• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    囊腔液mtDNA水平對0PN來源囊胚發(fā)育速度的影響

    2022-12-22 10:01:50趙海靜袁萍黃佳邱綺張清學(xué)王文軍
    生殖醫(yī)學(xué)雜志 2022年12期

    趙海靜,袁萍,黃佳,邱綺,張清學(xué),王文軍

    (中山大學(xué)孫逸仙紀(jì)念醫(yī)院生殖中心,廣州 510120)

    在常規(guī)體外受精(IVF)過程中,原核觀察是目前評(píng)估受精與否的常用方法。通常在授精后16~20 h于倒置顯微鏡下觀察,正常受精卵有兩個(gè)清晰原核(2PN),不具有2PN的均為異常受精。在光學(xué)顯微鏡下,異常受精的表現(xiàn)形式主要有:零原核(0PN)、單原核(1PN)和多原核(多PN)受精卵。IVF過程中約30%的卵母細(xì)胞表現(xiàn)為0PN受精,其原因可能是卵母細(xì)胞受精失敗,也可能是雌雄原核過早融合,導(dǎo)致原核消失[1]。如未觀察到原核的受精卵在后續(xù)發(fā)育中其卵裂速度及卵裂球形態(tài)與觀察到2PN的受精卵發(fā)育而來的胚胎沒有差異,稱之為0PN來源胚胎[1]。依據(jù)歐洲人類生殖與胚胎學(xué)會(huì)實(shí)驗(yàn)室指南,不建議移植0PN來源胚胎[2]。然而大量的細(xì)胞遺傳學(xué)分析結(jié)果顯示,部分0PN來源胚胎為二倍體胚胎,并且有4.4%~37.2%的0PN來源胚胎能夠發(fā)育為優(yōu)質(zhì)囊胚[3-5]。這些研究表明0PN來源胚胎仍具有一定的臨床應(yīng)用價(jià)值。因此,我中心對于0PN來源胚胎(本文中所提及的0PN來源胚胎特指0PN來源卵裂期胚胎)的處理是,如果第3天(D3)發(fā)育到4細(xì)胞及以上,則進(jìn)行囊胚培養(yǎng),如D5或D6形成評(píng)分3CC以上囊胚者視為可利用囊胚,進(jìn)行冷凍保存。

    近期的一項(xiàng)薈萃分析顯示,無論是新鮮周期還是凍融周期,D5囊胚移植的種植率、臨床妊娠率及出生率均顯著優(yōu)于D6囊胚[6]。此外,僅對于整倍體囊胚移植的研究也表明,D5囊胚的移植結(jié)局顯著優(yōu)于D6囊胚[7-8]。這些結(jié)論提示我們,除了內(nèi)膜和染色體因素,還有其他重要因子影響著D6囊胚的潛能和發(fā)育。最近,滋養(yǎng)層細(xì)胞中線粒體DNA(mtDNA)數(shù)量被認(rèn)為是胚胎選擇的另一個(gè)潛在標(biāo)記物。Wu等[9]的研究結(jié)果表明,相同倍性D5囊胚中滋養(yǎng)層細(xì)胞mtDNA數(shù)量顯著多于D6囊胚(P<0.05);在妊娠結(jié)局相同的情況下,移植的D5囊胚中滋養(yǎng)層細(xì)胞mtDNA數(shù)量也顯著多于移植的D6囊胚(P<0.05),因此他們認(rèn)為mtDNA數(shù)量可能是影響囊胚發(fā)育速度的一個(gè)關(guān)鍵因素。有趣的是,發(fā)育速度快的D5囊胚中mtDNA數(shù)量顯著多于發(fā)育速度慢的D5囊胚(P<0.05),D6囊胚中mtDNA數(shù)量亦呈現(xiàn)同樣的趨勢[10-11],這進(jìn)一步體現(xiàn)了mtDNA數(shù)量在囊胚發(fā)育速度中的作用。但目前關(guān)于IVF中0PN來源囊胚的mtDNA數(shù)量與其發(fā)育速度之間的關(guān)系尚未見報(bào)導(dǎo)。

    近年來,基于滋養(yǎng)層細(xì)胞活檢的植入前遺傳學(xué)檢測(PGT)廣泛用于胚胎非整倍體篩查。然而,滋養(yǎng)層細(xì)胞活檢的局限性在于:(1)對胚胎的有創(chuàng)活檢可能會(huì)降低其發(fā)育潛能;(2)要求胚胎學(xué)家具有豐富經(jīng)驗(yàn)和嫻熟技術(shù);(3)活檢操作過程復(fù)雜;(4)由于內(nèi)細(xì)胞團(tuán)未經(jīng)過檢測,嵌合體容易導(dǎo)致假陰性或假陽性結(jié)果;(5)活檢的長期生物安全性尚未評(píng)估[12-16]。而基于廢棄囊胚培養(yǎng)液的無創(chuàng)PGT也存在一些缺點(diǎn),因?yàn)閺U棄囊胚培養(yǎng)液比囊腔液具有更高的母源污染(顆粒細(xì)胞)風(fēng)險(xiǎn),尤其是囊胚階段的廢棄培養(yǎng)液中會(huì)檢測到更高水平的母源核DNA[17-18]。在滋養(yǎng)層細(xì)胞連接處進(jìn)行激光打孔以釋放囊腔液或使用注射針抽吸來獲取囊腔液[19-20],并以囊腔液為樣本進(jìn)行mtDNA數(shù)量檢測的方法創(chuàng)傷小、操作簡易,還能有效避免母源顆粒細(xì)胞污染。因此,本研究首次以囊腔液為樣本,對IVF中0PN來源囊胚的mtDNA水平進(jìn)行檢測及綜合分析,并進(jìn)一步探索0PN來源囊胚中mtDNA水平與其發(fā)育速度之間的關(guān)系。

