• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    一例ZMPSTE24基因復合雜合突變導致顱骨下頜骨皮膚發(fā)育不全B型的診斷和基因檢測分析

    2022-12-22 12:51:42吳丹丹李榮李曉南劉倩琦竇莉華
    遺傳 2022年12期
    關鍵詞:檢測

    吳丹丹,李榮,李曉南,劉倩琦,竇莉華

    遺傳資源

    一例基因復合雜合突變導致顱骨下頜骨皮膚發(fā)育不全B型的診斷和基因檢測分析

    吳丹丹,李榮,李曉南,劉倩琦,竇莉華

    南京醫(yī)科大學附屬兒童醫(yī)院兒童保健科,南京 210008

    顱骨下頜骨皮膚發(fā)育不全(mandibuloacral dysplasia,MAD)是一種罕見的常染色體隱性遺傳疾病,主要與及基因發(fā)生變異有關。本文報道了國內(nèi)首例顱骨下頜骨皮膚發(fā)育不全B型患者,主要表現(xiàn)為特殊面容、喂養(yǎng)困難、體格生長明顯落后、全面的發(fā)育遲緩伴牙齒和骨骼發(fā)育異常。全外顯子組家系測序結果顯示患者攜帶基因c.743C>T (p.Pro248Leu) (dbSNP: rs121908095)與1~10號外顯子缺失的復合雜合突變,經(jīng)Sanger測序與定量聚合酶鏈反應(real-time quantitative PCR, RT-qPCR)實驗檢測顯示,兩個突變分別遺傳自其表型正常的母親與父親。通過總結分析該例病例特點及其家系遺傳規(guī)律,對于臨床上難以進行明確診斷的疾病,建議進行全外顯子組家系測序,輔助疾病的診斷。該病例的發(fā)現(xiàn)提高了臨床醫(yī)師對MAD疾病的認識,也為該疾病后續(xù)的遺傳學研究提供新的臨床資料。

    基因;顱骨下頜骨皮膚發(fā)育不全B型;全外顯子組測序

    顱骨下頜骨皮膚發(fā)育不全(mandibuloacral dys-p-lasia,MAD)是一種罕見的常染色體隱性遺傳疾病,全世界報道不足百例。患者通常表現(xiàn)為生長發(fā)育遲緩、下頜骨發(fā)育不全、指骨和鎖骨遠端進行性骨溶解和皮膚色素沉著,部分患者可能表現(xiàn)為類早衰特征和脂肪營養(yǎng)不良,頸部和軀干脂肪組織異常[1~4]。根據(jù)脂肪營養(yǎng)分布的方式不同,可以將MAD分為A型(mandibuloacral dysplasia type A,MADA; MIM# 248370)和B型(mandibuloacral dysplasia type B,MADB; MIM# 608612)兩種,分別與與基因發(fā)生突變有關。到目前為止,國內(nèi)尚未有MADB病例的報道。本研究主要描述了1例南京兒童醫(yī)院兒童保健科收治MADB患兒的臨床診斷以及基因檢測結果,分析基因復合雜合突變的致病性,總結罕見病MADB的臨床表現(xiàn),并初步探索此罕見疾病的治療方案。案例的報道擴充了MADB的臨床表型,提高了臨床醫(yī)師對MADB疾病的認識,為后續(xù)該疾病的診斷與治療提供新的臨床資源,也為后續(xù)疾病與基因突變之間關系的理解提供了基礎。

    1 對象與方法

    1.1 對象及臨床資料收集

    患者為女性,2歲,漢族,因消瘦于2021年就診于南京醫(yī)科大學附屬兒童醫(yī)院兒童保健科,收集患者的病史、體格檢查、實驗室檢查、影像學檢查等臨床資料,并對患者及其父母進行基因檢測。本研究獲得南京醫(yī)科大學附屬兒童醫(yī)院醫(yī)學倫理委員會批準,其父母均簽署知情同意書。

    1.2 外周血DNA提取

    采集患兒及父母外周EDTA抗凝血3 mL,送北京智因東方轉化醫(yī)學研究中心(北京全譜醫(yī)學檢驗實驗室)進行全外顯子組家系測序(trio-whole exome sequencing, trio-WES)。使用血液基因組柱式中量提取試劑盒(江蘇康為世紀生物科技股份有限公司)提取基因組DNA,按照試劑盒說明書進行操作。提取的DNA樣本用Qubit 2.0型熒光計及0.8%的瓊脂糖凝膠電泳進行質檢,合格后繼續(xù)后續(xù)步驟。

    1.3 全外顯子組測序

    采用IDT公司xGen?Exome Research Panel v1.0捕獲探針與DNA文庫序列進行液體雜交,將目標區(qū)域DNA片段進行富集,構建全外顯子文庫,覆蓋人基因組中19,396個基因的編碼區(qū)及部分非編碼區(qū),捕獲區(qū)間大小51 Mb。通過Illumina公司NovaSeq 6000系列測序儀進行高通量測序(PE150),目標序列測序覆蓋度不低于99%。

    1.4 生物信息學分析

    使用fastp軟件對原始數(shù)據(jù)進行質控,去除接頭、低質量reads等。使用Burrows-Wheeler Aligner(BWA)軟件將測序序列與Ensemble參考基因組GRCh37/hg19比對;然后使用GATK軟件分析出SNP、Indel;最后根據(jù)測序深度、突變質量對檢測到的SNP、Indel進行過濾和篩選,得到高質量可靠的突變。使用自主開發(fā)的變異注釋軟件對檢測到的高質量變異進行各大數(shù)據(jù)庫(如dbSNP、千人基因組、ExAC、ESP等頻率數(shù)據(jù)庫及OMIM、HGMD、ClinVar等)的關聯(lián)注釋。借助Provean、SIFT、Polyphen2-HVAR、Polyphen2-HDIV、M-Cap、Revel、Mutationtaster等蛋白結構預測軟件,MaxEntScan剪切位點預測軟件等對其危害性進行分析,篩選出對蛋白結構可能有害影響的變異。

