卵母細(xì)胞敲除Rictor對紡錘體和早期胚胎發(fā)育的影響

劉紅，成艷君，周永紅，李雪梅

(南方醫(yī)科大學(xué)附屬深圳市婦幼保健院生殖中心，深圳 518017)

卵巢中原始卵泡池大小是女性和大多數(shù)哺乳動物生殖壽命的主要決定因素[1]。一般情況下，40歲以上女性原始卵泡池開始出現(xiàn)耗竭，進(jìn)入卵巢衰竭或更年期。當(dāng)剩余卵泡數(shù)量減少到閾值以下(<1 000個)時，卵泡的正常激活不再發(fā)生，發(fā)育卵泡停止募集，導(dǎo)致無排卵和閉經(jīng)[2]。卵巢早衰(POF)是指女性40歲以前出現(xiàn)排卵和卵巢分泌激素功能紊亂和停止的疾病，嚴(yán)重危害女性的生育能力[2-3]。全世界約有1%的女性患有POF，誘因主要有自身免疫性卵巢損傷、染色體異?；蚰承┨囟ɑ虻倪z傳異常[4]。雖然FMR1[5-7]、FMR2[7]、FOXL2[8]等基因被認(rèn)為是導(dǎo)致POF的候選基因，但臨床上大多數(shù)病例為特發(fā)性病因[9]，發(fā)病機(jī)制尚不明確，為POF的防治增加了難度。

Rictor蛋白由1 708個氨基酸組成，含約37個磷酸化位點，主要是位于C端區(qū)域的絲氨酸或蘇氨酸殘基[10-12]。Rictor可通過AKT依賴和不依賴的方式在細(xì)胞增殖、遷移和代謝中起重要作用，進(jìn)而影響細(xì)胞功能[13-15]。研究發(fā)現(xiàn)，Rictor對小鼠的胚胎發(fā)育至關(guān)重要，Rictor缺失會導(dǎo)致小鼠胚胎期死亡[16]。Rictor在小鼠卵巢中分布廣泛，參與卵母細(xì)胞減數(shù)分裂過程中肌動蛋白的不對稱分裂，對卵母細(xì)胞的成熟起決定性作用[17]。然而尚未有研究闡明Rictor在卵泡形成中的作用機(jī)制。本課題組已成功構(gòu)建卵母細(xì)胞條件性敲除Rictor基因小鼠模型，該小鼠可出現(xiàn)POF表型[18]，但Rictor如何誘導(dǎo)POF進(jìn)而導(dǎo)致雌鼠生育能力下降的分子機(jī)制不明。因此，本研究擬通過探討Rictor基因敲除對小鼠卵母細(xì)胞功能的影響，進(jìn)一步闡明Rictor在卵母細(xì)胞發(fā)生和早期胚胎發(fā)育中的調(diào)控作用，為POF等相關(guān)疾病提供新的理論依據(jù)和潛在治療靶點。

材料與方法

一、材料

1.小鼠的繁育與基因型鑒定[18]：本研究所需的Zp3-Cre小鼠(Jax編號003650)及Rictorloxp/loxp小鼠均由南方醫(yī)科大學(xué)陳振國課題組饋贈。獲得卵母細(xì)胞條件性敲除小鼠的實驗簡要概述如下：將雄性Zp3-Cre+小鼠與雌性Rictorloxp/loxp小鼠交配，得到Zp3-Cre+，Rictorloxp/WT雄性小鼠，再與Rictorloxp/loxp雌性小鼠回交，獲得Zp3-Cre+，Rictorloxp/loxp雌性小鼠，即為條件性敲除(Rictor-cKO)小鼠(KO組)。取同窩Zp3-Cre-，Rictorloxp/loxp雌性小鼠作為對照組(WT組)。利用免疫組織化學(xué)染色驗證敲除效果。在卵母細(xì)胞條件性敲除實驗中，攜帶Cre轉(zhuǎn)基因的雄性(而非雌性)被用于育種，以防止全身性敲除[19]?；蛐丸b定的引物如下，Zp3-F：5’-GCGGTCTGGCAGTAAAAACTATC-3’，Zp3-R：5’-GTGAAAACAGCATTGCTGTCACTT-3’；Rictor-F：5’-GAAGTTATTCAGATGGCCCAGC-3’，Rictor-R：5’-ACTGAATATGTTCATGGTTGTG-3’。所有動物實驗均得到了南方醫(yī)科大學(xué)動物使用和倫理委員會的批準(zhǔn)，并按照該委員會的指導(dǎo)方針和規(guī)定進(jìn)行。