    資料與方法

    一、研究對象

    回顧性分析2019年11月至2021年8月在本中心行常規(guī)IVF助孕治療的66對夫婦的臨床資料。納入標(biāo)準(zhǔn):(1)D1原核觀察為0PN;(2)D5或D6囊胚評(píng)級(jí)為3CC級(jí)以上;(3)D5或D6囊胚留取囊腔液行整倍體檢測及mtDNA水平檢測;(4)男女雙方相關(guān)檢測及資料完整。排除標(biāo)準(zhǔn):(1)D1的原核觀察為1PN、2PN、3PN或多PN;(2)D1卵母細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察為MI、GV期、出現(xiàn)退化或空透明帶;(3)D5或D6囊胚評(píng)級(jí)為3CC級(jí)及以下。本研究中所有樣本的使用均進(jìn)行了充分地知情告知,并簽署知情同意書,且研究的開展獲得了醫(yī)院倫理委員會(huì)的審批通過。

    本研究共納入66個(gè)助孕治療周期中的109枚0PN來源囊胚。根據(jù)囊胚發(fā)育速度不同進(jìn)行分組,分為D5-0PN囊胚組(0PN來源胚胎在D5發(fā)育為可冷凍囊胚者,n=87)、D6-0PN囊胚組(0PN來源胚胎在D6發(fā)育為可冷凍囊胚者,n=22)。

    二、研究方法

    1.控制性促排卵(COH)及取卵:入組患者采用長方案或拮抗劑方案進(jìn)行促排卵。陰道B超監(jiān)測卵泡生長情況,當(dāng)B超監(jiān)測有1~2個(gè)卵泡直徑≥18 mm時(shí)給予肌肉注射HCG(珠海麗珠)10 000 U,注射后36~38 h在陰道B超引導(dǎo)下穿刺取卵。在體視顯微鏡下收集卵泡液中卵丘-卵母細(xì)胞復(fù)合物,并置于G-IVF液(Vitrolife,瑞典)中培養(yǎng)。

    2.精液收集及處理:取卵當(dāng)天男方以手淫法采集精液。待精液液化后,通過密度梯度離心及上游法處理,并調(diào)至統(tǒng)一的受精濃度(本中心所用濃度為0.3×106/ml)。

    3.體外授精及原核觀察:卵母細(xì)胞經(jīng)體外培養(yǎng)4~6 h進(jìn)行IVF人工授精。授精16~20 h后進(jìn)行原核觀察,未見原核者記錄為0PN,可見兩個(gè)原核者為2PN。

    4.胚胎培養(yǎng)及發(fā)育評(píng)估:D1拆除顆粒細(xì)胞后,將胚胎轉(zhuǎn)移至G1-plus(Vitrolife,瑞典)培養(yǎng)液中,置于37℃、6%CO2、5%O2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。D3將胚胎轉(zhuǎn)移至G2-plus(Vitrolife,瑞典)培養(yǎng)液中進(jìn)行囊胚培養(yǎng)。D5和D6分別評(píng)估囊胚發(fā)育,依據(jù)Gardner和Schoolcraft的評(píng)分系統(tǒng)[21],綜合囊胚擴(kuò)張狀態(tài)、內(nèi)細(xì)胞團(tuán)和滋養(yǎng)層細(xì)胞的發(fā)育對囊胚質(zhì)量進(jìn)行全面評(píng)估。根據(jù)囊胚腔的大小和是否孵出將囊胚發(fā)育分為6個(gè)時(shí)期:1期:早期有腔室囊胚,囊胚腔體積小于胚胎總體積的1/2;2期:囊胚腔體積大于或等于胚胎總體積的1/2;3期:擴(kuò)張囊胚,囊胚腔完全占據(jù)了胚胎的總體積;4期:囊胚腔完全充滿胚胎,胚胎總體積變大,透明帶變??;5期:正在孵出,囊胚的一部分從透明帶中逸出;6期:孵出囊胚,囊胚全部從透明帶中逸出。處于3~6期的囊胚,還需對內(nèi)細(xì)胞團(tuán)和滋養(yǎng)層細(xì)胞進(jìn)行質(zhì)量分級(jí)。其中,內(nèi)細(xì)胞團(tuán)分級(jí):A級(jí):細(xì)胞數(shù)目多,排列緊密;B級(jí):細(xì)胞數(shù)目少,排列松散;C級(jí):細(xì)胞數(shù)目很少。滋養(yǎng)層細(xì)胞分級(jí):A級(jí):上皮細(xì)胞層由較多的細(xì)胞組成,結(jié)構(gòu)致密;B級(jí):上皮細(xì)胞層由不多的細(xì)胞組成,結(jié)構(gòu)松散;C級(jí):上皮細(xì)胞層由稀疏的細(xì)胞組成,細(xì)胞很少。本中心可利用囊胚的定義為:透明帶擴(kuò)張程度≥3且內(nèi)細(xì)胞團(tuán)和滋養(yǎng)層細(xì)胞評(píng)分為CC以上;優(yōu)質(zhì)囊胚的定義為:透明帶擴(kuò)張程度≥3且內(nèi)細(xì)胞團(tuán)和滋養(yǎng)層細(xì)胞評(píng)分為BB及以上。

