊縮，抑制基因表達(dá)，組蛋白去甲基化酶則拮抗此過程。組蛋白甲基化效果也存在差異，如H3K9、H3K27和H4K20位點(diǎn)的甲基化抑制轉(zhuǎn)錄；組蛋白H3第4個(gè)賴氨酸位點(diǎn)的甲基化(H3K4me)和第36個(gè)賴氨酸位點(diǎn)的甲基化(H3K36me)影響轉(zhuǎn)錄延伸；組蛋白三甲基化(me3)根據(jù)不同的修飾位點(diǎn)實(shí)現(xiàn)基因激活或抑制，如H3K4me3、H3K36me3和H3K79me3促進(jìn)轉(zhuǎn)錄，H3K9、H3K27抑制轉(zhuǎn)錄。Cai等[36]發(fā)現(xiàn)一個(gè)保守的組蛋白H2變異體H2A.Z可以影響其他組蛋白的修飾，該變異體通過對花青苷生物合成基因中的組蛋白H3第4個(gè)賴氨酸位點(diǎn)的三甲基化(H3K4me3)產(chǎn)生抑制作用，從而對花青苷生物合成基因的表達(dá)起到抑制作用。Fan等[37]在楊樹(spp)轉(zhuǎn)錄本等的組蛋白去甲基化酶研究中，發(fā)現(xiàn)組蛋白H3K9去甲基酶JMJ25直接與一類負(fù)調(diào)控花青苷積累和原花青苷合成的轉(zhuǎn)錄因子基因結(jié)合，使染色質(zhì)去甲基化，從而促進(jìn)轉(zhuǎn)錄，減少了楊樹花青苷的積累。組蛋白甲基化修飾與組蛋白去甲基化修飾對基因調(diào)控動(dòng)態(tài)調(diào)控，共同調(diào)節(jié)基因表達(dá)。另外，廣泛存在的組蛋白乙酰化可激活基因表達(dá)。在擬南芥中研究發(fā)現(xiàn)，組蛋白去乙?；负突ㄇ嘬蘸铣纱嬖诼?lián)系。組蛋白去乙酰酶HDA19[38]和HAT1[39]通過減少靶基因組蛋白H3乙?；瑥亩鴾p少靶基因的表達(dá)，對花青苷晚期生物合成基因進(jìn)行表觀遺傳調(diào)控。組蛋白修飾是表觀遺傳修飾中最復(fù)雜的修飾，其主要作用位點(diǎn)是組蛋白H3上的氨基酸位點(diǎn)。根據(jù)組蛋白修飾和花青苷合成的聯(lián)系，可以人為調(diào)控組蛋白乙?；龠M(jìn)花青苷合成基因表達(dá)，從而實(shí)現(xiàn)花色育種。通過dCas9系統(tǒng)，將相關(guān)的酶帶到靶位點(diǎn)，改變組蛋白的修飾的狀態(tài)，調(diào)控花色苷相關(guān)基因的表達(dá)來進(jìn)行育種。

1.3 泛素化、SUMO化修飾與花青苷合成調(diào)控

1.3.1 泛素化、SUMO化修飾

表觀遺傳修飾除了經(jīng)典的甲基化修飾和組蛋白修飾外，還包括泛素化、SUMO化、磷酸化等多種修飾類型，參與復(fù)雜的生命活動(dòng)調(diào)控。例如在ATP存在情況下，蛋白質(zhì)會(huì)依次在泛素活化酶E1、泛素結(jié)合酶E2、泛素連接酶E3作用下連接上泛素(ubiquitin)標(biāo)記并被蛋白酶體識(shí)別，在蛋白酶體作用下，被標(biāo)記的蛋白質(zhì)將發(fā)生降解并導(dǎo)致DNA損傷修復(fù)等生物效應(yīng)。另一種甲基化介導(dǎo)的蛋白翻譯后修飾方式是類泛素蛋白修飾分子化(small ubiquitin- like modifier, SUMO)，這種修飾也依賴ATP供能，但與泛素化修飾不同的是，SUMO化修飾后蛋白質(zhì)穩(wěn)定性會(huì)增加。