2.主要試劑、耗材與儀器：M2培養(yǎng)基(M7167，Sigma，德國)；含10%血清替代品(SSS，Irvine公司，美國)的人胚胎卵裂培養(yǎng)基(ECM，Irvine公司，美國)；DAB顯色液(中杉金橋)。人絨毛膜促性腺激素(HCG)、孕馬血清促性腺激素(PMSG) 均購自寧波第二激素廠；Rictor 、a/β-Tubulin(2148S) 一抗均購自Cell Signaling Technology(美國)；熒光二抗(111-035-003)購自Jacksonimmuno(美國)。所用培養(yǎng)皿無特殊說明均購自美國康寧公司。Eppendorf Transferman顯微操作系統(tǒng)(德國)；Olympus倒置顯微鏡(日本)。

二、方法

1.卵母細(xì)胞獲取及形態(tài)評估：取4月齡的雌鼠腹腔注射PMSG(7.5 U/只)，48 h后注射HCG(10 U/只)，13.5 h后脫臼法處死小鼠，剪取輸卵管。在體視鏡下使用注射器針頭劃破輸卵管壺腹部，挑出卵丘卵母細(xì)胞復(fù)合體(COCs)，用0.3 mol/L的透明質(zhì)酸酶消化處理，即可獲得卵母細(xì)胞。正常第二次減數(shù)分裂中期(MⅡ)卵母細(xì)胞形態(tài)鑒定標(biāo)準(zhǔn)：卵周間隙適中可見第一極體，透明帶光滑無鋸齒狀等異常改變，胞質(zhì)顆粒均勻無空泡。選取形態(tài)較好的卵母細(xì)胞轉(zhuǎn)入人卵裂培養(yǎng)基中，置于37℃、5.8%CO2培養(yǎng)箱中孵育備用。

2.卵母細(xì)胞漿內(nèi)單精子注射(ICSI)[20]：應(yīng)用顯微操作系統(tǒng)，在M2液滴中進(jìn)行顯微注射。注射針吸入野生型雄鼠的精子頭，使精子頭位于注射針尖端，固定針固定卵母細(xì)胞，將第一極體置于12點或6點，注射針刺入卵母細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)，緩慢回吸后形成負(fù)壓破膜，將精子頭注射入卵母細(xì)胞胞質(zhì)中心區(qū)域，稍作停頓退出注射針。注射后的卵母細(xì)胞置于人胚胎卵裂培養(yǎng)基中，37℃、5% CO2的培養(yǎng)箱內(nèi)孵育觀察。

3.卵母細(xì)胞減數(shù)分裂紡錘體狀態(tài)和染色體排列的評價[21-22]：取透明質(zhì)酸酶脫顆粒細(xì)胞處理后的卵母細(xì)胞，用酸性的M2培養(yǎng)基去除透明帶并轉(zhuǎn)移至含1%明膠的載玻片上，于含2%BSA、0.02% Triton-X 100的2%多聚甲醛中固定30 min，用含2%BSA的0.05% Triton-X 100破膜15 min，正常山羊血清37℃封閉1 h，PBS洗3次后加入含2% BSA與0.05% Triton-X 100的兔抗a/β-tubulin(1∶200)一抗，4℃過夜，PBS洗3次后加入含2% BSA與0.05% Triton-X 100的山羊抗兔IgG，37℃孵育1 h。最后用10 μg/L DAPI避光孵育15 min，激光共聚焦顯微鏡下觀察微管的分布及染色體的排列情況。當(dāng)卵母細(xì)胞減數(shù)分裂紡錘體排列松散和/或染色體排列異常以及沒有紡錘體和/或染色體時，定義為紡錘體或染色體異常。

4.觀察指標(biāo)：包括2PN(精卵原核融合時期)數(shù)量、2-細(xì)胞胚胎(受精卵第一次有絲分裂)數(shù)量和4-細(xì)胞胚胎(受精卵第二次有絲分裂)數(shù)量。2PN率=2PN數(shù)量/注射卵母細(xì)胞數(shù)×100%；2-細(xì)胞胚胎率=2-細(xì)胞胚胎數(shù)量/2PN數(shù)量×100%；4-細(xì)胞胚胎率=4-細(xì)胞胚胎數(shù)量/2-細(xì)胞胚胎數(shù)量×100%。