    5.囊腔液收集:為了避免母源顆粒細(xì)胞污染,將D3的0PN來源胚胎轉(zhuǎn)移到不同的G2-plus液滴(預(yù)平衡)中潤洗多次以除去透明帶上的顆粒細(xì)胞,再移入新的G2-plus液滴中進(jìn)行囊胚培養(yǎng)。D5或D6丟棄最初用于囊胚培養(yǎng)的液滴,將0PN來源囊胚轉(zhuǎn)移到不同的新鮮G2-plus液滴(預(yù)平衡)中潤洗3次以再次完全除去透明帶上松散的顆粒細(xì)胞,隨后把0PN來源囊胚轉(zhuǎn)移到另一個(gè)新鮮的15 μl G2-plus液滴中,用200 μs激光脈沖(LYKOS,Hamilton Thorne,美國)在滋養(yǎng)層細(xì)胞連接處打孔以釋放囊腔液。激光打孔4~6 h后,將0PN來源囊胚進(jìn)行玻璃化冷凍,收集囊腔液與G2-plus液滴的混合液裝入含有5 μl磷酸鹽緩沖液(PBS)的無RNAse/DNAse小管中(江蘇億康基因)(具體收集方法參考Jiao等[19]的方法),做好樣本標(biāo)記后置于-80℃冰箱保存,之后將冷凍樣本交由江蘇億康基因公司進(jìn)行后續(xù)檢測。使用未經(jīng)胚胎培養(yǎng)的G2-plus液滴作為陰性對照。

    6.0PN來源囊胚染色體整倍體及mtDNA含量檢測:使用基于單細(xì)胞的多次退火環(huán)狀循環(huán)擴(kuò)增技術(shù)(簡稱MALBAC)對囊腔液樣本進(jìn)行全基因組擴(kuò)增(江蘇億康基因)。通過NextSeq550測序儀(Illumina,美國)進(jìn)行第二代測序分析,用于全面染色體篩查。以常染色體擴(kuò)增拷貝為基礎(chǔ),根據(jù)測序比對的序列數(shù)和區(qū)域數(shù)來分析單核基因組下線粒體的拷貝。線粒體含量以拷貝數(shù)/核基因組的形式進(jìn)行量化。對比對到線粒體基因組的測序讀取序列進(jìn)行計(jì)數(shù),并通過比對到常染色體的讀取序列計(jì)數(shù)進(jìn)行均一化,參考前期文獻(xiàn)[22]公式計(jì)算每個(gè)核基因組的線粒體拷貝數(shù)。

    7.觀察指標(biāo):記錄兩組患者的年齡、不孕年限、體質(zhì)量指數(shù)(BMI)、基礎(chǔ)生殖激素(FSH、LH、E2)水平、抗苗勒管激素(AMH)、基礎(chǔ)竇卵泡計(jì)數(shù)(AFC)、Gn總量、獲卵數(shù)、精子正常形態(tài)率、頂體酶活性、囊胚整倍體率、優(yōu)質(zhì)囊胚率及囊腔液mtDNA數(shù)量。

    三、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

    結(jié) 果

    一、患者一般資料分析

    比較D5-0PN囊胚組與D6-0PN囊胚組患者的基本信息和臨床資料,結(jié)果顯示D5-0PN囊胚組的女方年齡和Gn總量均顯著低于D6-0PN囊胚組(P<0.05),D5-0PN囊胚組的男方年齡極顯著低于D6-0PN囊胚組(P<0.01)。兩組患者的不孕年限、BMI、基礎(chǔ)生殖激素(FSH、LH、E2)水平等均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)(表1)。

    二、D5-0PN囊胚與D6-0PN囊胚整倍體率、優(yōu)質(zhì)囊胚率及女方高齡率比較

    D5-0PN囊胚和D6-0PN囊胚的整倍體率比較無顯著性差異(P>0.05);D5-0PN囊胚組的優(yōu)質(zhì)囊胚率極顯著高于D6-0PN囊胚組(P<0.01)。為了排除女方高齡對mtDNA水平的影響,參照之前的文獻(xiàn)[9,23]選擇40歲作為本研究中高齡女性的界限,比較兩組間來自高齡女性(≥40歲)的囊胚比例,結(jié)果無顯著性差異(P>0.05)(表2)。

    表1 兩組患者一般資料比較(-±s)

    表2 D5-0PN囊胚與D6-0PN囊胚的整倍體率、優(yōu)質(zhì)囊胚率及高齡率比較(%)

    三、不同分層下D5-0PN囊胚與D6-0PN囊胚mtDNA水平比較

    比較整倍體囊胚與非整倍體囊胚、<40歲與≥40歲女性、優(yōu)質(zhì)囊胚與非優(yōu)質(zhì)囊胚中mtDNA的水平。D5-0PN囊胚中整倍體囊胚35枚,D6-0PN囊胚中整倍體囊胚11枚;在相同倍性(均為整倍體或均為非整倍體)情況下,D5-0PN囊胚的mtDNA水平均略高于D6-0PN囊胚,但尚無顯著性差異(P>0.05)。D5-0PN囊胚中來源于<40歲女性者85枚,D6-0PN囊胚中來源于<40歲女性者20枚;在相同的囊胚發(fā)育時(shí)期,<40歲女性與≥40歲女性的0PN來源囊胚中mtDNA數(shù)量無顯著性差異(P>0.05);但無論<40歲或≥40歲女性,其D5-0PN囊胚中mtDNA水平均略高于D6-0PN囊胚(P>0.05)。D5-0PN囊胚中優(yōu)質(zhì)囊胚(評(píng)級(jí)≥3BB)58枚,D6-0PN囊胚中優(yōu)質(zhì)囊胚6枚;在相同發(fā)育時(shí)期,優(yōu)質(zhì)0PN來源囊胚中mtDNA水平略高于非優(yōu)質(zhì)0PN來源囊胚,但尚無顯著性差異(P>0.05);且無論囊胚質(zhì)量如何,D5-0PN囊胚中mtDNA水平均略高于D6-0PN囊胚(P>0.05)(表3)。

    表3 不同分層下D5-0PN囊胚與D6-0PN囊胚mtDNA水平比較(-±s)