    1.5 Sanger測序

    對疑似目的基因候選變異位點設計引物:ZMPSTE24 c.743C>T正向引物5′-TATC-AAGCC-ACCAGTTTCTATCCC-3′,反向引物5′-CCTGGG-AATACCAGAGCAAGTAAG-3′,產(chǎn)物492 bp;應用KAPA2G Robμst HotStart PCR Kit(Sigma-Aldrich,美國)進行PCR擴增(Hema-9600基因擴增儀)。25 μL PCR反應體系:5× buffer A 5 μL,10 mmol/L dNTP 0.5 μL,10 μmol/L 上游引物 1.25 μL,10 μmol/L下游引物1.25 μL,DNA 1 μL,DNApolymerase 0.1 μL,PCR-grade water 15.9 μL。PCR反應程序:預變性95℃ 3 min,變性95℃ 30 s,退火60℃ 30 s,延伸72℃ 30 s,30個循環(huán),再次延伸72℃1 min。PCR產(chǎn)物進行Sanger測序(ABI3730測序儀)驗證疑似致病突變。

    1.5 定量聚合酶鏈反應(real-time quantitative PCR, RT-qPCR)檢測

    采用SYBR法對正常對照樣本及先證者及其父母樣本進行RT-qPCR檢測。以基因為內(nèi)參基因,檢測靶基因1~10個外顯子的拷貝數(shù)。根據(jù)轉錄本NM_005857,利用NCBI設計引物,其序列如下:

    參考基因:ALB正向引物5′-AGTGCACTTG-TT-GAGCTCGTG-3′,反向引物5′-GCAAAGCAGG-TC-TCCTTATCG-3′,產(chǎn)物128 bp,溫度:60℃。

    目標基因:ZMPSTE24-1Q-正向引物5′-GGG-ACGAGTGTCGGTGTG-3′,ZMPSTE24-1Q-反向引物5′- GGCATCTCCCACAAAGCGT-3′,產(chǎn)物100 bp,溫度:60℃;ZMPSTE24-5Q-正向引物5′-TTCTCA-GTTTCTTGTGGTAATGTTT-3′,ZMPSTE24-5Q-反向引物5′-CAACTAATGTGAACAGCCAGG-3′,產(chǎn)物181 bp,溫度:60℃;ZMPSTE24-10Q-正向引物5′-CTGACTGGTTGTTCTCAATGTGG-3′,ZMP-STE-24-10Q-反向引物5′-CTGCCAGGACAGAAA-T-A-ATCAGAA-3′,產(chǎn)物138 bp,溫度:60℃。

    20 μL反應體系:2×KAPA SYBR快速qPCR Master Mix通用10 μL, 10 μmol/L上游引物0.4 μL, 10 μmol/L下游引物0.4 μL,20 ng/μL DNA模板1 μL, ROX高0.4 μL, ddH2O 7.8 μL。PCR循環(huán):95℃ 3 min,95℃3 s,60℃30 s,40個循環(huán)。按照反應體系加入樣品,然后根據(jù)PCR周期使用qRT-PCR儀(ABI Step One Plus)進行擴增。采用2–ΔΔCt法進行數(shù)據(jù)分析,計算樣本間的表達比。

    1.6 變異致病性分析

    保守性分析:蛋白序列從UniProt網(wǎng)站下載。利用MEGA 7序列比對軟件對人類與其他物種的氨基酸序列進行比對。蛋白二級結構預測:蛋白結構域數(shù)據(jù)來自Pfam蛋白質家族數(shù)據(jù)庫(http://pfam. xfam.org/),DOG2.0軟件繪制蛋白質功能結構域組成示意圖。根據(jù)美國醫(yī)學遺傳學會(American College of Medical Genetics,ACMG)遺傳變異分類標準將檢測到的變異分類為“致病”,“可能致病”和“意義不明確”。

    2 結果與分析

    2.1 MADB患者的臨床表現(xiàn)

    患兒,女,2歲,因“消瘦”就診。患兒系第一胎第一產(chǎn),出生體重2.95 kg。體格檢查:體溫36℃,呼吸2次/min,血壓86/56 mmHg,心率100次/min,體重8.92 kg(–2.79SD),身長79.9 cm(–2.25SD),頭圍45.7 cm(–1.3SD),體重指數(shù)(body mass index,BMI)13.97 kg/m2(–1.54SD)。右側下肢皮膚咖啡斑約2 cm×4 cm,前囟已閉,頭發(fā)稀疏,脫發(fā),外耳耳廓畸形,下頜后縮,嘴呈“o”型,腹部平軟,全身皮下脂肪菲薄,四肢肌張力正常,雙手手指畸形、末節(jié)短?。▓D1)。診室內(nèi)配合,存在共同關注,可執(zhí)行簡單指令,1歲半獨走,理解力欠佳。

    實驗室檢查:血生化提示尿酸高539 μmol/L,血常規(guī)、甲狀腺功能、空腹胰島素、血液遺傳代謝檢查未見異常。影像學檢查:頭顱核磁提示兩側枕骨形態(tài)小,顱縫間見多發(fā)縫間骨(圖2,A和B);X片提示指端形態(tài)異常,末節(jié)指骨小,右足踇趾趾骨短小,左側正常(圖2,C和D);雙下肢X片、CT平掃提示雙側股骨、脛骨、坐骨、髂骨提示多發(fā)骨皮質吸收改變(圖2,E和F);脊柱、胸廓、髖關節(jié)、膝關節(jié)未見異常。0~6歲發(fā)育篩查測驗:發(fā)育商為68,智能發(fā)育分數(shù)為76;中文早期語言與溝通發(fā)育量表:總體語言相當于15~16月。24 h膳食評估提示:總能量、蛋白質、脂肪、碳水化合物攝取不足,微量元素:鐵、鋅、硒、銅、錳攝入不足,鈣、鈉、鉀鎂攝取過多;維生素E、B1、B2、煙酸;攝入過少。