三、統(tǒng)計學(xué)分析

結(jié) 果

一、卵母細(xì)胞條件性敲除Rictor基因?qū)π∈笈怕褦?shù)量的影響

為研究條件性敲除Rictor對雌鼠排卵的影響，課題組成功繁育Zp3-Cre+，Rictorloxp/loxp小鼠(KO組)(圖1A和圖B)，以同窩Zp3-Cre-，Rictorloxp/loxp雌鼠為對照鼠(WT組)，通過注射促性腺激素，觀察條件性敲除小鼠排出的卵母細(xì)胞的形態(tài)及排卵的數(shù)量。結(jié)果顯示，KO組的平均排卵數(shù)為(14.84±2.64)個(n=6)，對照鼠(WT組)平均排卵數(shù)為(15.84±4.92)個(n=6)，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)(圖1C)；敲除鼠與對照鼠的卵母細(xì)胞畸形率亦無顯著性差異(P>0.05)(圖1D)；卵母細(xì)胞形態(tài)也未見明顯異常(圖1E)。

A：瓊脂糖凝膠電泳鑒定小鼠基因型；B：免疫組化驗證敲除效果；C：WT和KO小鼠平均排卵數(shù)的比較；D：WT和KO小鼠卵母細(xì)胞畸形率的比較；E：WT和KO小鼠卵母細(xì)胞形態(tài)。

二、卵母細(xì)胞條件性敲除Rictor基因?qū)Υ剖笫芫寻l(fā)育影響

為驗證在卵母細(xì)胞中敲除Rictor對胚胎發(fā)育的影響，我們通過ICSI實驗，將野生型雄鼠的精子頭部注射到敲除鼠的卵母細(xì)胞內(nèi)，以同窩Zp3-Cre-，Rictorloxp/loxp雌鼠為對照鼠(WT組)，觀察受精卵的發(fā)育情況。結(jié)果顯示，同時段內(nèi)觀察到的2PN率、發(fā)育到2-細(xì)胞期胚胎數(shù)量均顯著低于對照組(P<0.05)，發(fā)育到4-細(xì)胞期胚胎數(shù)量亦減少(44.4%)，大部分胚胎仍處于2-細(xì)胞期卵裂階段，且有少數(shù)受精卵發(fā)育停滯，未發(fā)生卵裂(圖2、表1)。

圖2 卵母細(xì)胞敲除Rictor對雌鼠受精卵發(fā)育影響

表1 敲除Rictor基因的雌鼠卵母細(xì)胞的發(fā)育情況(%)

三、卵母細(xì)胞條件性敲除Rictor對小鼠染色體的影響

為闡明卵母細(xì)胞條件性敲除Rictor后導(dǎo)致胚胎發(fā)育遲緩的原因，我們對卵母細(xì)胞進(jìn)行免疫熒光化學(xué)染色，檢測Rictor是否影響染色體數(shù)量及紡錘絲的形成。結(jié)果顯示，卵母細(xì)胞條件性敲除Rictor后，卵母細(xì)胞的染色體數(shù)量正常，但部分卵母細(xì)胞的紡錘體形成異常，出現(xiàn)紡錘體排列異常、散亂分布等現(xiàn)象(圖3A)；對照組(WT組)小鼠僅有少部分卵母細(xì)胞出現(xiàn)異常(11.57%)，敲除鼠卵母細(xì)胞紡錘絲異常錯誤率達(dá)到24.43%，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)(圖3B)。

A：WT(左)和KO(中、右)小鼠卵母細(xì)胞紡錘體微管的形態(tài)；B：WT和KO小鼠卵母細(xì)胞紡錘體微管畸形率的比較。與WT組比較，*P<0.05。

討 論

女性的生殖壽命取決于卵巢原始卵泡池的大小，人類卵巢原始卵泡池的大小通常在胚胎發(fā)育期間確定。通過卵泡激活的過程將原始卵泡從休眠卵泡的儲存庫募集到生長卵泡池中，優(yōu)勢卵泡可發(fā)育成熟直至排卵，其余大量卵泡出現(xiàn)凋亡，形成閉鎖卵泡[18]，當(dāng)原始卵泡池耗竭時，會出現(xiàn)更年期或POF。因此卵泡生長發(fā)育對卵巢功能的維持起決定性作用，各種原因引起的卵泡發(fā)育受阻或過度耗竭則是導(dǎo)致POF的直接因素[23-24]。卵泡耗竭的發(fā)生早于POF癥狀的出現(xiàn)，這也嚴(yán)重阻礙了對于POF發(fā)生機(jī)制的基礎(chǔ)研究。