    討 論

    0PN來源胚胎的臨床應(yīng)用價(jià)值一直存在爭議,因?yàn)闊o法確定0PN來源胚胎源自于正常受精或異常受精[24]。我們中心的常規(guī)策略是將0PN來源胚胎進(jìn)行囊胚培養(yǎng),若形成可利用囊胚則冷凍保存。在患者無2PN來源囊胚可移植的情況下,移植0PN來源囊胚以增加妊娠機(jī)會(huì)。考慮到0PN可能為異常受精,所以0PN來源胚胎的移植應(yīng)該盡可能地結(jié)合PGT[5]。目前廣泛應(yīng)用的PGT方法是對囊胚滋養(yǎng)層細(xì)胞進(jìn)行活檢,然而這種方法存在活檢工作量大、耗費(fèi)成本較高、有創(chuàng)、取樣有偏倚(只檢測滋養(yǎng)層細(xì)胞而沒有檢測內(nèi)細(xì)胞團(tuán))等缺點(diǎn)[25]。廢棄囊胚培養(yǎng)液是無創(chuàng)PGT的首選材料,但具有較高的母源顆粒細(xì)胞污染風(fēng)險(xiǎn),并且會(huì)檢測到更高水平的母源核DNA[17-18]。因此本研究選擇以囊腔液為樣本來分析0PN來源囊胚的染色體狀態(tài)。

    滋養(yǎng)層細(xì)胞或培養(yǎng)液中mtDNA數(shù)量被認(rèn)為是胚胎選擇的另一個(gè)潛在標(biāo)記物[9,26]。早期胚胎中mtDNA數(shù)量的差異很可能起源于相應(yīng)的卵母細(xì)胞[22]。有研究表明,卵母細(xì)胞質(zhì)量與其所含有的mtDNA數(shù)量有著內(nèi)在聯(lián)系。卵巢功能下降或高齡女性的卵母細(xì)胞中mtDNA數(shù)量顯著低于卵巢功能正常或年輕女性[27-29]。此外,未受精卵母細(xì)胞中mtDNA拷貝數(shù)也顯著低于受精卵母細(xì)胞[30-32],退化卵母細(xì)胞則含有更少的mtDNA[32]。mtDNA數(shù)量較多的卵母細(xì)胞具有更高的發(fā)育潛能[33],卵母細(xì)胞中線粒體儲(chǔ)備下降將引起植入前胚胎能量不足,進(jìn)而導(dǎo)致胚胎發(fā)育阻滯[34]。充足的mtDNA水平提示卵母細(xì)胞質(zhì)量好,這不僅有益于成功受精,而且對后期的胚胎發(fā)育至關(guān)重要。在胚胎發(fā)育過程中,線粒體平均分布于每個(gè)卵裂球,但是在囊胚階段之前,線粒體總數(shù)相對穩(wěn)定[35],同樣線粒體的活性也相對穩(wěn)定[34]。當(dāng)胚胎發(fā)育到囊胚階段時(shí),mtDNA大量復(fù)制,表明線粒體已完成從靜止到激活的轉(zhuǎn)變[36-37]。因此,我們推測囊胚期mtDNA數(shù)量也許有著某種重要的意義,同時(shí)啟發(fā)我們關(guān)注囊腔液中mtDNA水平。

    Ho等[38]研究認(rèn)為,從活檢的每個(gè)滋養(yǎng)層細(xì)胞中獲得的mtDNA拷貝數(shù)與從整個(gè)胚胎獲得的mtDNA拷貝數(shù)相當(dāng)。這一研究證實(shí)了我們以囊腔液為樣本對0PN來源囊胚中mtDNA數(shù)量進(jìn)行檢測及綜合分析的可行性。在Wu等[9]的報(bào)道中,調(diào)整了胚胎倍性、移植結(jié)局、女方年齡和囊胚質(zhì)量這些混雜因素后,D5囊胚中mtDNA數(shù)量仍顯著高于D6囊胚(P<0.05)。我們的研究結(jié)果表現(xiàn)出了相似的趨勢:在相同倍性、女方年齡、囊胚質(zhì)量的情況下,D5-0PN來源囊胚中mtDNA水平均有高于D6-0PN來源囊胚的趨勢,雖然尚無顯著性差異(P>0.05)。

    有研究表明,囊腔液中游離DNA含量與胚胎等級(jí)呈正相關(guān)[39],而游離DNA由核DNA(nDNA)和mtDNA組成[40]。此外,Stigliani等[26]對人類胚胎的研究顯示,D3培養(yǎng)液中較高的mtDNA/nDNA比例提示較高的胚胎發(fā)育潛能。因此我們推測囊腔液中mtDNA含量可能與胚胎質(zhì)量呈正相關(guān)。本研究中我們的數(shù)據(jù)顯示,D5-0PN來源囊胚中mtDNA水平略高于D6-0PN來源囊胚,同時(shí)D5-0PN囊胚組的優(yōu)質(zhì)囊胚率極顯著高于D6-0PN囊胚組(P<0.01);無論D5或D6,優(yōu)質(zhì)0PN來源囊胚的mtDNA水平均略高于非優(yōu)質(zhì)0PN來源囊胚;這些結(jié)果與我們的推測相符。

    Wu等[9]認(rèn)為影響囊胚發(fā)育速度的關(guān)鍵機(jī)制之一是卵母細(xì)胞中含有的最初mtDNA數(shù)量。那些含有充足mtDNA的卵母細(xì)胞將會(huì)“及時(shí)”形成囊胚,而那些mtDNA數(shù)量相對少的卵母細(xì)胞則需要額外時(shí)間以完成囊胚的發(fā)育過程。因此他們推測D6囊胚最初來源于mtDNA數(shù)量相對少的卵母細(xì)胞,由于能量不充足,所以需要額外1 d的時(shí)間去形成囊胚。這同樣適用于解釋0PN來源囊胚中mtDNA水平與其囊胚發(fā)育速度之間的關(guān)系。