1.3.2 泛素化、SUMO化修飾與花青苷合成

很多研究推測甲基化能夠誘導(dǎo)下游其他修飾類型，如泛素化、SUMO化修飾等，形成復(fù)雜的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。泛素化可以降解蛋白質(zhì)，而SUMO化可以穩(wěn)定蛋白質(zhì)，二者共同調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)穩(wěn)定性?；ㄇ嘬兆鳛橹参镏兄匾拇紊x產(chǎn)物，通過靶向修飾調(diào)控關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子的穩(wěn)定性，從而影響花青苷的合成，以此來應(yīng)對外界脅迫。首先，外界信號(hào)可作用于花青苷調(diào)控因子或者降解這些調(diào)控因子，從而實(shí)現(xiàn)對蛋白質(zhì)的精確調(diào)控。如An等[40]發(fā)現(xiàn)蘋果E3泛素連接酶MdMIEL1通過直接泛素化降解MdMYB308L轉(zhuǎn)錄因子，使得花青苷積累減少。其次，泛素化也可實(shí)現(xiàn)自身的反饋調(diào)控，維持自身蛋白質(zhì)的穩(wěn)定。Li等[41]發(fā)現(xiàn)在紅色海棠(crabapplecv. ‘Royalty’)品種葉片發(fā)育過程中，花青苷合成調(diào)控因子McMYB10與特異性E3泛素連接酶基因和的啟動(dòng)子特異性結(jié)合，McMYB10通過促進(jìn)McCOP1對McMYB10蛋白的泛素化，降解過多的McMYB10，間接影響下游花青苷合成，實(shí)現(xiàn)對花青苷積累的調(diào)控。

植物SUMO化修飾通過與受體賴氨酸殘基競爭來拮抗泛素化。Zhou等[42]驗(yàn)證了MdMYB1潛在的互作蛋白MdSIZ1是一種SUMO E3連接酶，該酶介導(dǎo)的SUMO化抑制了泛素分子與花青苷相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子MdMYB1蛋白的偶聯(lián)從而促進(jìn)了MdMYB1蛋白的穩(wěn)定性。此外，Zheng等[43]研究了在強(qiáng)光條件下表現(xiàn)出花青苷積累減少表型的擬南芥SUMO E3連接酶SIZ1(SAP and Miz1)和抑制擬南芥泛素化調(diào)控的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)SUMO化修飾也是對強(qiáng)光脅迫的響應(yīng)。目前研究者陸續(xù)發(fā)現(xiàn)了各類表觀遺傳修飾間相互關(guān)系，外界脅迫和花青苷合成的聯(lián)系也可以通過修飾機(jī)制來解釋，如泛素化修飾揭示環(huán)境因素和表觀遺傳調(diào)控聯(lián)系。甲基化作為主要的表觀修飾，與其他修飾存在間接聯(lián)系，目前已經(jīng)成為研究的主要出發(fā)點(diǎn)。

2 植物表觀遺傳學(xué)中CRISPR/dCas9相關(guān)研究應(yīng)用

2.1 CRISPR/dCas9作用機(jī)制

基于以上各類表觀遺傳機(jī)制研究的需要，一類具有高效、便捷、精確特點(diǎn)的基因調(diào)控系統(tǒng)在表觀遺傳學(xué)研究中被廣泛應(yīng)用。在經(jīng)典的成簇的規(guī)律間隔的短回文重復(fù)序列(clustered regularly interspaced short palindromic repeats, CRISPR)和Cas9蛋白(CRISPR-associated protein 9)組成的CRISPR/Cas9基因編輯系統(tǒng)中，Cas9蛋白是一類具有特異核酸酶剪切活性和核酸定位活性的蛋白[44]，其功能取決于兩個(gè)結(jié)構(gòu)域RuvC和HNH，HNH結(jié)構(gòu)域切割與引導(dǎo)RNA序列互補(bǔ)的DNA鏈，而RuvC結(jié)構(gòu)域通過sgRNA (single guide RNA)/Cas9復(fù)合體的Watson- Crick堿基對切割另一條非互補(bǔ)的DNA鏈。當(dāng)RuvC和HNH同時(shí)處于失活狀態(tài)時(shí)，形成dCas9(dead Cas9)只能在sgRNA的介導(dǎo)下結(jié)合靶基因，而不具備剪切DNA的功能[45～47]。CRISPR/dCas9是一個(gè)強(qiáng)大的遺傳操作工具，通過融合相關(guān)酶，將其帶到DNA區(qū)域，對靶向DNA進(jìn)行有效的基因修飾，滿足表觀遺傳修飾研究的需求。CRISPR/dCas9是一種高效的表觀遺傳學(xué)研究工具。

