BMP2基因遠(yuǎn)程調(diào)控元件的功能分析

萬星琦，魏婉珍，郭勝良，崔一笑，景雪瑩，黃露杰，馬捷

研究快報(bào)

基因遠(yuǎn)程調(diào)控元件的功能分析

萬星琦1，魏婉珍1，郭勝良1，崔一笑2，景雪瑩1，黃露杰1，馬捷1

1. 西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)部基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院電鏡室，西安 710061 2. 西安醫(yī)學(xué)院口腔醫(yī)學(xué)系，西安 710061

近年來數(shù)項(xiàng)基于遺傳家系的研究表明，骨形態(tài)發(fā)生蛋白2(bone morphogenetic protein 2, BMP2)基因下游的遠(yuǎn)端增強(qiáng)子元件調(diào)控區(qū)域的異常重復(fù)是A2型短指(趾)癥(brachydactyly type A2, BDA2)的致病原因，但是這段調(diào)控區(qū)域的確切分子功能尚不明確，甚至出現(xiàn)有相互矛盾的結(jié)果。本研究在生物信息學(xué)分析的基礎(chǔ)上，通過PCR技術(shù)擴(kuò)增了該調(diào)控區(qū)域的不同長度的目的片段，包括高度保守的2.1 kb核心序列和3個(gè)能夠完全覆蓋該2.1 kb片段的不同長度的截短體片段，進(jìn)而構(gòu)建基因重組載體，采用雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)方法對(duì)這些片段的生物學(xué)功能進(jìn)行分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，高度保守的2.1 kb片段并不具有增強(qiáng)子活性，而3個(gè)截短體片段均表現(xiàn)出強(qiáng)烈的增強(qiáng)子活性。這表明基因的表達(dá)調(diào)控模式非常復(fù)雜，對(duì)其下游的這段調(diào)控區(qū)域而言，選取不同長度的片段，其對(duì)表達(dá)調(diào)控的效果可能并不一致，這很可能是由于不同長度的片段所攜帶的調(diào)控元件數(shù)量或種類不同所致。此項(xiàng)研究初步揭示了基因調(diào)控元件的復(fù)雜性，為后續(xù)深入探究BDA2的分子致病機(jī)制提供了新的線索和方向。

BMP2；增強(qiáng)子；調(diào)控；重復(fù)；A2型短指(趾)癥

短指(趾)癥(brachydactyly，BD)是一類具有臨床特征和相關(guān)基因異質(zhì)性的疾病。BD的定義是由于指(趾)骨和(或)掌骨的異常發(fā)育而導(dǎo)致的手指(腳指)縮短，也可伴有其他手部畸形，如并指、多指、少指或指關(guān)節(jié)粘連[1]。其表現(xiàn)為單純型或復(fù)雜綜合征的一部分，單純型BDs分為BDA-E，其中BDA又包含有A1，A2和A3三個(gè)亞型[2]。BD的不同類型具有某些重疊特征，包括指骨發(fā)育不全、缺損和指間關(guān)節(jié)形成異常，這表明指骨和關(guān)節(jié)的形成在發(fā)育和分子基礎(chǔ)上是相互聯(lián)系的，受一系列復(fù)雜的分子機(jī)制調(diào)控。

A2型短指(趾)癥(BDA2，MIM112600)首先由Mohr和Wiredt在一個(gè)丹麥血統(tǒng)的挪威大家系中發(fā)現(xiàn)[3]。BDA2的患者表現(xiàn)為食指和(或)第二腳趾中指骨的偏斜和縮短，有時(shí)可累及第五指(趾)。目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，BDA2的致病基因具有較高異質(zhì)性。除了已知的骨形態(tài)發(fā)生蛋白受體1b(bone morphogenetic protein receptor 1 b, BMPR1B)[4～6]和生長分化因子5 (growth differentiation factor 5, GDF5)[7～10]上發(fā)生的錯(cuò)義突變可致病以外，最近的四項(xiàng)研究相繼發(fā)現(xiàn)骨形態(tài)發(fā)生蛋白2 (bone morphogenetic protein 2, BMP2)基因下游的一段調(diào)控序列的重復(fù)與疾病密切相關(guān)[11～14]。