    綜上,本研究首次全面分析了囊腔液mtDNA水平與IVF中0PN來源囊胚發(fā)育速度之間的關(guān)系。綜合考慮胚胎倍性、女方年齡和囊胚質(zhì)量等因素后,D5-0PN來源囊胚中mtDNA水平有高于D6-0PN來源囊胚的趨勢,提示mtDNA數(shù)量可能是影響0PN來源囊胚發(fā)育速度的一個(gè)關(guān)鍵因素,較低的mtDNA水平可能與0PN來源囊胚發(fā)育延遲相關(guān)。本研究的局限性在于樣本量較少,將來需要開展更大樣本量的研究以驗(yàn)證本文的結(jié)論,從而更加深入地闡述0PN來源囊胚中mtDNA水平與其發(fā)育速度之間的關(guān)系。

    久热爱精品视频在线9| 亚洲激情五月婷婷啪啪| 欧美国产精品一级二级三级| 热99国产精品久久久久久7| 欧美成人精品欧美一级黄| 国产欧美日韩一区二区三 | 亚洲人成网站在线观看播放| 人成视频在线观看免费观看| 精品久久蜜臀av无| 美女福利国产在线| 黑人巨大精品欧美一区二区蜜桃| 亚洲av日韩精品久久久久久密 | 又黄又粗又硬又大视频| 少妇精品久久久久久久| 丝袜美腿诱惑在线| 亚洲成国产人片在线观看| 久久国产亚洲av麻豆专区| 亚洲精品在线美女| 日韩,欧美,国产一区二区三区| 亚洲精品久久久久久婷婷小说| 国产亚洲欧美精品永久| 97人妻天天添夜夜摸| 在线观看一区二区三区激情| 欧美在线一区亚洲| 免费av中文字幕在线| 女性被躁到高潮视频| 黑人巨大精品欧美一区二区蜜桃| 美女脱内裤让男人舔精品视频| 亚洲欧洲国产日韩| 精品少妇内射三级| 在线观看人妻少妇| 亚洲七黄色美女视频| 性少妇av在线| av国产久精品久网站免费入址| 午夜精品国产一区二区电影| 国产一区二区三区综合在线观看| 国产成人一区二区三区免费视频网站 | 18禁裸乳无遮挡动漫免费视频| 精品高清国产在线一区| 飞空精品影院首页| 岛国毛片在线播放| 操美女的视频在线观看| 日本欧美国产在线视频| 日韩欧美一区视频在线观看| 日韩大码丰满熟妇| 高清不卡的av网站| 18禁观看日本| 一级毛片黄色毛片免费观看视频| 高清av免费在线| 国产精品熟女久久久久浪| 欧美av亚洲av综合av国产av| 亚洲成人免费av在线播放| 久久女婷五月综合色啪小说| 成人国语在线视频| 国产精品久久久久成人av| 新久久久久国产一级毛片| 成人亚洲精品一区在线观看| 精品一区二区三区四区五区乱码 | 亚洲男人天堂网一区| 欧美亚洲 丝袜 人妻 在线| 欧美精品av麻豆av| 亚洲欧美一区二区三区国产| 午夜免费观看性视频| 交换朋友夫妻互换小说| 国产视频首页在线观看| 女人被躁到高潮嗷嗷叫费观| 一级毛片黄色毛片免费观看视频| 久久久精品94久久精品| 婷婷成人精品国产| 色网站视频免费| 亚洲伊人久久精品综合| av国产久精品久网站免费入址| 99精品久久久久人妻精品| 男女高潮啪啪啪动态图| 一边摸一边做爽爽视频免费| 日韩,欧美,国产一区二区三区| 欧美日韩一级在线毛片| 欧美乱码精品一区二区三区| 日韩 欧美 亚洲 中文字幕| 满18在线观看网站| 久久国产精品人妻蜜桃| 啦啦啦啦在线视频资源| 国产成人精品在线电影| 日韩av免费高清视频| 亚洲国产精品成人久久小说| 亚洲精品久久成人aⅴ小说| 欧美精品一区二区大全| 亚洲av电影在线观看一区二区三区| 欧美成人午夜精品| 捣出白浆h1v1| 一本色道久久久久久精品综合| 国产在视频线精品| 欧美变态另类bdsm刘玥| 精品熟女少妇八av免费久了| 在线观看免费高清a一片| 丝瓜视频免费看黄片| 午夜福利免费观看在线| 爱豆传媒免费全集在线观看| 亚洲精品成人av观看孕妇| 久久亚洲国产成人精品v| 青草久久国产| 热re99久久国产66热| 精品人妻1区二区| 成在线人永久免费视频| 日本猛色少妇xxxxx猛交久久| 一级黄色大片毛片| 亚洲国产日韩一区二区| 日韩大片免费观看网站| 国产日韩欧美视频二区| videosex国产| 国产一区亚洲一区在线观看| 国产视频一区二区在线看| 欧美人与善性xxx| 超色免费av| 亚洲欧美日韩高清在线视频 | 亚洲专区国产一区二区| 黄色视频不卡| 婷婷丁香在线五月| 亚洲精品成人av观看孕妇| 亚洲成av片中文字幕在线观看| 亚洲天堂av无毛| 91精品伊人久久大香线蕉| 免费黄频网站在线观看国产| 日韩大码丰满熟妇| 一级毛片我不卡| 少妇精品久久久久久久| 亚洲激情五月婷婷啪啪| 精品少妇久久久久久888优播| 狠狠精品人妻久久久久久综合| 亚洲av电影在线进入| 一区二区av电影网| 国产黄色视频一区二区在线观看| 国产欧美亚洲国产| 自拍欧美九色日韩亚洲蝌蚪91| 