    圖1 患者顱面部及手部特征

    A:患兒正面外觀:眼球突出、下頜后縮,嘴呈“o”型,牙齒發(fā)育不全;B:患兒側面外觀:下頜后縮、雙耳耳廓輕度畸形、頭發(fā)稀疏,脫發(fā);C:患兒雙手末節(jié)短小。

    圖2 患者影像學檢查結果

    A:頭顱核磁成像結果顯示顱縫間見多發(fā)大小不等卵石樣縫間骨;B:枕骨形態(tài)小,人字縫異常增寬;C:手足X片結果顯示指端形態(tài)異常,末節(jié)指骨小;D:右足踇趾趾骨短小,左側正常;E:雙下肢X片結果顯示雙側股骨上段及脛骨上段骨髓腔骨質密度不均勻;F:雙下肢CT平掃顯示雙側股骨脛腓骨上段前面及背側可見對稱性骨皮質異常,呈吸收樣表現(xiàn)。

    2.2 基因結果分析

    全外顯子組測序結果提示患兒基因(NM_005857)存在c.743C>T (p.Pro248Leu)與1~10號外顯子缺失的復合雜合變異。進一步的Sanger測序和RT-qPCR檢測結果顯示:突變c.743C>T來源于母親(圖3A),而1~10號外顯子缺失突變來源于父親(圖3B)?;颊吒改附】担虼?,檢測的基因復合雜合突變符合常染色體隱性遺傳(AR)疾病的發(fā)病機制,先證者及其家系成員表型及基因型符合共分離。突變c.743C>T為dbSNP中已報道的致病變異突變,突變會導致第248位氨基酸的替換(p.Pro248Leu)。Pro248在不同物種中高度保守(圖4A),且位于基因編碼蛋白FACE1的Peptidase_M48結構域(圖4,B和C),氨基酸的替換可能會影響FACE1催化功能,對蛋白功能造成損傷。1~10號外顯子缺失突變尚未被報道,預測會導致蛋白表達水平的下降。根據(jù)ACMG制定的遺傳變異分類標準與指南進行致病性分析:突變c.743C>T可評級為“可能致病(likely pathogenic)”變異(PS1 + PM1 + PM2 + PP3:PS1,c.743C>T與已確定的致病變異相同;PM1,位于已知無良性變異的關鍵功能域;PM2,低頻變異;PP3,多軟件預測致病),而1~10號外顯子缺失突變可評級為“可能致病(Likely pathogenic)”變異(PVS1+PM2:PVS1,基因功能可能喪失;PM2,正常對照人群中未發(fā)現(xiàn)的變異)。結合患者的臨床表型,且沒有其他表型相關的突變被檢測到,推測基因符合雜合突變導致患者疾病的發(fā)生。

    圖3 ZMPSTE24基因復合雜合變異的驗證結果

    A:Sanger測序驗證先證者及其父母的基因c.743C>T變異;B:實時定量PCR驗證先證者及其父母的基因1~10號外顯子缺失變異。

    圖4 ZMPSTE24基因c.743C>T(p.Pro248Leu)位點分析

    A:核酸保守性預測。p.Pro248Leu位于蛋白高度保守區(qū)域,突變后可能對蛋白功能造成損傷。B:蛋白二級結構展示。Peptidase_M48_N,也叫作CAAX prenyl protease 1, N-terminal,代表CAAX前陰性蛋白酶1N端5個跨膜α-片斷域;Peptidase_M48,也叫作CAAX prenyl protease 1,與FACE1蛋白是同系物,該區(qū)域代表FACE1蛋白主要的催化區(qū)域。C:蛋白跨膜結構預測。FACE1是跨膜蛋白,p.Pro248Leu突變位于核內(nèi)。

    3 討論

    MAD是一種罕見的常染色體隱性遺傳疾病,全世界報道不足百例。目前,MADB國內(nèi)尚未報道與基因有關。基因位于人1號染色體(1q34.2)的短臂上,是一種編碼核纖蛋白酶A的鋅蛋白酶[3, 5]的基因,該基因突變會導致脂肪細胞核膜的重要組成成分核纖層蛋白的結構異常,加速成熟脂肪細胞的凋亡,從而引起脂肪萎縮[6]。與MADA相比,MADB臨床表現(xiàn)出現(xiàn)更早、更嚴重、進展更快[7]。MADB臨床表現(xiàn)為下頜骨和鎖骨發(fā)育不全、末端趾骨破裂、骨質溶解、色素沉著、皮膚萎縮和廣泛性脂代謝不良,并伴有代謝綜合征,如胰島素抵抗、葡萄糖不耐受、糖尿病和高甘油三酯血癥[8]。目前尚未建立MADB的臨床診斷標準,基因檢測可以在大多數(shù)情況下明確MADB的診斷[9]。本例患兒與MADB典型的臨床特征高度一致,值得注意的是,本例患兒還具備其他臨床特征,例如,外耳廓耳廓畸形,耳廓結構簡單;另外患兒伴有智力發(fā)育、大運動發(fā)育、語言發(fā)育落后;患兒雖然沒有發(fā)現(xiàn)高胰島素血癥,但出現(xiàn)了高尿酸血癥,這些是以往未認識到的臨床特征?;純簷z驗結果顯示并未出現(xiàn)胰島素抵抗、高胰島素血癥的情況,另外患兒也未出現(xiàn)骨質溶解解,這可能均與兒童年齡較小有關,有待繼續(xù)隨訪觀察?,F(xiàn)將已報道的MADB患者的表型與本例患者表型總結(表1)。