BMP2屬于BMP家族成員，是一種分泌型信號(hào)分子，參與包括模式形成和器官發(fā)育的許多發(fā)育過程。BMP2在胚胎發(fā)生過程中的作用已經(jīng)被詳細(xì)研究，例如：Lyons等[15]發(fā)現(xiàn)小鼠()中(人源的同源基因)在發(fā)育中的骨骼系統(tǒng)之外的多種胚胎上皮和間充質(zhì)組織中表達(dá)，表明Bmp-2a在脊椎動(dòng)物胚胎的形態(tài)發(fā)生和模式形成中發(fā)揮多種作用; Kulessa等[16]發(fā)現(xiàn)骨形態(tài)發(fā)生蛋白BMP家族成員是控制出生后毛囊毛干分化的遺傳程序的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子; Pathi等[17]發(fā)現(xiàn)Bmp信號(hào)在軟骨細(xì)胞的生長和分化中必不可少?？傊?，BMP2可在多個(gè)胚胎區(qū)域如腎臟、毛囊、牙芽和腸道上皮以及生長板的軟骨肥大細(xì)胞、成骨軟骨膜和成骨細(xì)胞中表達(dá)[15～17]。在指間關(guān)節(jié)發(fā)育期間，BMP2首先表達(dá)在未來關(guān)節(jié)周圍的區(qū)域。在E14.5天的胎鼠中，BMP2在關(guān)節(jié)間隙區(qū)也有表達(dá)[10]。事實(shí)上，手指和腳趾的形態(tài)發(fā)生需要不同蛋白質(zhì)與調(diào)控序列的正確結(jié)合，以及不同蛋白質(zhì)之間的協(xié)調(diào)。的表達(dá)調(diào)控是復(fù)雜的，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了的幾個(gè)順式調(diào)控元件，包括轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)上游的兩個(gè)啟動(dòng)子[18～20]，基因5′端的一個(gè)增強(qiáng)子和一個(gè)沉默子[21]，以及一個(gè)3′端的遠(yuǎn)程增強(qiáng)子[22](這也是A2型短指(趾)癥相關(guān)的發(fā)生重復(fù)的調(diào)控區(qū)域)。據(jù)報(bào)道，小鼠中的轉(zhuǎn)錄可受位于啟動(dòng)子下游156.3 kb處的增強(qiáng)子區(qū)域調(diào)控，其非編碼序列變異可能影響轉(zhuǎn)錄，從而導(dǎo)致骨量變化及骨質(zhì)疏松[22,23]。此外，基因的大片段非編碼區(qū)內(nèi)的保守序列中，理論上可能存在更多的調(diào)控元件。

在對(duì)下游調(diào)控序列重復(fù)的功能研究中，Dathe等[11]使用在體系統(tǒng)來測(cè)試重復(fù)區(qū)域?qū)虮磉_(dá)的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)4.5 kb的重復(fù)片段可以驅(qū)動(dòng)重組的報(bào)告基因在四肢的表達(dá)，其表達(dá)模式幾乎與內(nèi)源性小鼠同源基因的表達(dá)完全重疊。他們推測(cè)，重復(fù)區(qū)域可導(dǎo)致BMP2表達(dá)增加，這使得BMP2在與GDF5競(jìng)爭(zhēng)其共同受體BMPR1B時(shí)更為有利。而在Su等[12]的研究中，于骨肉瘤U-2OS和HeLa細(xì)胞系中使用體外熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)來測(cè)試重復(fù)序列中一段高度保守的2.1 kb片段對(duì)基因表達(dá)的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)在兩種細(xì)胞系中2.1 kb片段的活性降低，表明這個(gè)2.1 kb片段可能對(duì)基因表達(dá)具有抑制作用，得出了與Dathe等[11]結(jié)果相反的結(jié)論。鑒于此，有必要開展進(jìn)一步的研究工作來闡明遠(yuǎn)端調(diào)控序列重復(fù)的確切分子功能。因此，本研究采用生物信息學(xué)分析、基因表達(dá)載體構(gòu)建、雙熒光素酶報(bào)告基因等分析方法，對(duì)這段重復(fù)區(qū)域，特別是核心的2.1 kb區(qū)域的功能進(jìn)行研究，以期深入闡明基因下游調(diào)控元件的遠(yuǎn)程調(diào)控機(jī)制，以及在BDA2中的分子致病機(jī)理。