2.2 CRISPR/dCas9在植物表觀遺傳修飾中的應(yīng)用

2.2.1 CRISPR/dCas9在植物DNA甲基化和去甲基化中的應(yīng)用

目前表觀遺傳學(xué)的相關(guān)報(bào)道中，CRISPR/dCas9系統(tǒng)在動(dòng)物中主要用于揭示各類癌癥和表觀遺傳修飾水平之間的聯(lián)系，而CRISPR/dCas9系統(tǒng)在植物中應(yīng)用很有限。CRISPR/dCas9系統(tǒng)在植物表觀遺傳的精準(zhǔn)修飾，主要體現(xiàn)在DNA甲基化和組蛋白修飾兩方面。其中該技術(shù)在甲基化修飾方面主要包括甲基化和去甲基化。Gallego-Bartolomé等[48]開發(fā)了基于CRISPR/dCas9的靶向去甲基化系統(tǒng)，利用去甲基化酶TET1催化結(jié)構(gòu)域?qū)崿F(xiàn)擬南芥基因組的靶向DNA去甲基化，證明了融合蛋白質(zhì)標(biāo)記系統(tǒng)SunTag的TET1催化結(jié)構(gòu)域(TET1cd)與用于靶向啟動(dòng)子的dCas9和具有特異性的單鏈可變區(qū)片段scFv (single-chain fragment variable)模塊間的融合可導(dǎo)致高效的靶向去甲基化，從而基因表達(dá)上調(diào)和獲得可遺傳的晚開花表型。通過進(jìn)一步研究，Li等[49]利用CRISPR-dCas9-TET1靶向甲基化證明了甲基化mCG和mCHG是將RdDM機(jī)制作用于甲基化位點(diǎn)所需的記憶標(biāo)記。盡管該系統(tǒng)非常便利，但需要表達(dá)外源TET1酶，因此，可能會(huì)對細(xì)胞代謝產(chǎn)生其他的影響。為了盡可能減少如去甲基化酶等外來成分的影響，調(diào)控原有去甲基化酶活性，Lu等[50]開發(fā)了一種新的CRISPR/dCas9-R2系統(tǒng)，利用CRISPR- dCas9將具有莖環(huán)結(jié)構(gòu)的短RNA序列(稱為R2)引入單向?qū)NA(sgRNA)支架位置，此時(shí)甲基化酶DNMT1被R2特異性招募，其酶活性在與R2結(jié)構(gòu)結(jié)合時(shí)受到抑制，從而通過阻斷靶基因座中甲基化酶DNMT1活性來降低DNA甲基化水平。此外，Ghoshal等[51]創(chuàng)制了基于CRISPR-dCas9的載體，使SunTag系統(tǒng)以序列特定的方式添加或移除植物中的特定靶位點(diǎn)DNA甲基化，并通過分析DNA甲基化數(shù)據(jù)，驗(yàn)證該結(jié)構(gòu)的有效性和特異性。許多研究表明，轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合DNA和DNA甲基化有關(guān)，表明表觀遺傳修飾影響基因的轉(zhuǎn)錄狀態(tài)，基因的轉(zhuǎn)錄也會(huì)影響表觀遺傳修飾，但能否遺傳還有待研究。在已知CRISPR/dCas9可以精確實(shí)現(xiàn)靶向DNA甲基化和去甲基化的基礎(chǔ)上，可以針對花青苷合成基因的啟動(dòng)子區(qū)進(jìn)行修飾，以提高花青苷在植物中的積累，從而為花色育種改良提供新思路。

2.2.2 CRISPR/dCas9在植物組蛋白修飾中的應(yīng)用

組蛋白修飾種類眾多，因此可利用CRISPR/dCas9連接不同的表觀修飾酶進(jìn)行精確修飾。Paix?o等[52]通過將CRISPR/dCas9與組蛋白乙酰轉(zhuǎn)移酶(AtHAT1)融合，激活擬南芥抗旱基因和(是正調(diào)控基因)的表達(dá)，使植株在水分虧缺條件下，表現(xiàn)出較高的葉綠素含量和較快的氣孔開度，在干旱脅迫后具有較高的存活率。Chen等[53]建立了由dCas9/sgRNA-PP7和甲基化酶PCP- EZH2組成的基因修飾系統(tǒng)：在dCas9/sgRNA-PP7的指導(dǎo)下，PCP-EZH2可以特異性地靶向基因位點(diǎn)，催化組蛋白H3第27個(gè)賴氨酸位點(diǎn)的三甲基化(H3K27me3)，從而抑制基因表達(dá)，為基因表觀遺傳修飾提供了強(qiáng)有力的工具。組蛋白修飾的復(fù)雜機(jī)制還包括各種修飾間的相互作用。Zhao等[54]將CRISPR/dCas9的表觀基因組編輯方法用于表觀遺傳機(jī)制間串?dāng)_的研究，揭示了H3K27ac和H3K4me3在基因激活過程中的關(guān)系。在CRISPR/dCas9的輔助下，組蛋白的靶向修飾更加精確，更加接近生物體內(nèi)的真實(shí)情況。利用組蛋白乙?；邢蚣せ罨ㄇ嘬蘸铣苫虻膯?dòng)子區(qū)，在花色育種改良上提供了一種簡便、高效的思路。