    MADB的治療需要個體化對癥、支持性治療,需要兒科醫(yī)生、骨科醫(yī)生、內(nèi)分泌醫(yī)生、皮膚科醫(yī)生、營養(yǎng)師和其他醫(yī)療保健專業(yè)人員的團隊協(xié)作,進行系統(tǒng)、全面的計劃患兒的治療方案,包括飲食、運動、降脂藥和降糖藥等多方面的配合。目前還沒有臨床實驗來確定藥物治療的最佳使用來治療MAD的代謝并發(fā)癥。本例患兒出生后身高、體重增加緩慢,且營養(yǎng)評估提示患兒總能量、蛋白質、脂肪、碳水化合物攝取不足,同時伴有高尿酸血癥,僅僅提供高能量營養(yǎng)以實現(xiàn)追趕生長可能會增加代謝綜合征的風險,但是兒童必須保證足夠的能量攝入以保證生長發(fā)育的需要,因此可嘗試給予含中鏈脂肪酸奶粉喂養(yǎng),同時,由于可溶性植物纖維有明顯降低血三酰甘油和尿酸的作用,因此食物中應含充足的纖維素。針對此例患兒,建議換用富含中鏈脂肪酸的短肽高能量配方粉,同時制定高能量、高蛋白、高膳食纖維食譜,攝入纖維素的量為(年齡+ 5) g/天[10]。1個月后患兒體重增加1.1 kg,尿酸由539 μmol/L降至309 μmol/L,血糖、血脂、胰島素仍正常。這表明營養(yǎng)干預對于MADB兒童的生長追趕是有效的,并且可以降低高尿酸。隨后患兒接受下頜骨內(nèi)延長器植入術和下頜骨內(nèi)延長器調整術,住院52天期間給予患兒鼻飼和或流食喂養(yǎng),由于飲食攝入量受限,患兒體重未增長,目前處在術后恢復期。

    表1 已報道的MADB患者的表型與本例患者表型比較

    +:存在;–:不存在;NA:未報道。

    根據(jù)此例MADB患兒,本研究提供了MADB新的臨床特征,包括智力、運動、語言發(fā)育落后,高尿酸血癥,耳廓畸形,枕骨小,雙側股骨、脛骨、坐骨多發(fā)骨皮質吸收等,并對MADB兒童的生長追趕及尿酸代謝異常進行了營養(yǎng)治療上的初步嘗試并取得較好的治療效果,對于未來如何更好地指導MADB兒童進行適度的追趕,預防遠期高尿酸血癥、高脂血癥和胰島素抵抗,對于兒科醫(yī)生來說是個挑戰(zhàn),需要進行長期的追蹤隨訪。該案例提示人們,對于基于臨床無法診斷疾病的患者,應及時進行基因檢測,盡早對患兒進行明確診斷并給予有效治療,更好地改善患者的臨床結局?;颊咴敿毜呐R床信息與基因檢測結果,也為該疾病后續(xù)的遺傳學研究提供了基礎。

    [1] Simha V, Garg A. Body fat distribution and metabolic derangements in patients with familial partial lipodystro-phy associated with mandibuloacral dysplasia., 2002, 87(2): 776–785.

    [2] Shen JJ, Brown CA, Lupski JR, Potocki L. Mandibuloacraldysplasia is caused by homozygosity for the R527H mutation in lamin A/C., 2003, 40(11): 854–857.

    [3] Novelli G, Muchir A, Sangiuolo F, Helbing-Leclerc A, D'Apice MR, Massart C, Sbraccia P, Federice M, Lauro R, Tudisco C, Pollatta R, Scarano G, Dallapiccola B, Merlini L, Bonne G. Mandibuloacral dysplasia is caused by a mutation in LMNA-encoding lamin A/C., 2002, 71(2): 426–431.

    [4] Agarwal AK, Kazachkova I, Ten S, Garg A. Severe mandibuloacral dysplasia-associated lipodystrophy and progeria in a young girl with a novel homozygous Arg527Cys LMNA mutation., 2008, 93(12):4617–4623.

    [5] Agarwal AK, Fryns JP, Auchus RJ, Garg A. Zinc metallo-proteinase, ZMPSTE24, is mutated in mandibuloacral dysplasia., 2003, 12(16): 1995–2001.

    [6] Lattanzi G, Benedetti S, Bertini E, Boriani G, Mazzanti L, Novelli G, Pasquali R, Pini A, Politano L. Laminopathies: many diseases, one gene. Report of the first Italian meeting course on laminopathies., 2011, 30(2): 138–143.

    [7] Miyoshi Y, Akagi M, Agarwal AK, Namba N, Kato- Nishimura K, Mohri I, Yamagata M, Nakajima S, Mu-shiake S, Shima M, Auchus RJ, Taniike M, Garg A, Ozono K. Severe mandibuloacral dysplasia caused by novel com-pound heterozygous ZMPSTE24 mutations in two Japanese siblings.t, 2008, 73(6): 535–544.

    [8] Haye D, Dridi H, Levy J, Lambert V, Lambert M, Agha M, Adjimi F, Kohlhase J, Lipsker D, Verlose A. Failure of ossification of the occipital bone in mandibuloacral dysplasia type B., 2016, 170(10): 2750–2755.

    [9] Brown RJ, Araujo-Vilar D, Cheung PT, Dunger D, Garg A, Jack M, Mungai L, Oral EA, Patni N, Rother KI, von Schnurbein J, Sorkina E, Stanley T, Vigouroux C, Wabitsch M, Williams R, Yorifuji T. The diagnosis and management of lipodystrophy syndromes: a multi-society practice guideline., 2016, 101(12): 4500–4511.

    [10] Li XZ, Huang XJ. Congenital and acquired lipodystrophies., 2015, 30(20): 1533-1537.

    李秀珍, 黃新疆. 先天性及獲得性脂肪營養(yǎng)不良. 中華實用兒科臨床雜志, 2015, 30(20): 1533–1537.