1 材料與方法

此項(xiàng)研究獲得西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)部生物醫(yī)學(xué)科研倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.1 生物信息學(xué)分析

運(yùn)用UCSC數(shù)據(jù)庫(UCSC Browser, Human Assembly, Mar 2006(NCBI36/hg18); http://genome. ucsc.edu/cgi-bin/hgGateway)對(duì)基因下游調(diào)控區(qū)域的DNA序列信息進(jìn)行分析。為準(zhǔn)確定位目標(biāo)區(qū)域在基因組中的位置信息，需與已報(bào)道文獻(xiàn)中的序列信息相一致，本研究選擇使用發(fā)布于2006年3月的人類基因組數(shù)據(jù)NCBI36/hg18版本。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)

使用常用的工具細(xì)胞系HEK293T作為宿主細(xì)胞，該細(xì)胞系購自中國科學(xué)院細(xì)胞庫(貨號(hào)GNHu17，RRID:CVCL_0063)。在Dulbecco改良的Eagle培養(yǎng)基和高糖培養(yǎng)基中培養(yǎng)(DMEM/HIGH GLUCOSE) (Hyclone, 美國)，其中補(bǔ)充有10% FBS、100 U/mL青霉素和100 μg/mL鏈霉素。所有細(xì)胞均在保持5% CO2和37℃環(huán)境的孵箱中培養(yǎng)。

1.3 分子克隆

因本研究目的片段是潛在的增強(qiáng)子元件，選擇pGL3-Promoter(Promega，美國)作為載體。通過PCR技術(shù)擴(kuò)增基因下游調(diào)控區(qū)域的不同長度的目的片段，PCR試劑購自大連寶生生物公司。分別將目的片段克隆到pGL3-Promoter中，位于I (識(shí)別序列為GGTACC)和I (識(shí)別序列為CCCGGG)位點(diǎn)之間的螢火蟲熒光素酶編碼區(qū)下游。根據(jù)目的片段情況不同分別對(duì)重組子進(jìn)行命名：-2.1 kb的目的片段為2.1 kb的調(diào)控區(qū)域核心保守序列；-1，-2和-3的目的片段均為2.1 kb區(qū)域的截短體，三者組合可完全覆蓋2.1 kb區(qū)域；-Irrelevant的目的片段為2.1 kb下游非編碼區(qū)域的無關(guān)序列；-Exon的目的片段為外顯子2的編碼序列。后兩者均作為陰性對(duì)照。目的片段的DNA序列最終經(jīng)Sanger測(cè)序法鑒定，與UCSC的NCBI36/hg38參考序列一致。運(yùn)用在線軟件Primer 3(https://primer3.ut.ee/)設(shè)計(jì)PCR引物，引物信息見附表1。

1.4 細(xì)胞轉(zhuǎn)染和雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)