777久久人妻少妇嫩草av网站| 热99久久久久精品小说推荐| 菩萨蛮人人尽说江南好唐韦庄| 欧美性长视频在线观看| 1024香蕉在线观看| 少妇人妻久久综合中文| 久热爱精品视频在线9| www.999成人在线观看| 美女主播在线视频| 亚洲精品日本国产第一区| 免费看不卡的av| 免费观看a级毛片全部| 好男人视频免费观看在线| 免费少妇av软件| 亚洲av国产av综合av卡| 一区二区三区四区激情视频| tube8黄色片| 一级片免费观看大全| 亚洲欧美日韩高清在线视频 | 免费在线观看影片大全网站 | 我的亚洲天堂| 日韩视频在线欧美| 亚洲一卡2卡3卡4卡5卡精品中文| 在现免费观看毛片| 国产一区二区激情短视频 | 老司机深夜福利视频在线观看 | 超色免费av| 黄色毛片三级朝国网站| 精品一品国产午夜福利视频| 欧美日韩福利视频一区二区| 黄色视频在线播放观看不卡| 看十八女毛片水多多多| 国产片内射在线| 久久久久久久国产电影| 亚洲国产欧美一区二区综合| av国产久精品久网站免费入址| 日韩电影二区| 18禁黄网站禁片午夜丰满| 在现免费观看毛片| 看十八女毛片水多多多| 国产高清国产精品国产三级| 男女午夜视频在线观看| 青草久久国产| 美女国产高潮福利片在线看| 国产亚洲欧美在线一区二区| 欧美另类一区| 女人高潮潮喷娇喘18禁视频| 国产精品 国内视频| av在线播放精品| 国产精品麻豆人妻色哟哟久久| 亚洲激情五月婷婷啪啪| 午夜福利影视在线免费观看| 久久久久精品人妻al黑| 国产精品三级大全| 极品少妇高潮喷水抽搐| 国产成人精品无人区| 久久国产精品人妻蜜桃| av在线老鸭窝| 精品熟女少妇八av免费久了| 精品少妇一区二区三区视频日本电影| 人体艺术视频欧美日本| 中国国产av一级| 99久久人妻综合| 亚洲黑人精品在线| 色播在线永久视频| 亚洲精品美女久久久久99蜜臀 | 欧美变态另类bdsm刘玥| 亚洲精品乱久久久久久| 亚洲国产成人一精品久久久| 免费看十八禁软件| 一本大道久久a久久精品| 91麻豆精品激情在线观看国产 | 久久精品国产综合久久久| 国产真人三级小视频在线观看| 久久性视频一级片| 水蜜桃什么品种好| 黄频高清免费视频| 91老司机精品| 一区二区日韩欧美中文字幕| 一本—道久久a久久精品蜜桃钙片| 亚洲欧美中文字幕日韩二区| 国产在线视频一区二区| 亚洲欧洲精品一区二区精品久久久| 亚洲 国产 在线| 日韩一本色道免费dvd| 精品高清国产在线一区| www.999成人在线观看| 自拍欧美九色日韩亚洲蝌蚪91| 久久久久久久大尺度免费视频| 天堂中文最新版在线下载| 精品少妇久久久久久888优播| 日韩视频在线欧美| 两人在一起打扑克的视频| 欧美成人午夜精品| 亚洲一码二码三码区别大吗| 好男人视频免费观看在线| 91麻豆精品激情在线观看国产 | 最近手机中文字幕大全| 19禁男女啪啪无遮挡网站| 国产成人啪精品午夜网站| 韩国精品一区二区三区| 亚洲美女黄色视频免费看| 又黄又粗又硬又大视频| 欧美激情极品国产一区二区三区| 一级毛片电影观看| 精品亚洲乱码少妇综合久久| 波多野结衣一区麻豆| 亚洲一区中文字幕在线| 大陆偷拍与自拍| 亚洲欧洲精品一区二区精品久久久| 精品人妻一区二区三区麻豆| 欧美精品一区二区免费开放| 色婷婷久久久亚洲欧美| 成在线人永久免费视频| 真人做人爱边吃奶动态| 日本黄色日本黄色录像| 中国国产av一级| 欧美精品高潮呻吟av久久| 欧美人与性动交α欧美精品济南到| 亚洲一区中文字幕在线| 免费观看av网站的网址| 大片免费播放器 马上看| 宅男免费午夜| 欧美少妇被猛烈插入视频| 久久精品国产a三级三级三级| 这个男人来自地球电影免费观看| 一边摸一边抽搐一进一出视频| 美女高潮到喷水免费观看| svipshipincom国产片| 精品亚洲乱码少妇综合久久| 日韩伦理黄色片| 亚洲精品一卡2卡三卡4卡5卡 | 久久免费观看电影| 久久久久网色| 男女之事视频高清在线观看 | 亚洲成人国产一区在线观看 | 亚洲精品美女久久久久99蜜臀 | 国产三级黄色录像| 国产高清国产精品国产三级| 午夜福利一区二区在线看| 桃花免费在线播放| av线在线观看网站| 精品熟女少妇八av免费久了| 一边摸一边做爽爽视频免费| 大话2 男鬼变身卡| 婷婷色综合www| 亚洲男人天堂网一区| 国产激情久久老熟女| 91成人精品电影| 一区在线观看完整版| 一二三四在线观看免费中文在| 大陆偷拍与自拍| 亚洲,一卡二卡三卡| 亚洲成人国产一区在线观看 | 亚洲成av片中文字幕在线观看| 亚洲国产中文字幕在线视频| 国产野战对白在线观看| 国产一区二区在线观看av| 国产精品久久久久久精品古装| 