    Diagnosis and genetic analysis of a case with mandibuloacral dysplasia type B due to compound heterozygous mutations of thegene

    Dandan Wu, Rong Li, Xiaonan Li, Qianqi Liu, Lihua Dou

    Mandibuloacral dysplasia (MAD) is a rare autosomal recessive disorder, mainly caused by pathogenic variants of theandgenes. In this study, we reported the first case of a patient with type B cranial and mandibular dysplasia in China. The patient presented with distinctive facial features, feeding difficulties, significant physical retardation, and overall developmental delay with abnormal tooth and bone development. Trio-whole exome sequencing analysis showed that the patient carried compound heterozygous mutations of c.743C>T (p.Pro248Leu) (dbSNP: rs121908095) and the loss of exons 1-10 of thegene. Sanger sequencing and real-time quantitative PCR (RT-qPCR) showed that these two mutations were inherited from the patient’s phenotypically normal mother and father, respectively. By summarizing and analyzing the characteristics of this case and the pedigree of the family, we suggested that trio-whole-exome sequencing could be performed to assist in the diagnosis of diseases that are difficult to be diagnosed definitively based on clinical phenotypes. The publication of this case has improved clinicians’ understanding of MAD disease and provide new clinical information for the subsequent genetic study of this disease.

    ; mandibuloacral dysplasia type B; whole exome sequencing

    2022-07-25;

    2022-09-06;

    2022-09-15

    吳丹丹,碩士,主治醫(yī)師,研究方向:兒童發(fā)育行為。E-mail: nantongwudandan@163.com

    李榮,碩士,副主任醫(yī)師,研究方向:兒童發(fā)育與營養(yǎng)。E-mail: 15850780062@163.com

    10.16288/j.yczz.22-117

    (責任編委: 周紅文)