2.3 CRISPR/dCas9在花青苷合成中的應(yīng)用

研究證明，花青苷合成過程受到表觀遺傳修飾調(diào)控，關(guān)鍵合成基因上的修飾通過酶、轉(zhuǎn)錄因子等的表達(dá)實(shí)現(xiàn)對花青苷合成和積累的調(diào)控。而CRISPR/ dCas9系統(tǒng)在此類研究中可以改變表觀修飾水平，實(shí)現(xiàn)人為調(diào)控，便于揭示表觀遺傳修飾在花青苷合成中的調(diào)控機(jī)制。通過CRISPR/dCas9調(diào)控花青苷合成也進(jìn)行了一些嘗試。Selma等[55]利用可激活多個(gè)基因的dCasEV2.1，促進(jìn)了煙草()關(guān)鍵花青苷合成基因的表達(dá)，并精確調(diào)控了代謝合成途徑在黃烷醇、花青苷和黃烷酮分支流向，實(shí)現(xiàn)精準(zhǔn)的控制上下游代謝，獲得花青苷前體黃酮類物質(zhì)，合成效率提升了4倍。Lowder等[56]利用dCas9融合VP64轉(zhuǎn)錄因子，使擬南芥控制花青苷合成的基因()啟動(dòng)子過表達(dá)，導(dǎo)致花青苷色素積累，使擬南芥的芽和根中形成紫色。而Park等[57]利用協(xié)同激活劑介質(zhì)(synergistic activator mediator, SAM)系統(tǒng)策略，將最小的發(fā)夾適配體附著在sgRNA的四環(huán)和莖環(huán)2上來設(shè)計(jì)額外的sgRNA，并增加了NF-kappa B的p65反式激活亞基和熱休克因子(HSF)融合dCas9實(shí)現(xiàn)基因的過表達(dá)及花青苷積累，使得葉子呈紫色。Ren等[58]在葡萄(L.)中利用dCas-VP64和dCas9-TV增強(qiáng)表達(dá)花青苷合成關(guān)鍵酶UDP-葡萄糖類黃酮糖基轉(zhuǎn)移酶(UDP- glycose flavonoid glycosyltransferase, UFGT)，實(shí)現(xiàn)了花青苷表達(dá)量提升了1.6～5.6倍。同時(shí)，該研究也嘗試?yán)枚鄠€(gè)sgRNA組合實(shí)現(xiàn)多個(gè)基因修飾，并且證明多個(gè)sgRNA的協(xié)同效果。

由于轉(zhuǎn)錄因子優(yōu)先結(jié)合甲基化DNA，啟動(dòng)子招募的轉(zhuǎn)錄因子與其靶DNA序列結(jié)合可能會(huì)受到DNA甲基化等表觀遺傳修飾的干擾[59]，如DNA甲基化已被證明會(huì)破壞擬南芥中76%的轉(zhuǎn)錄因子與其靶DNA序列的結(jié)合[60]。為了防止表觀修飾對植物自身的轉(zhuǎn)錄因子產(chǎn)生不利影響，增加sgRNA和dCas9的表達(dá)是提高CRISPR系統(tǒng)效率的一個(gè)重要策略[61]。在未來的植物花青苷合成研究中，有望將更多的表觀遺傳修飾相關(guān)酶應(yīng)用到CRISPR/dCas9中，實(shí)現(xiàn)對花青苷合成酶基因的精準(zhǔn)修飾，利用可遺傳的基因調(diào)控手段創(chuàng)造高效合成花青苷的品種。此外，解碼復(fù)雜的表觀基因組也是育種的重要方向。CRISPR/dCas9能通過dCas9-CR融合對染色質(zhì)動(dòng)力學(xué)的局部擾動(dòng)，了解目標(biāo)位點(diǎn)染色質(zhì)環(huán)境。如通過靶向組蛋白乙酰化打開位點(diǎn)的可及性，促進(jìn)轉(zhuǎn)錄激活劑或抑制因子在不同位點(diǎn)的結(jié)合，導(dǎo)致不同的轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。CRISPR/dCas9憑借對局部染色質(zhì)調(diào)控的優(yōu)勢，利于了解修飾間串?dāng)_和染色質(zhì)重塑在發(fā)育中的作用。

CRISPR/dCas9技術(shù)自開發(fā)以來，在基因工程研究中的優(yōu)勢越來越明顯。首先，CRISPR/dCas9能夠適用幾乎所有植物細(xì)胞的基因修飾研究，且操作簡單、花費(fèi)低，在普通實(shí)驗(yàn)室就可以使用。其次，與傳統(tǒng)的轉(zhuǎn)基因技術(shù)和組織特異啟動(dòng)子啟動(dòng)靶基因的特定表達(dá)等比較，該技術(shù)靶向特定DNA序列且僅需兩個(gè)元件就可以運(yùn)行。再次，與CRISPR/Cas9對調(diào)控基因啟動(dòng)子元件進(jìn)行靶向編輯相比，該技術(shù)并不直接改變DNA序列，而是利用生物體自身的修飾酶，對DNA序列進(jìn)行表觀修飾。與其他傳統(tǒng)的育種方法相比，CRISPR/dCas9表觀修飾的方法具有高效、精準(zhǔn)、可遺傳等諸多優(yōu)點(diǎn)。在此基礎(chǔ)上，結(jié)合現(xiàn)有的多路復(fù)用設(shè)計(jì)等新策略和基因激活等其他方式，可以進(jìn)一步優(yōu)化該系統(tǒng)。綜上所述，CRISPR/dCas9在花青苷合成的表觀遺傳學(xué)研究方向有著巨大的應(yīng)用價(jià)值。