一级片免费观看大全| 亚洲国产最新在线播放| 少妇被粗大的猛进出69影院| 麻豆国产av国片精品| 久热爱精品视频在线9| 国产伦理片在线播放av一区| 狂野欧美激情性xxxx| 日韩制服丝袜自拍偷拍| 久久九九热精品免费| 曰老女人黄片| 大话2 男鬼变身卡| 欧美精品啪啪一区二区三区 | 母亲3免费完整高清在线观看| 午夜福利影视在线免费观看| 欧美日韩亚洲综合一区二区三区_| 精品少妇久久久久久888优播| 国产又色又爽无遮挡免| 丰满人妻熟妇乱又伦精品不卡| 少妇精品久久久久久久| 爱豆传媒免费全集在线观看| 欧美av亚洲av综合av国产av| 性少妇av在线| 女人高潮潮喷娇喘18禁视频| 桃花免费在线播放| 国产亚洲av片在线观看秒播厂| 在线观看免费午夜福利视频| 国产欧美日韩一区二区三区在线| 最黄视频免费看| 亚洲三区欧美一区| 亚洲五月婷婷丁香| 午夜两性在线视频| 国产成人影院久久av| 欧美日韩av久久| 久久精品国产亚洲av高清一级| 9191精品国产免费久久| 国产精品一区二区在线观看99| 啦啦啦中文免费视频观看日本| 欧美黄色片欧美黄色片| 欧美精品av麻豆av| 欧美老熟妇乱子伦牲交| 中文字幕色久视频| 国产日韩欧美亚洲二区| 日本vs欧美在线观看视频| 成人国产一区最新在线观看 | 国产免费又黄又爽又色| 2018国产大陆天天弄谢| 午夜免费观看性视频| 一级片'在线观看视频| 波多野结衣av一区二区av| 性少妇av在线| 国产亚洲av片在线观看秒播厂| 亚洲伊人久久精品综合| 久久久国产欧美日韩av| 国产精品亚洲av一区麻豆| 国产色视频综合| 国产精品国产三级国产专区5o| 一级,二级,三级黄色视频| 丝袜脚勾引网站| 精品免费久久久久久久清纯 | 国产福利在线免费观看视频| 王馨瑶露胸无遮挡在线观看| 天天添夜夜摸| 天天躁日日躁夜夜躁夜夜| 女性生殖器流出的白浆| 99久久99久久久精品蜜桃| 色94色欧美一区二区| 黄色毛片三级朝国网站| 亚洲av电影在线进入| 精品高清国产在线一区| 老司机影院毛片| 少妇猛男粗大的猛烈进出视频| 久久鲁丝午夜福利片| 精品一区二区三区av网在线观看 | 国产精品一二三区在线看| 亚洲人成电影观看| 热re99久久精品国产66热6| 国产精品偷伦视频观看了| 久久国产精品影院| 亚洲av国产av综合av卡| 另类精品久久| 一区二区三区精品91| 曰老女人黄片| 黄色一级大片看看| 亚洲国产中文字幕在线视频| 亚洲精品国产av成人精品| 成人三级做爰电影| 国产精品久久久久久精品电影小说| 精品国产一区二区三区四区第35| 高清黄色对白视频在线免费看| 久久影院123| 巨乳人妻的诱惑在线观看| 免费观看a级毛片全部| 一级毛片我不卡| 中文字幕制服av| 韩国高清视频一区二区三区| 九草在线视频观看| 一级片'在线观看视频| 成年av动漫网址| 亚洲人成电影观看| 女人爽到高潮嗷嗷叫在线视频| 免费在线观看完整版高清| 亚洲国产欧美在线一区| 天天躁夜夜躁狠狠躁躁| 国产精品偷伦视频观看了| 亚洲自偷自拍图片 自拍| 19禁男女啪啪无遮挡网站| av一本久久久久| 中文字幕制服av| 99精国产麻豆久久婷婷| 多毛熟女@视频| 伊人久久大香线蕉亚洲五| 一级片免费观看大全| 丰满少妇做爰视频| 国产91精品成人一区二区三区 | 国产免费一区二区三区四区乱码| 丰满饥渴人妻一区二区三| 亚洲国产日韩一区二区| 精品一区在线观看国产| 午夜福利视频在线观看免费| 亚洲一区二区三区欧美精品| 高清欧美精品videossex| 国产一区二区三区综合在线观看| 老司机午夜十八禁免费视频| 精品少妇一区二区三区视频日本电影| 欧美日韩亚洲综合一区二区三区_| 欧美日韩视频高清一区二区三区二| 亚洲第一av免费看| 99精品久久久久人妻精品| 黄色视频在线播放观看不卡| 国产高清不卡午夜福利| 欧美日韩视频高清一区二区三区二| 欧美在线黄色| 人人妻人人澡人人看| 亚洲精品一卡2卡三卡4卡5卡 | 丝瓜视频免费看黄片| 麻豆av在线久日| 高清欧美精品videossex| 亚洲成av片中文字幕在线观看| 亚洲精品国产一区二区精华液| 老熟女久久久| 国产精品偷伦视频观看了| 国产成人一区二区在线| 欧美日韩视频精品一区| 日韩 亚洲 欧美在线| 少妇裸体淫交视频免费看高清 | 欧美日韩亚洲高清精品| 欧美精品人与动牲交sv欧美| 日韩免费高清中文字幕av| 国产精品九九99| 国产日韩一区二区三区精品不卡| 国产在线观看jvid| 老司机午夜十八禁免费视频| 国产一级毛片在线| 曰老女人黄片| 亚洲国产精品999| 一级片'在线观看视频| videos熟女内射| 婷婷色综合大香蕉| 一级黄片播放器| 纵有疾风起免费观看全集完整版| 国产免费视频播放在线视频| 黄片小视频在线播放| 一级片'在线观看视频| 新久久久久国产一级毛片| 别揉我奶头~嗯~啊~动态视频 | 中文字幕制服av| 一区二区三区精品91| 一级黄色大片毛片| 永久免费av网站大全| 91九色精品人成在线观看| 久久鲁丝午夜福利片| 国产成人av激情在线播放| 蜜桃在线观看..