    猜你喜歡
    檢測
    QC 檢測
    “不等式”檢測題
    “一元一次不等式”檢測題
    “一元一次不等式組”檢測題
    “幾何圖形”檢測題
    “角”檢測題
    “有理數(shù)的乘除法”檢測題
    “有理數(shù)”檢測題
    “角”檢測題
    “幾何圖形”檢測題
    国产精品亚洲一级av第二区| 日韩 欧美 亚洲 中文字幕| 黑人操中国人逼视频| 国产人伦9x9x在线观看| 91麻豆av在线| 成人国语在线视频| 少妇的丰满在线观看| 黄片大片在线免费观看| 又大又爽又粗| 桃红色精品国产亚洲av| 亚洲精品久久国产高清桃花| a级毛片在线看网站| 99国产精品一区二区蜜桃av| 国产成人精品无人区| 免费看美女性在线毛片视频| 久久久精品欧美日韩精品| 日韩三级视频一区二区三区| 国产精品,欧美在线| www.999成人在线观看| 国产精品久久久人人做人人爽| 国产精品久久久av美女十八| 欧美又色又爽又黄视频| 人人妻人人澡欧美一区二区| 午夜免费成人在线视频| 国产男靠女视频免费网站| 最好的美女福利视频网| 国产爱豆传媒在线观看 | 极品教师在线免费播放| 露出奶头的视频| a级毛片a级免费在线| 亚洲中文av在线| 露出奶头的视频| 搡老妇女老女人老熟妇| 欧美在线一区亚洲| 久久精品国产亚洲av高清一级| 精品国产乱码久久久久久男人| 黄频高清免费视频| 欧美日韩乱码在线| 叶爱在线成人免费视频播放| 99国产综合亚洲精品| 亚洲精品美女久久av网站| 天天一区二区日本电影三级| 在线国产一区二区在线| 亚洲av熟女| 国产精品香港三级国产av潘金莲| 色综合婷婷激情| 亚洲av电影不卡..在线观看| 亚洲精品久久国产高清桃花| 两个人免费观看高清视频| 久久香蕉精品热| 九色国产91popny在线| 久久香蕉激情| 女生性感内裤真人,穿戴方法视频| 欧美一区二区精品小视频在线| 悠悠久久av| 无遮挡黄片免费观看| 一区福利在线观看| 精品乱码久久久久久99久播| 久久香蕉国产精品| 叶爱在线成人免费视频播放| 色播亚洲综合网| 一个人观看的视频www高清免费观看 | 99riav亚洲国产免费| 成年人黄色毛片网站| 久久久久性生活片| www国产在线视频色| 国产精品亚洲av一区麻豆| 精品日产1卡2卡| 女人被狂操c到高潮| 成人18禁在线播放| 欧美最黄视频在线播放免费| 无限看片的www在线观看| 亚洲最大成人中文| 精品国产亚洲在线| 2021天堂中文幕一二区在线观| 亚洲精品一区av在线观看| www日本黄色视频网| 日韩欧美三级三区| 中文字幕人妻丝袜一区二区| ponron亚洲| 国产精品亚洲一级av第二区| ponron亚洲| 久久国产乱子伦精品免费另类| 色噜噜av男人的天堂激情| 男女床上黄色一级片免费看| 一个人免费在线观看的高清视频| 国产成人精品久久二区二区91| 亚洲五月婷婷丁香| 可以在线观看的亚洲视频| 可以免费在线观看a视频的电影网站| 在线播放国产精品三级| 色综合婷婷激情| 国产精品一区二区三区四区免费观看 | 99国产精品一区二区三区| 黑人巨大精品欧美一区二区mp4| 老司机靠b影院| 男人舔女人的私密视频| 在线视频色国产色| 国产主播在线观看一区二区| 精品乱码久久久久久99久播| 国产av不卡久久| 国产黄色小视频在线观看| 国产精品久久久久久人妻精品电影| 青草久久国产| 狂野欧美激情性xxxx| 亚洲第一电影网av| 人人妻人人看人人澡| 国产精品99久久99久久久不卡| 我的老师免费观看完整版| av天堂在线播放| 97人妻精品一区二区三区麻豆| 在线永久观看黄色视频| 欧美黄色片欧美黄色片| 精品久久久久久久毛片微露脸| 叶爱在线成人免费视频播放| 久久久久久久精品吃奶| 给我免费播放毛片高清在线观看| 又大又爽又粗| 亚洲色图 男人天堂 中文字幕| 中文字幕精品亚洲无线码一区| 少妇的丰满在线观看| 在线观看美女被高潮喷水网站 | 久久人妻av系列| 精华霜和精华液先用哪个| 亚洲 欧美一区二区三区| 丰满人妻一区二区三区视频av | 久久亚洲精品不卡| 国产精品久久久人人做人人爽| 国产一区二区激情短视频| 亚洲一码二码三码区别大吗| 成年人黄色毛片网站| 精品无人区乱码1区二区| 成年女人毛片免费观看观看9| 99热这里只有是精品50| 欧美日韩国产亚洲二区| 黑人巨大精品欧美一区二区mp4| 91字幕亚洲| 久久婷婷人人爽人人干人人爱| 变态另类丝袜制服| 九九热线精品视视频播放| 一个人免费在线观看电影 | av超薄肉色丝袜交足视频| 精品无人区乱码1区二区| 亚洲欧洲精品一区二区精品久久久| 中文资源天堂在线| 亚洲欧美精品综合一区二区三区| 波多野结衣高清无吗| 草草在线视频免费看| 露出奶头的视频| 免费人成视频x8x8入口观看| 亚洲欧美日韩高清专用| 欧美丝袜亚洲另类 | 舔av片在线| 亚洲国产精品成人综合色| 好男人在线观看高清免费视频| 狂野欧美白嫩少妇大欣赏| 成熟少妇高潮喷水视频| 免费观看精品视频网站| 又紧又爽又黄一区二区| 91字幕亚洲| 男女做爰动态图高潮gif福利片| 久久久水蜜桃国产精品网| 国产高清有码在线观看视频 | 免费观看精品视频网站| 又黄又爽又免费观看的视频| 91字幕亚洲| 国产精品一及| 丝袜美腿诱惑在线| a在线观看视频网站| 国产成人欧美在线观看| 日韩大尺度精品在线看网址| 欧美激情久久久久久爽电影| 欧美日韩黄片免| 小说图片视频综合网站| 国产亚洲精品第一综合不卡| www日本黄色视频网| 我要搜黄色片| 欧美成狂野欧美在线观看| 午夜成年电影在线免费观看| 亚洲av五月六月丁香网| 97人妻精品一区二区三区麻豆| 淫秽高清视频在线观看| 久久九九热精品免费| 精品久久久久久成人av| 亚洲国产日韩欧美精品在线观看 | 校园春色视频在线观看| 中文资源天堂在线| 日本免费一区二区三区高清不卡| 国产91精品成人一区二区三区| 午夜亚洲福利在线播放| 在线观看免费午夜福利视频| 99热这里只有精品一区 | 美女扒开内裤让男人捅视频| 99久久99久久久精品蜜桃| 999精品在线视频| 国产私拍福利视频在线观看| 