3 結(jié)語與展望

在花青苷合成代謝研究中尚有許多有待解決的問題，比如花青苷的修飾、轉(zhuǎn)運(yùn)和積累過程、花青苷轉(zhuǎn)運(yùn)基因的調(diào)控[62]等。在經(jīng)典的合成通路基礎(chǔ)上，花青苷合成的表觀遺傳修飾調(diào)控更為復(fù)雜，類型多樣且相互關(guān)聯(lián)，有待更深入的研究。例植物組蛋白H3K9me2標(biāo)記和DNA甲基化這兩種標(biāo)記高度相關(guān)，體現(xiàn)表觀修飾的復(fù)雜聯(lián)系。此外，在花青苷合成調(diào)控機(jī)制上，如經(jīng)典的MBW復(fù)合體中各成分也與表觀遺傳修飾有緊密聯(lián)系，需要和酶合成代謝方式結(jié)合研究，體現(xiàn)花青苷合成的復(fù)雜性。目前，憑借新一代RNA干涉技術(shù)、轉(zhuǎn)錄組分析、甲基化組分析等技術(shù)，對花青苷合成通路中轉(zhuǎn)錄因子的表觀修飾作用研究將會(huì)更透徹。

CRISPR/dCas9技術(shù)自發(fā)明以來，已用于多種生物的研究。與傳統(tǒng)導(dǎo)入表觀修飾酶等手段相比是高效的，可以快速、準(zhǔn)確地定向改造植物特定性狀?；ㄇ嘬諏χ参锷L和發(fā)育很重要。為了提高這些有用代謝物的產(chǎn)量，通常需要同時(shí)調(diào)節(jié)多個(gè)關(guān)鍵基因。例如(1)過表達(dá)關(guān)鍵基因，以確保前體的充足供應(yīng)并增加目標(biāo)通路的代謝通量；(2)沉默靶代謝物競爭途徑中的關(guān)鍵酶基因，避免中間體被轉(zhuǎn)移；(3)過表達(dá)轉(zhuǎn)錄因子，用于同時(shí)激活或抑制多個(gè)內(nèi)源性關(guān)鍵基因，以增強(qiáng)代謝物的合成。利用CRISPR/dCas9系統(tǒng)連接修飾相關(guān)模塊，實(shí)現(xiàn)對啟動(dòng)子等關(guān)鍵調(diào)控區(qū)域的精確修飾，可以提供一種利用酶修飾改變基因甲基化或乙?；癄顟B(tài)來進(jìn)行育種改良的方法。

利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)將表觀修飾元件導(dǎo)入目標(biāo)植物內(nèi)，進(jìn)行目標(biāo)性狀花卉的資源育種是一個(gè)有發(fā)展前景的方向，而CRISPR/dCas9系統(tǒng)將憑借其精準(zhǔn)定位功能，將對闡明花青苷的合成及其調(diào)控模式提供幫助，并為植物新品種的培育的改良提供支持。dCas9系統(tǒng)的應(yīng)用需要全面選擇酶模塊、gRNA、選擇表達(dá)系統(tǒng)等，靶基因的精確時(shí)空表達(dá)模式也是策略設(shè)計(jì)時(shí)需要考慮的關(guān)鍵參數(shù)，以便選擇最合適的啟動(dòng)子進(jìn)行dCas9系統(tǒng)的表達(dá)。

[1] Ballaré CL. Stress under the sun: spotlight on ultraviolet-B responses., 2003, 132(4): 1725–1727.

[2] Petroni K, Tonelli C. Recent advances on the regulation of anthocyanin synthesis in reproductive organs., 2011, 181(3): 219–229.

[3] Hou JN, Lu DD, Mason AS, Li BQ, Xiao ML, An SF, Fu DH. Non-coding RNAs and transposable elements in plant genomes: emergence, regulatory mechanisms and roles in plant development and stress responses., 2019, 250(1): 23–40.

[4] Zhao T, Zhan ZP, Jiang DH. Histone modifications and their regulatory roles in plant development and environ-mental memory., 2019, 46(10): 467–476.

[5] Jarillo JA, Pi?eiro M, Cubas P, Martínez-Zapater JM. Chromatin remodeling in plant development., 2009, 53(8–10): 1581–1596.

[6] Iyer VR. Nucleosome positioning: bringing order to the eukaryotic genome., 2012, 22(5): 250– 256.