根據(jù)雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)手冊(cè)，使用pRL-TK載體進(jìn)行共轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)。HEK293T細(xì)胞轉(zhuǎn)染前先在48孔板中培養(yǎng)24 h。使用Lipofectamine 2000(Invitrogen，美國)分別將pGL3-Promotor的各個(gè)重組子與pRL-TK(360 ng：40 ng/孔)載體共轉(zhuǎn)染到HEK293T細(xì)胞中。轉(zhuǎn)染48 h后，收獲細(xì)胞。螢火蟲熒光素酶和海腎熒光素酶的活性檢測(cè)使用Dual- Luciferase?Reporter Assay Kit(Promega，美國)在多功能酶標(biāo)儀(Tecan，瑞士)上進(jìn)行。相對(duì)熒光素酶活性計(jì)算為螢火蟲與海腎熒光素酶活性的比率。

1.5 統(tǒng)計(jì)分析

數(shù)據(jù)顯示使用平均值±SEM。所有實(shí)驗(yàn)均獨(dú)立重復(fù)3次以上。通過Student’s檢驗(yàn)或Mann-Whitney U檢驗(yàn)評(píng)估組間的統(tǒng)計(jì)差異。采用SPSS18.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。0.05被認(rèn)為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果與討論

通過序列比對(duì)，結(jié)合文獻(xiàn)報(bào)道，在基因下游110 kb處的Chr.20:6806129–6814044區(qū)域是BDA2致病變異所在區(qū)域。在已報(bào)道的研究中，所有的基因組重復(fù)均發(fā)生在該區(qū)域內(nèi)。進(jìn)一步的序列分析顯示，此區(qū)域內(nèi)存在一段約2.1 kb的高度保守序列，在人()、恒河猴()、小鼠和狗()等物種中高度保守，表明這段2.1kb的區(qū)域可能具有更重要的生物學(xué)功能。

為深入探究這段2.1 kb序列的功能，本研究設(shè)計(jì)的3個(gè)截短體-1，-2和-3對(duì)這段區(qū)域進(jìn)行了全面覆蓋(圖1A)。經(jīng)過經(jīng)典的分子克隆系列實(shí)驗(yàn)，成功構(gòu)建了不同目的片段的重組載體。對(duì)陽性克隆結(jié)果進(jìn)行基因測(cè)序分析，所得結(jié)果在NCBI數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行Gene Blast序列比對(duì)分析，結(jié)果顯示各重組載體上的目的片段序列與數(shù)據(jù)庫參考序列完全一致(圖1B)。雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)結(jié)果顯示：(1)與轉(zhuǎn)染pGL3-Promotor空載體組相比，轉(zhuǎn)染-1(0.0001)、-2(0.0001)和-3 (0.001)片段組的熒光素酶活性顯著增高，表明-1、-2和-3的DNA片段均具有增強(qiáng)子活性。(2)與轉(zhuǎn)染pGL3-Promotor空載體組相比，轉(zhuǎn)染-2.1 kb片段組的熒光素酶活性無顯著變化，表明-2.1 kb的DNA片段不具有增強(qiáng)子活性。(3)與轉(zhuǎn)染pGL3-Promotor空載體組相比，轉(zhuǎn)染-Irrelevant和-Exon片段組的熒光素酶活性無顯著變化，表明這兩個(gè)組的DNA片段同樣不具有增強(qiáng)子活性(圖1C)。為進(jìn)一步分析增強(qiáng)子元件可能的特異性核心序列，將-1，-2和-3這3個(gè)具有增強(qiáng)子活性的DNA片段分別進(jìn)行了序列比對(duì)，結(jié)果未發(fā)現(xiàn)具有較好保守性的特異性共享序列。

圖1 BMP2基因及其下游遠(yuǎn)程調(diào)控元件相關(guān)實(shí)驗(yàn)結(jié)果

A:基因位于Chr.20:6696745-6708910處，其下游遠(yuǎn)程調(diào)控元件區(qū)域(Chr.20:6806129-6814044)距約110 kb。UCSC數(shù)據(jù)庫信息展示了不同物種中調(diào)控元件區(qū)域的保守性(http://genome.ucsc.edu/cgi-bin/hgGateway)，其中有一段2.1 kb的區(qū)域顯示高度的保守性。B: 攜帶不同片段的重組載體的測(cè)序鑒定結(jié)果。C: 不同目的片段重組子的雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)結(jié)果，***代表0.001, ****代表0.0001。