欧美日韩乱码在线| av福利片在线| 久久久精品大字幕| 三级男女做爰猛烈吃奶摸视频| 日韩欧美精品v在线| 黄色视频不卡| 亚洲九九香蕉| 免费搜索国产男女视频| 久99久视频精品免费| 国产又黄又爽又无遮挡在线| 婷婷丁香在线五月| 99热这里只有是精品50| 制服人妻中文乱码| 又黄又爽又免费观看的视频| 国产av在哪里看| 91成年电影在线观看| 99在线视频只有这里精品首页| 国内久久婷婷六月综合欲色啪| 特级一级黄色大片| 一区二区三区高清视频在线| 天堂动漫精品| 夜夜爽天天搞| 狂野欧美激情性xxxx| 欧美高清成人免费视频www| 色哟哟哟哟哟哟| 亚洲激情在线av| 人成视频在线观看免费观看| 久久久久性生活片| 日日夜夜操网爽| 在线观看www视频免费| 国产一区在线观看成人免费| 女生性感内裤真人,穿戴方法视频| 99riav亚洲国产免费| 日韩欧美在线二视频| 岛国在线观看网站| 人人妻,人人澡人人爽秒播| 国产精品日韩av在线免费观看| 91国产中文字幕| 日韩欧美在线二视频| 老熟妇乱子伦视频在线观看| 天天躁狠狠躁夜夜躁狠狠躁| 九九热线精品视视频播放| 黄色片一级片一级黄色片| 国内精品久久久久精免费| 国产1区2区3区精品| 国产伦在线观看视频一区| 久久国产乱子伦精品免费另类| 久久久精品欧美日韩精品| 亚洲欧美激情综合另类| 麻豆一二三区av精品| 一区二区三区激情视频| 欧美黑人精品巨大| 欧美黑人巨大hd| 精品午夜福利视频在线观看一区| 熟妇人妻久久中文字幕3abv| 亚洲成人精品中文字幕电影| 国产精品九九99| 好男人在线观看高清免费视频| 一本精品99久久精品77| 精品福利观看| 国产不卡一卡二| 一个人免费在线观看电影 | 成年免费大片在线观看| 法律面前人人平等表现在哪些方面| 亚洲va日本ⅴa欧美va伊人久久| 少妇人妻一区二区三区视频| av在线天堂中文字幕| 免费在线观看黄色视频的| 窝窝影院91人妻| 欧美又色又爽又黄视频| 嫩草影院精品99| 亚洲成a人片在线一区二区| 国产免费男女视频| 色在线成人网| 亚洲av电影在线进入| 亚洲人成电影免费在线| 99国产精品99久久久久| 日韩欧美国产一区二区入口| 久久久久久国产a免费观看| 给我免费播放毛片高清在线观看| 淫妇啪啪啪对白视频| 日本免费一区二区三区高清不卡| av有码第一页| 国产成人aa在线观看| 免费在线观看日本一区| 国产高清视频在线播放一区| 国产一区二区在线av高清观看| 一级作爱视频免费观看| 国产激情偷乱视频一区二区| 又粗又爽又猛毛片免费看| 视频区欧美日本亚洲| 亚洲成a人片在线一区二区| 国产伦一二天堂av在线观看| 亚洲自拍偷在线| 亚洲av第一区精品v没综合| 国产97色在线日韩免费| 国产精品电影一区二区三区| 亚洲精品中文字幕在线视频| 亚洲精品粉嫩美女一区| 99热6这里只有精品| 欧美日韩国产亚洲二区| 一级a爱片免费观看的视频| 国产精品久久久久久人妻精品电影| √禁漫天堂资源中文www| 不卡av一区二区三区| 亚洲成人精品中文字幕电影| 久久人妻福利社区极品人妻图片| 亚洲一区高清亚洲精品| 两性午夜刺激爽爽歪歪视频在线观看 | 一级a爱片免费观看的视频| 欧美在线一区亚洲| √禁漫天堂资源中文www| 女同久久另类99精品国产91| 亚洲国产欧洲综合997久久,| 日韩有码中文字幕| 又黄又粗又硬又大视频| 国内揄拍国产精品人妻在线| 给我免费播放毛片高清在线观看| 亚洲av成人一区二区三| 精品久久久久久,| 精品久久久久久久末码| 国产精品电影一区二区三区| 免费看a级黄色片| 欧美黑人巨大hd| 啦啦啦观看免费观看视频高清| 亚洲成人精品中文字幕电影| 1024视频免费在线观看| 黄色毛片三级朝国网站| 日韩成人在线观看一区二区三区| av视频在线观看入口| 伦理电影免费视频| 亚洲 欧美 日韩 在线 免费| 岛国视频午夜一区免费看| 精品无人区乱码1区二区| 亚洲午夜理论影院| 日韩欧美 国产精品| 我要搜黄色片| 久久热在线av| 久久婷婷成人综合色麻豆| 99国产综合亚洲精品| 制服人妻中文乱码| 成人av一区二区三区在线看| 亚洲九九香蕉| 日本在线视频免费播放| 久久久久久免费高清国产稀缺| 国产一区二区激情短视频| 少妇的丰满在线观看| 久热爱精品视频在线9| 国产av不卡久久| 欧美3d第一页| 免费无遮挡裸体视频| 亚洲av美国av| 狂野欧美白嫩少妇大欣赏| 欧美绝顶高潮抽搐喷水| 国产精品一及| 中文字幕精品亚洲无线码一区| 欧美精品啪啪一区二区三区| 宅男免费午夜| 99久久国产精品久久久| 熟妇人妻久久中文字幕3abv| 亚洲成人国产一区在线观看| 亚洲人与动物交配视频| 亚洲一区中文字幕在线| 亚洲男人天堂网一区| 久久久国产成人精品二区| 一二三四在线观看免费中文在| 亚洲国产欧洲综合997久久,| 欧美黄色淫秽网站| 久热爱精品视频在线9| 亚洲国产欧洲综合997久久,| 在线观看免费午夜福利视频| 成人永久免费在线观看视频| 国产精品久久久人人做人人爽| 两性夫妻黄色片| 在线观看舔阴道视频| 久久中文看片网| 成年女人毛片免费观看观看9| 精品不卡国产一区二区三区| 女生性感内裤真人,穿戴方法视频| 特大巨黑吊av在线直播| 18禁观看日本| 男女视频在线观看网站免费 | 色综合婷婷激情| 日韩精品免费视频一区二区三区| 亚洲欧美日韩高清专用| 国产精品乱码一区二三区的特点| 一二三四社区在线视频社区8| 一级作爱视频免费观看| 久久久久免费精品人妻一区二区| 国产av一区二区精品久久| bbb黄色大片| 老熟妇乱子伦视频在线观看| 亚洲18禁久久av| 精品一区二区三区四区五区乱码| 国产精品1区2区在线观看.