[7] Thapa B, Shrestha A. Epigenetic mechanisms and its role in plant growth and development., 2020, 8(6): 255.

[8] Holton TA, Cornish EC. Genetics and biochemistry of anthocyanin biosynthesis., 1995, 7(7): 1071– 1083.

[9] Mol J, Jenkins G, Sch?fer E, Weiss D, Walbot V. Signal perception, transduction, and gene expression involved in anthocyanin biosynthesis., 1996, 15(5–6): 525–557.

[10] Gonzalez A, Zhao MZ, Leavitt JM, Lloyd AM. Regulation of the anthocyanin biosynthetic pathway by the TTG1/bHLH/Myb transcriptional complex inseedlings., 2008, 53(5): 814–827.

[11] Shi MZ, Xie DY. Biosynthesis and metabolic engineering of anthocyanins in., 2014, 8(1): 47–60.

[12] Xu WJ, Dubos C, Lepiniec L. Transcriptional control of flavonoid biosynthesis by MYB-bHLH-WDR comp-lexes., 2015, 20(3): 176–185.

[13] Wang QB, Wang YP, Sun HH, Sun L, Zhang L. Transposon- induced methylation of thepromoter disturbs anthocyanin accumulation in red- fleshed radish., 2020, 71(9): 2537–2550.

[14] Jia HR, Jia HF, Lu SW, Zhang ZB, Su ZW, Sadeghnezhad E, Li T, Xiao X, Wang MT, Pervaiz T, Dong TY, Fang JG. DNA and histone methylation regulates different types of fruit ripening by transcriptome and proteome analyses.,2022, 70(11): 3541–3556.

[15] Maier A, Schrader A, Kokkelink L, Falke C, Welter B, Iniesto E, Rubio V, Uhrig JF, Hülskamp M, Hoecker U. Light and the E3 ubiquitin ligase COP1/SPA control the protein stability of the MYB transcription factors PAP1 and PAP2 involved in anthocyanin accumulation in., 2013, 74(4): 638–651.

[16] Liu BD, Wang HL. Sensitive analysis of DNA methylation and demethylation intermediates for eukaryotes., 2018, 30(4): 374–382.

[17] Zhang HM, Lang ZB, Zhu JK. Dynamics and function of DNA methylation in plants., 2018, 19(8): 489–506.

[18] Vanyushin BF, Ashapkin VV. DNA methylation in higher plants: Past, present and future., 2011, 1809(8): 360–368.

[19] Jullien PE, Susaki D, Yelagandula R, Higashiyama T, Berger F. DNA methylation dynamics during sexual reproduction in., 2012, 22(19): 1825–1830.

[20] Matzke MA, Mosher RA. RNA-directed DNA methylation: an epigenetic pathway of increasing complexity., 2014, 15(6): 394–408.

[21] Tirnaz S, Batley J. DNA Methylation: toward crop disease resistance improvement., 2019, 24(12): 1137–1150.

[22] Liu RE, Lang ZB. The mechanism and function of active DNA demethylation in plants., 2020, 62(1): 148–159.

[23] Lang ZB, Lei MG, Wang XG, Tang K, Miki D, Zhang HM, Mangrauthia SK, Liu WS, Nie WF, Ma GJ, Yan J, Duan CG, Hsu CC, Wang CL, Tao WA. Gong ZZ, Zhu JK. The Methyl-CpG-binding protein MBD7 facilitates active DNA demethylation to limit DNA hyper-methylation and transcriptional gene silencing., 2015, 57(6): 971– 983.

[24] Korotko U, Chwia?kowska K, Sańko-Sawczenko I, Kw-asniewski M. DNA demethylation in response to heat stress in., 2021, 22(4): 1555.

[25] Deng J, Fu ZY, Chen S, Damaris RN, Wang K, Li TT, Yang PF. Proteomic and epigenetic analyses of lotus () petals between red and white cultivars., 2015, 56(8): 1546–1555.

[26] Wang ZG, Meng D, Wang AD, Li TL, Jiang SL, Cong PH, Li TZ. The methylation of thepromoter is associated with green-skinned sport in max red bartlett pear., 2013, 162(2): 885–896.

[27] Li WF. Molecular mechanism of fruit skin coloration in apple (Borkh.) cv. ‘Red Delicious’ Bud Sport Mutants [Dissertation]. Gansu Agricultural University, 2020.

李文芳. ‘元帥’系蘋果芽變品種著色分子機(jī)理研究[學(xué)位論文]. 甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué), 2020.

[28] Bai SL, Tuan PA, Saito T, Honda C, Hatsuyama Y, Ito A, Moriguchi T. Epigenetic regulation of MdMYB1 is associated with paper bagging-induced red pigmentation of apples., 2016, 244(3): 573–586.

[29] Over RS, Michaels SD. Open and closed: the roles of linker histones in plants and animals., 2014, 7(3): 481–491.