Su等[12]的研究是采用體外熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)在骨肉瘤U-2OS和HeLa細(xì)胞系中來測(cè)試重復(fù)序列中一段高度保守的2.1 kb片段對(duì)基因表達(dá)的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在兩種細(xì)胞系中2.1 kb片段的活性降低，表明這個(gè)2.1 kb片段可能對(duì)基因表達(dá)具有抑制作用。而本研究中使用了常用的工具細(xì)胞系HEK293T作為宿主細(xì)胞，開展細(xì)胞轉(zhuǎn)染和雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)該2.1 kb片段并不具有增強(qiáng)子活性。這一結(jié)果與Su等[12]的研究基本一致，即：此高度保守的2.1 kb區(qū)域不能增強(qiáng)基因的表達(dá)。事實(shí)上，這里選擇的2.1 kb保守序列與Su等[12]研究的片段是一致的。但就結(jié)果而言，依然存在一定的區(qū)別，即：Su等發(fā)現(xiàn)這段保守區(qū)域可以發(fā)揮沉默子的作用，但在本研究中并沒能驗(yàn)證這一作用。這可能是由于本次使用的細(xì)胞系及限制性內(nèi)切酶的不同所致。

近年來，來自不同人群的基于家系的四項(xiàng)研究均報(bào)道，基因下游的遠(yuǎn)程增強(qiáng)子區(qū)域發(fā)生的基因組片段重復(fù)是BDA2的致病原因。但是在兩項(xiàng)研究中，對(duì)這段增強(qiáng)子區(qū)域的生物學(xué)功能的解析結(jié)果卻貌似矛盾。本研究中，在基因下游的遠(yuǎn)程增強(qiáng)子區(qū)域中2.1 kb高度保守片段上選取了3個(gè)能夠覆蓋該高度保守區(qū)域的截短體片段，結(jié)果發(fā)現(xiàn)每個(gè)片段均表現(xiàn)出增強(qiáng)子活性，各自均可以獨(dú)立促進(jìn)的表達(dá)，這帶來新的啟示。通過仔細(xì)分析此前的研究，發(fā)現(xiàn)Dathe等[11]選取了下游增強(qiáng)子區(qū)域的小鼠同源的約4.5 kb的片段展開研究，發(fā)現(xiàn)其具有促進(jìn)表達(dá)的作用，而Su等[12]選取了下游增強(qiáng)子區(qū)域中保守性程度最高的2.1 kb片段進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)其不具有增強(qiáng)子活性，甚至有抑制表達(dá)的作用。本研究明確了這個(gè)2.1 kb區(qū)域不具備增強(qiáng)子活性，而從中選取0.94 kb，0.96 kb和0.62 kb的截短體片段又均表現(xiàn)出增強(qiáng)子活性。在不考慮實(shí)驗(yàn)材料差異的條件下，綜合上述發(fā)現(xiàn)，可以得到一個(gè)相對(duì)合理的解釋，即：基因的表達(dá)調(diào)控模式非常復(fù)雜，對(duì)其下游的這段調(diào)控區(qū)域而言，選取不同長度的片段，其對(duì)表達(dá)調(diào)控的效果可能并不一致，甚至是相反的。而之所以會(huì)出現(xiàn)這種情況，很可能是由于不同長度的片段所攜帶的調(diào)控元件數(shù)量或種類不同所致。