| 亚洲国产中文字幕在线视频| 国产成人系列免费观看| 亚洲国产av影院在线观看| 国产高清视频在线播放一区 | 色婷婷av一区二区三区视频| 女人被躁到高潮嗷嗷叫费观| 亚洲五月婷婷丁香| 99热全是精品| 亚洲精品自拍成人| 亚洲欧美一区二区三区国产| 天天操日日干夜夜撸| av电影中文网址| 国产高清不卡午夜福利| 中文字幕高清在线视频| 亚洲精品美女久久av网站| 成人影院久久| 亚洲人成网站在线观看播放| 日韩av免费高清视频| 国产亚洲精品第一综合不卡| 国产成人一区二区三区免费视频网站 | 一级a爱视频在线免费观看| 在线看a的网站| 国语对白做爰xxxⅹ性视频网站| 青草久久国产| av在线播放精品| 亚洲久久久国产精品| 丰满迷人的少妇在线观看| 国产欧美日韩一区二区三 | 香蕉国产在线看| 麻豆乱淫一区二区| 久久免费观看电影| 亚洲欧美一区二区三区国产| 亚洲黑人精品在线| 手机成人av网站| 永久免费av网站大全| 欧美日韩精品网址| 老鸭窝网址在线观看| 亚洲精品国产av成人精品| 免费观看av网站的网址| 免费一级毛片在线播放高清视频 | 大码成人一级视频| 国产爽快片一区二区三区| 两性夫妻黄色片| 国产精品久久久久久精品古装| 后天国语完整版免费观看| 国产精品一二三区在线看| 亚洲五月婷婷丁香| 久久精品久久久久久久性| 丝袜人妻中文字幕| 97精品久久久久久久久久精品| 男女边摸边吃奶| 亚洲精品一卡2卡三卡4卡5卡 | 高清视频免费观看一区二区| 黄色a级毛片大全视频| 99国产精品免费福利视频| 久久99热这里只频精品6学生| 日韩,欧美,国产一区二区三区| av在线播放精品| 国产在线免费精品| 亚洲国产欧美网| 色网站视频免费| 咕卡用的链子| 欧美日韩亚洲综合一区二区三区_| 我要看黄色一级片免费的| 永久免费av网站大全| 777久久人妻少妇嫩草av网站| 麻豆av在线久日| 国产精品国产三级国产专区5o| 一区二区三区精品91| 免费在线观看影片大全网站 | 精品卡一卡二卡四卡免费| 人体艺术视频欧美日本| 丰满少妇做爰视频| 免费女性裸体啪啪无遮挡网站| 热99国产精品久久久久久7| 大型av网站在线播放| 久热爱精品视频在线9| 欧美日韩成人在线一区二区| 久久久精品区二区三区| 别揉我奶头~嗯~啊~动态视频 | 十八禁高潮呻吟视频| 欧美黄色淫秽网站| 国产野战对白在线观看| 一级片'在线观看视频| 赤兔流量卡办理| 国产精品一区二区免费欧美 | 欧美激情高清一区二区三区| 在现免费观看毛片| 天天躁夜夜躁狠狠久久av| 国产视频一区二区在线看| 欧美日韩视频精品一区| 伊人久久大香线蕉亚洲五| 成人国产av品久久久| 女人精品久久久久毛片| 91成人精品电影| 国产精品免费大片| 熟女av电影| 91精品国产国语对白视频| 波野结衣二区三区在线| 超碰成人久久| 亚洲一码二码三码区别大吗| 亚洲欧美精品综合一区二区三区| 欧美日韩成人在线一区二区| 悠悠久久av| 七月丁香在线播放| 精品视频人人做人人爽| av一本久久久久| 精品人妻熟女毛片av久久网站| 亚洲色图综合在线观看| 久久av网站| 777米奇影视久久| 久久狼人影院| 男女边吃奶边做爰视频| 一个人免费看片子| 精品一区二区三区四区五区乱码 | 亚洲欧美精品自产自拍| 国产精品一区二区精品视频观看| 一区二区三区精品91| 午夜视频精品福利| 亚洲av男天堂| 国产在线观看jvid| 亚洲精品国产色婷婷电影| 国产成人一区二区在线| 国产成人a∨麻豆精品| 亚洲九九香蕉| 97人妻天天添夜夜摸| 嫁个100分男人电影在线观看 | 波多野结衣一区麻豆| 成人国产一区最新在线观看 | 十八禁高潮呻吟视频| 久久久国产一区二区| 欧美激情 高清一区二区三区| 久久国产亚洲av麻豆专区| 一级毛片黄色毛片免费观看视频| 亚洲欧美一区二区三区国产| 麻豆国产av国片精品| 丝瓜视频免费看黄片| 中文精品一卡2卡3卡4更新| 国产真人三级小视频在线观看| 国产片内射在线| 成年人免费黄色播放视频| 欧美乱码精品一区二区三区| 国产福利在线免费观看视频| 亚洲欧美日韩另类电影网站| 国产欧美日韩综合在线一区二区| 少妇精品久久久久久久| 亚洲精品国产色婷婷电影| av有码第一页| 五月天丁香电影|