[30] Jenuwein T. Re-SET-ting heterochromatin by histone methyltransferases., 2001, 11(6): 266– 273.

[31] Biswas S, Rao CM. Epigenetic tools (The Writers, The Readers and The Erasers) and their implications in cancer therapy., 2018, 837: 8–24.

[32] Black JC, Van Rechem C, Whetstine JR. Histone lysine methylation dynamics: establishment, regulation, and biolo-gical impact., 2012, 48(4): 491–507.

[33] Hu HM, Du JM. Structure and mechanism of histone methylation dynamics in Arabidopsis., 2022, 67: 102211.

[34] Xiao J, Lee US, Wagne D. Tug of war: adding and removing histone lysine methylation in., 2016, 34: 41–53.

[35] Kouzarides T. Chromatin modifications and their function., 2007, 128(4): 693–705.

[36] Cai HY, Zhang M, Chai MN, He Q, Huang XY, Zhao LH, Qin Y. Epigenetic regulation of anthocyanin biosyn-thesis by an antagonistic interaction between H2A.Z and H3K4me3., 2019, 221(1): 295–308.

[37] Fan D, Wang XQ, Tang XF, Ye X, Ren S, Wang DH, Luo KM. Histone H3K9 demethylase JMJ25 epigen-etically modulates anthocyanin biosynthesis in poplar, 2018, 96(6): 1121–1136.

[38] Nguyen NH, Jeong CY, Kang GH, Yoo SD, Hong SW, Lee H. MYBD employed by HY5 increases anthoc-yanin accumulation via repression ofin., 2015, 84(6): 1192–1205.

[39] Zheng T, Tan WR, Yang H, Zhang LE, Li TT, Liu BH, Zhang DW, Lin HH. Regulation of anthocyanin accum-ulation via MYB75/HAT1/TPL-mediated trans-criptional repression., 2019, 15(3): e1007993.

[40] An JP, Wang XF, Zhang XW, Xu HF, Bi SQ, You CX, Hao YJ. An apple MYB transcription factor regulates cold tolerance and anthocyanin accumulation and undergoes MIEL1- mediated degradation., 2019, 18(2): 337–353.

[41] Li KT, Zhang J, Kang YH, Chen MC, Song TT, Geng H, Tian J, Yao YC. McMYB10 modulates the expression of a Ubiquitin Ligase, McCOP1 during leaf coloration in crab-apple., 2018, 9: 704.

[42] Zhou LJ, Li YY, Zhang RF, Zhang CL, Xie XB, Zhao C, Hao YJ. The small ubiquitin-like modifier E3 ligase MdSIZ1 promotes anthocyanin accumulation by sumoy-l-ating MdMYB1 under low-temperature conditions in apple., 2017, 40(10): 2068–2080.

[43] Zheng T, Li YL, Lei W, Qiao K, Liu BH, Zhang DW, Lin HH. SUMO E3 Ligase SIZ1 stabilizes MYB75 to regulate anthocyanin accumulation under high light con-ditions in., 2020, 292: 110355.

[44] Jiang FG, Doudna JA. CRISPR-Cas9 structures and mechanisms., 2017, 46: 505–529.

[45] Qi LS, Larson MH, Gilbert LA, Doudna JA, Weissman JS, Arkin AP, Lim WA. Repurposing CRISPR as an RNA- guided platform for sequence-specific control of gene expression., 2013, 152(5): 1173–1183.

[46] Gilbert LA, Larson MH, Morsut L, Liu ZR, Brar GA, Torres SE, Stern-Ginossar N, Brandman O, Whitehead EH, Doudna JA, Lim WA, Weissman JS, Qi LS. CRISPR- mediated modular RNA-guided regulation of transcription in eukaryotes., 2013, 154(2): 442–451.

[47] Maeder ML, Linder SJ, Cascio VM, Fu YF, Ho QH, Joung JK. CRISPR RNA-guided activation of endogenous human genes., 2013, 10(10): 977–979.

[48] Gallego-Bartolomé J, Gardiner J, Liu WL, Papikian A, Ghoshal B, Kuo HY, Zhao JMC, Segal DJ, Jacobsen SE. Targeted DNA demethylation of thegenome using the human TET1 catalytic domain., 2018, 115(9): E2125–E2134.

[49] Li JW, Yang DL, Huang H, Zhang GP, He L, Pang J, Lozano-Durán R, Lang ZB, Zhu JK. Epigenetic memory marks determine epiallele stability at loci targeted by de novo DNA methylation., 2020, 6(6): 661–674.

[50] Lu AR, Wang JM, Sun WH, Huang WR, Cai ZM, Zhao GP, Wang J. Reprogrammable CRISPR/dCas9-based recruitment of DNMT1 for site-specific DNA deme-thylation and gene regulation., 2019, 5: 22.