| 免费高清视频大片| 精品久久蜜臀av无| 麻豆久久精品国产亚洲av| 两个人视频免费观看高清| 国产又黄又爽又无遮挡在线| 亚洲欧美日韩无卡精品| 久久久久久久精品吃奶| 久久午夜综合久久蜜桃| 日韩成人在线观看一区二区三区| 给我免费播放毛片高清在线观看| netflix在线观看网站| 国产精品,欧美在线| 操出白浆在线播放| 亚洲精品一卡2卡三卡4卡5卡| 亚洲国产欧美人成| 国产又黄又爽又无遮挡在线| 少妇人妻一区二区三区视频| 毛片女人毛片| 一本综合久久免费| 久久中文看片网| 久久久国产成人精品二区| 999精品在线视频| 啪啪无遮挡十八禁网站| 亚洲中文日韩欧美视频| 精品乱码久久久久久99久播| 国产区一区二久久| 成人特级黄色片久久久久久久| 成在线人永久免费视频| svipshipincom国产片| 2021天堂中文幕一二区在线观| 99riav亚洲国产免费| 国产伦在线观看视频一区| 日韩三级视频一区二区三区| 法律面前人人平等表现在哪些方面| 最好的美女福利视频网| 亚洲色图 男人天堂 中文字幕| 在线观看www视频免费| 五月伊人婷婷丁香| 一级作爱视频免费观看| 日日夜夜操网爽| 一a级毛片在线观看| 亚洲人成伊人成综合网2020| 在线观看免费视频日本深夜| 搡老妇女老女人老熟妇| 成人欧美大片| 国产精品久久久久久精品电影| 精品一区二区三区四区五区乱码| 在线观看免费视频日本深夜| 亚洲欧美一区二区三区黑人| 精品高清国产在线一区| 欧美午夜高清在线| 亚洲第一欧美日韩一区二区三区| 精品电影一区二区在线| 国产成人影院久久av| 不卡av一区二区三区| 欧美日韩中文字幕国产精品一区二区三区| 国产久久久一区二区三区| 在线视频色国产色| 操出白浆在线播放| 小说图片视频综合网站| 性色av乱码一区二区三区2| 丁香六月欧美| 精品国产美女av久久久久小说| 欧美极品一区二区三区四区| 又粗又爽又猛毛片免费看| 18禁裸乳无遮挡免费网站照片| 亚洲va日本ⅴa欧美va伊人久久| 亚洲av日韩精品久久久久久密| 午夜精品一区二区三区免费看| 日韩欧美一区二区三区在线观看| 夜夜夜夜夜久久久久| 亚洲专区中文字幕在线| 午夜精品在线福利| 中文亚洲av片在线观看爽| 亚洲国产欧美一区二区综合| 在线国产一区二区在线| 男女床上黄色一级片免费看| 99热这里只有精品一区 | 黄色毛片三级朝国网站| 欧美黄色片欧美黄色片| 国产成人aa在线观看| 精品国产亚洲在线| 国产精品久久视频播放| 成人永久免费在线观看视频| 亚洲狠狠婷婷综合久久图片| 看免费av毛片| 美女黄网站色视频| 国产片内射在线| 精品久久久久久,| 99久久国产精品久久久| 亚洲精品中文字幕在线视频| 亚洲精华国产精华精| 日韩精品中文字幕看吧| 欧美日韩乱码在线| 国产成人精品久久二区二区免费| 男女床上黄色一级片免费看| xxx96com| 丰满的人妻完整版| 欧美日韩亚洲国产一区二区在线观看| 日韩欧美精品v在线| 桃色一区二区三区在线观看| 999久久久国产精品视频| 精品欧美国产一区二区三| 亚洲成人免费电影在线观看| 亚洲精华国产精华精| 曰老女人黄片| 亚洲av熟女| 欧美激情久久久久久爽电影| 亚洲七黄色美女视频| 一本大道久久a久久精品| 国产精品精品国产色婷婷| 午夜日韩欧美国产| 色综合站精品国产| 99国产精品99久久久久| 国产欧美日韩精品亚洲av| 日本一本二区三区精品| 亚洲国产看品久久| 中出人妻视频一区二区| 无遮挡黄片免费观看| 国产日本99.免费观看| ponron亚洲| 最近在线观看免费完整版| 999久久久精品免费观看国产| 国模一区二区三区四区视频 | 久久香蕉精品热| a在线观看视频网站| 在线a可以看的网站| 免费搜索国产男女视频| 国产黄片美女视频| 99久久无色码亚洲精品果冻| 久久久久国产精品人妻aⅴ院| 欧美日韩乱码在线| 在线十欧美十亚洲十日本专区| 搡老妇女老女人老熟妇| 欧美绝顶高潮抽搐喷水| 国产av麻豆久久久久久久| 欧美黄色片欧美黄色片| 久久人妻av系列| 国产欧美日韩一区二区三| 亚洲国产精品久久男人天堂| 99re在线观看精品视频| 婷婷丁香在线五月| 国产不卡一卡二| 亚洲男人的天堂狠狠| 午夜福利欧美成人| √禁漫天堂资源中文www| 国产蜜桃级精品一区二区三区| 在线播放国产精品三级| 免费电影在线观看免费观看| 黑人欧美特级aaaaaa片| 99在线人妻在线中文字幕| 免费一级毛片在线播放高清视频| 国产一区二区激情短视频| 日日摸夜夜添夜夜添小说| 国产一区二区激情短视频| 一级毛片高清免费大全| 久久久国产精品麻豆| 国产成人精品久久二区二区免费| 亚洲国产欧美人成| 9191精品国产免费久久| 亚洲中文av在线| 亚洲av中文字字幕乱码综合| 欧美黑人欧美精品刺激| 国产又黄又爽又无遮挡在线| 香蕉av资源在线| 日本一本二区三区精品| 国产精品久久久久久精品电影| 国产av一区在线观看免费| 少妇被粗大的猛进出69影院| 在线播放国产精品三级| 亚洲激情在线av| 高潮久久久久久久久久久不卡| 19禁男女啪啪无遮挡网站| 亚洲精品av麻豆狂野| 老汉色av国产亚洲站长工具| 免费在线观看日本一区| 国产黄a三级三级三级人| 50天的宝宝边吃奶边哭怎么回事| 久久精品国产清高在天天线| 制服人妻中文乱码| 国产真人三级小视频在线观看| 亚洲欧美精品综合久久99| 亚洲成人精品中文字幕电影| 老司机午夜福利在线观看视频| 啦啦啦免费观看视频1| 欧美黄色淫秽网站| 欧美日本亚洲视频在线播放| 狂野欧美白嫩少妇大欣赏| 午夜免费成人在线视频| x7x7x7水蜜桃| 久久久国产欧美日韩av| 成年免费大片在线观看| 成人国产一区最新在线观看| 国产成人av教育| 妹子高潮喷水视频| av福利片在线| 久久欧美精品欧美久久欧美| 亚洲欧美激情综合另类| 午夜福利在线在线| 两人在一起打扑克的视频| 美女大奶头视频| 一级作爱视频免费观看| 欧美激情久久久久久爽电影| 少妇裸体淫交视频免费看高清 | 亚洲电影在线观看av| 99久久无色码亚洲精品果冻| 亚洲精品av麻豆狂野| 长腿黑丝高跟| 高潮久久久久久久久久久不卡| 国产精品av视频在线免费观看| 美女 人体艺术 gogo| 日韩精品青青久久久久久| 日本撒尿小便嘘嘘汇集6| 国产野战对白在线观看| 午夜福利视频1000在线观看| 777久久人妻少妇嫩草av网站| 我要搜黄色片| 亚洲一区中文字幕在线| 亚洲国产欧美一区二区综合| 日本黄色视频三级网站网址| 亚洲人与动物交配视频| 无遮挡黄片免费观看| 精品午夜福利视频在线观看一区| 亚洲激情在线av|