課題組在前期構(gòu)建的去氧乙烯基環(huán)己烯(VCD)誘導(dǎo)的POF小鼠模型和卵母細(xì)胞Rictor-cKO的小鼠模型中發(fā)現(xiàn)，Rictor在卵母細(xì)胞中對卵泡發(fā)育具有保護(hù)作用,接受抑制卵母細(xì)胞中的Rictor后，卵泡閉鎖加速，卵泡丟失增多[18]。同時，Rictor-cKO小鼠表現(xiàn)出一種全新的POF卵巢表型，其卵泡池和血清雌激素水平均有相似的下降，生育能力在4月齡開始明顯衰退、8月齡時完全不孕。已有研究顯示，Rictor對小鼠的胚胎發(fā)育至關(guān)重要，Rictor缺失小鼠表現(xiàn)出胎盤功能缺陷和胚胎發(fā)育停滯[16，25]。但我們并未在Rictor-cKO小鼠中觀察到相似的胎盤缺陷表型，同時課題組以往研究還顯示，卵母細(xì)胞條件性敲除Rictor雌鼠卵泡形成基本正常。基于此，我們設(shè)想Rictor可能通過調(diào)控卵泡成熟及受精卵卵裂，從而影響胚胎發(fā)育的進(jìn)程。然而本研究結(jié)果顯示：與對照鼠相比，Rictor-cKO小鼠排出的卵母細(xì)胞形態(tài)無明顯變化，排卵數(shù)量以及卵母細(xì)胞畸形率也無統(tǒng)計學(xué)差異。但是，卵母細(xì)胞條件性敲除Rictor會導(dǎo)致受精卵能力減弱，胚胎發(fā)育嚴(yán)重遲緩。因此，我們推測卵母細(xì)胞條件性敲除Rictor可能不影響卵母細(xì)胞的形態(tài)及數(shù)量，但可能對胚胎的正常發(fā)育有重要影響。

為深入研究Rictor調(diào)控卵母細(xì)胞發(fā)育的深層機(jī)制，闡明Rictor對胚胎早期發(fā)育的影響，本研究應(yīng)用Rictor-cKO小鼠模型，通過對4月齡的雌鼠進(jìn)行ICSI結(jié)合卵母細(xì)胞熒光化學(xué)染色，試圖發(fā)現(xiàn)Rictor對小鼠早期胚胎發(fā)育的影響。研究結(jié)果顯示，4月齡Rictor-cKO小鼠卵母細(xì)胞受精后胚胎發(fā)育出現(xiàn)嚴(yán)重滯后甚至停滯的現(xiàn)象；同時，免疫熒光染色結(jié)果顯示，Rictor-cKO部分卵母細(xì)胞的紡錘體排列異常率明顯升高。由此，我們認(rèn)為卵母細(xì)胞條件性敲除Rictor可能會導(dǎo)致卵母細(xì)胞的紡錘絲形成異常，進(jìn)而導(dǎo)致胚胎發(fā)育出現(xiàn)停滯或者滯后的現(xiàn)象。但Rictor可能不是導(dǎo)致紡錘絲形成異常的直接因素，Rictor如何影響紡錘絲的組裝機(jī)制有待進(jìn)一步闡明。本研究結(jié)果具有廣泛的生理和臨床意義，有助于進(jìn)一步探討Rictor在調(diào)控正常卵巢生理功能中的作用，可能為POF的防治帶來新的理論依據(jù)。我們隨后的研究將重點關(guān)注Rictor調(diào)控正常卵母細(xì)胞紡錘絲的形成及誘導(dǎo)早期胚胎發(fā)育的分子機(jī)制。生理性妊娠過程中，精細(xì)的母-胎對話對妊娠成功維持是不可或缺的，胚胎在早期發(fā)育時如能在精準(zhǔn)時段內(nèi)向母體發(fā)出信號并獲得反應(yīng)，胚胎才能存活并種植到子宮[26]。目前的研究尚未揭示Rictor是否在母-胎之間的對話中起到積極性的作用。

綜上所述，Rictor對卵母細(xì)胞減數(shù)分裂過程中紡錘絲的裝配及維持早期胚胎正常發(fā)育具有關(guān)鍵作用。卵母細(xì)胞條件性敲除Rictor引起紡錘絲的排列異常，進(jìn)而影響胚胎的早期發(fā)育。這為我們后續(xù)探討Rictor調(diào)控卵母細(xì)胞形成及胚胎發(fā)育的分子機(jī)制提供了新依據(jù)，也為POF的防治提供了新的理論基礎(chǔ)和潛在治療靶點。