[51] Ghoshal B, Gardiner J. CRISPR-dCas9-based targeted manipulation of DNA methylation in plants., 2021, 57–71.

[52] Paix?o JFR, Gillet FX, Ribeiro TP, Bournaud C, Louren?o-Tessutti IT, Noriega DD, de Melo BP, de Almeida-Engler J, Grossi-de-Sa MF. Improved drought stress tolerance inby CRISPR/dCas9 fusion with a Histone AcetylTransferase., 2019, 9(1): 8080.

[53] Chen XT, Wei MY, Liu XW, Song S, Wang L, Yang XK, Song YL. Construction and validation of the CRISPR/ dCas9-EZH2 system for targeted H3K27Me3 modification., 2019, 511(2): 246–252.

[54] Zhao WY, Xu Y, Wang YF, Gao D, King J, Xu YJ, Liang FS. Investigating crosstalk between H3K27 acetylation and H3K4 trimethylation in CRISPR/dCas-based epigenome editing and gene activation., 2021, 11(1): 15912.

[55] Selma S, Sanmartín N, Espinosa-Ruiz A, Gianoglio S, Lopez-Gresa MP, Vázquez-Vilar M, Flors V, Granell A, Orzaez D. Custom-made design of metabolite comp-osition inleaves using CRISPR activators., 2022, 20(8): 1578–1590.

[56] Lowder LG, Paul JW, Qi YP. Multiplexed transcri-ptional activation or repression in plants using CRISPR- dCas9-based systems, 2017, 1629: 167–184.

[57] Park JJ, Dempewolf E, Zhang WZ, Wang ZY. RNA-guided transcriptional activation via CRISPR/dCas9 mimics overexpression phenotypes in., 2017, 12(6): e0179410.

[58] Ren C, Li HY, Liu YF, Li SH, Liang ZC. Highly efficient activation of endogenous gene in grape using CRISPR/ dCas9-based transcriptional activators., 2022, 9: uhab037.

[59] Kribelbauer JF, Lu XJ, Rohs R, Mann RS, Bussemaker HJ. Toward a mechanistic understanding of DNA methylation readout by transcription factors.,2019, 432(6): 1801–1815.

[60] O'Malley RC, Huang SSC, Song L, Lewsey MG, Bartlett A, Nery JR, Galli M, Gallavotti A, Ecker JR. Cistrome and epicistrome features shape the regulatory DNA landscape.,2016, 165(5): 1280–1292.

[61] Karlson CKS, Mohd-Noor SN, Nolte N, Tan BC. CRISPR/dCas9-based systems: mechanisms and applic-ations in plant sciences.,2021, 10(10): 2055.

[62] Cui CJ, Li JM, Chen YY, Zhang RZ, Zhu QL. Isolation and expression analysis of an anthocyanin transportrelatedgene from., 2016, 36(7): 1337–1342.

Advances in epigenetic modification affecting anthocyanin synthesis

Yangjinghui Zhang, Peiyao Chang, Zishu Yang, Yuhang Xue, Xueqi Li, Yang Zhang

Anthocyanins are a class of important flavonoid compounds widely present in plants, and play important roles in plant growth, metabolism and stress responses. In the process of growth and development, anthocyanin renders the flowers and fruits of plants displaying rich colors, attracts insect pollination and animal feeding, thereby facilitating seed spreading and dissemination. In metabolic stress, anthocyanin can resist low temperature, drought, fungal infection, ultraviolet damage, insect pests and other stress-resistant processes. The anthocyanin biosynthesis is co-regulated by related structural genes as well as transcription factor genes. Recent studies have showed that the anthocyanin biosynthesis-related genes in plants are epigenetically regulated, thus affecting the synthesis of anthocyanin glycosides. Epigenetics is one of the hot topics in the field of biological sciences. In this review, we summarize the advances of epigenetic modifications in anthocyanin biosynthesis and the application of genome editing in epigenetics, thereby providing new ideas for flower color breeding improvement by epigenetic regulation.

anthocyanin; epigenetic modifications; CRISPR/dCas9

2022-05-24;

2022-08-24;

2022-09-26

國家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃項(xiàng)目(編號(hào)：2018YFD1000400)和黑龍江省自然科學(xué)基金聯(lián)合引導(dǎo)項(xiàng)目(編號(hào)：LH2021C006)資助[Supported by the National Key R&D Program of China (No.2018YFD1000400) and the Natural Science Foundation of Heilongjiang Province (No.LH2021C006)]

張楊景暉，在讀本科生，專業(yè)方向：生物技術(shù)(基地班)。E-mail: 2019213077@nefu.edu.cn

張旸，博士，教授，研究方向：觀賞植物表觀遺傳學(xué)。E-mail: summerzhang@126.com

10.16288/j.yczz.22-171

(責(zé)任編委: 儲(chǔ)成才)