目前已知，BMP2在動(dòng)物體內(nèi)的整體丟失會(huì)導(dǎo)致胚胎死亡，其在骨骼發(fā)育中起著核心作用，如軟骨生成、軟骨和骨發(fā)育、骨礦物質(zhì)密度的形成和肢體形成等[24～26]。BMP2及其相關(guān)的BMP家族成員，均屬于轉(zhuǎn)化生長因子Beta(transforming growth factor-β，TGF-β)超家族成員，而TGF-β超家族在在骨和關(guān)節(jié)發(fā)育、細(xì)胞增殖和分化過程中的關(guān)鍵作用已被廣為報(bào)道。BDA2的致病基因，和均為該超家族成員，其中GDF5和BMP2為細(xì)胞外配體，而BMPR1B系跨膜受體。研究表明三者的突變或變異均可影響正常的BMP信號(hào)傳導(dǎo)途徑，最終導(dǎo)致BDA2的發(fā)生[27]。最后，在此項(xiàng)研究中，尚存在一定的不足。例如，采用體外研究方式，所取得的結(jié)果可能與在體的真實(shí)情況有所差異。其次，本研究解析了2.1 kb高度保守區(qū)域內(nèi)不同片段的增強(qiáng)子活性，但沒有對(duì)2.1 kb區(qū)域以外的區(qū)域展開分析，因此，對(duì)這段近6.0 kb的遠(yuǎn)程調(diào)控區(qū)域的分析尚不夠細(xì)致。

綜上所述，本研究對(duì)基因下游遠(yuǎn)程調(diào)控區(qū)域中高度保守的2.1 kb片段進(jìn)行了細(xì)致的分析，揭示了基因調(diào)控元件的復(fù)雜多樣性，為后續(xù)深入研究BDA2的分子致病機(jī)制提供了新的線索和方向。

附加材料見文章電子版www.chinagene.cn。

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Functional analysis of the long-range regulatory element ofgene

Xingqi Wan1, Wanzhen Wei1, Shengliang Guo1, Yixiao Cui2, Xueying Jing1, Lujie Huang1, Jie Ma1

Recently, several pedigree-based studies have shown that abnormal replication of an enhancer element regulatory region in the downstream of the bone morphogenetic protein 2 (BMP2) gene is the cause of brachydactyly type A2 (BDA2). However, the exact molecular function of this regulatory region is unclear, and even conflicting results have emerged. In this study, based on bioinformatics analysis, we amplified target fragments of different lengths in this regulatory region by PCR technology, including a highly conserved 2.1 kb core sequence and 3 fragments that can completely cover the core 2.1 kb fragment. Then, the gene recombination vectors were constructed, and the biological function of these fragments was analyzed by the dual-luciferase reporter gene technology system. We found that the highly conserved 2.1 kb fragment did not have enhancer activity, while all of three truncated fragments showed strong enhancer activity. The results suggest that the expression regulation mode of thegene is very complex. For the downstream regulatory region, selecting fragments of different lengths may have different effects on the regulation ofexpression, which may due to the fragments with different lengths carrying different regulatory elements in the number of types. In summary, this study revealed the complexity ofgene regulatory elements, and provided new clues and directions for the subsequent in-depth exploration of the molecular pathogenic mechanism of BDA2.

BMP2; enhancer; regulation; replication; brachydactyly type A2

2022-09-18;

2022-10-21;

2022-10-31

陜西省自然科學(xué)基礎(chǔ)研究計(jì)劃(編號(hào)：2022JM-440)；國家自然科學(xué)基金(編號(hào)：31371298)資助[Supported by the Natural Science Basic Research Plan in Shaanxi Province of China (No. 2022JM-440), and the National Natural Science Foundation of China (No. 31371298)]

萬星琦，碩士研究生，專業(yè)方向：人類遺傳與發(fā)育生物學(xué)。E-mail: 1061606776@qq.com

黃露杰，檢驗(yàn)師，研究方向：人類遺傳與發(fā)育生物學(xué)。E-mail: huanglujie307@163.com

馬捷，教授，研究方向：人類遺傳與發(fā)育生物學(xué)。E-mail: majie@xjtu.edu.cn

10.16288/j.yczz.22-304

(責(zé)任編委: 吳強(qiáng))