• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    宮頸微生物菌群對IVF-ET妊娠結(jié)局的影響

    2022-12-22 10:01:52崔媛媛葉德盛鄭煒煒譚穎馬從順詹雪君宋革
    生殖醫(yī)學(xué)雜志 2022年12期
    關(guān)鍵詞:活產(chǎn)胚胎菌群

    崔媛媛,葉德盛,鄭煒煒,譚穎,馬從順,詹雪君,宋革*

    (1.廣東省生殖醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)中心,廣州 510600;2.廣東省生殖科學(xué)研究所,廣州 510600;3.國家衛(wèi)生健康委男性生殖與遺傳重點實驗室,廣州 510600;4.廣州市婦女兒童醫(yī)療中心生殖醫(yī)學(xué)中心,廣州 510623)

    自1978年世界上第1例試管嬰兒出生,輔助生殖技術(shù)(ART)尤其是體外受精-胚胎移植(IVF-ET)技術(shù)已成為治療不孕癥的有效手段。垂體降調(diào)節(jié)藥物使促排卵更高效,胚胎玻璃化冷凍技術(shù)大大提升胚胎利用率,臨床妊娠率逐步提高。但事實上,由于胚胎的種植機制仍不明確,即便經(jīng)過遺傳學(xué)篩查胚胎著床率仍較低,孕早期流產(chǎn)率和早產(chǎn)率較高,反復(fù)著床失敗患者缺乏有效的臨床治療手段[1]。因此,改善子宮內(nèi)膜容受性及妊娠結(jié)局,成為ART發(fā)展的瓶頸。近年研究發(fā)現(xiàn),生殖系統(tǒng)微生物組異常不僅導(dǎo)致生殖道感染和女性不孕癥[2-3],還與胚胎移植后的妊娠結(jié)局有關(guān)[4-6],是改善IVF預(yù)后的新突破口。

    隨著基因測序技術(shù)的發(fā)展,借助高通量測序技術(shù)對可變區(qū)進(jìn)行測序,結(jié)合生物信息學(xué)分析,可全面了解機體內(nèi)的菌群多樣性,同時了解菌群質(zhì)和量的變化與疾病發(fā)生發(fā)展的關(guān)系,也為了解未知菌屬在疾病中的作用開辟了新的研究方法。本文通過高通量測序技術(shù),研究新鮮取卵周期移植日宮頸微生態(tài)菌群對IVF妊娠結(jié)局的影響。

    資料與方法

    一、研究對象

    選擇2020年3—9月在廣東省生殖醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)中心行IVF/ICSI新鮮周期胚胎移植的患者為研究對象,提取其宮頸分泌物作菌群檢測。

    納入標(biāo)準(zhǔn):(1)年齡<35歲;(2)卵泡刺激素(FSH)<10 U/L且抗苗勒管激素(AMH)>1.1 ng/ml;(3)可用胚胎>2個;(4)宮腔鏡檢查排除子宮內(nèi)膜炎;(5)移植術(shù)前3個月內(nèi)行宮頸黏液檢查,排除衣原體、淋病奈瑟菌感染;一周內(nèi)行陰道分泌物檢查,排除陰道特異性及非特異性炎癥;無陰道瘙癢、白帶增多等自覺癥狀;(6)取樣前1個月內(nèi)未使用抗生素;取樣3 d內(nèi)未行陰道沖洗,無性生活。

    排除標(biāo)準(zhǔn):(1)女方急慢性宮頸炎;(2)子宮畸形、宮腔粘連、子宮黏膜下肌瘤、子宮內(nèi)膜息肉、子宮腺肌癥、子宮內(nèi)膜異位癥、輸卵管積水;(3)合并抗磷脂綜合征、甲狀腺功能異常、糖尿病等嚴(yán)重系統(tǒng)性疾?。?4)有復(fù)發(fā)性流產(chǎn)、反復(fù)著床失敗病史。

    所有研究對象均簽署書面知情同意書。本研究已獲得廣東省生殖醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)(倫理審查號:論審研第[2019](25)號)。

    本研究共收取標(biāo)本33例,其中活產(chǎn)17例,生化妊娠1例,流產(chǎn)2例,未孕13例,選取活產(chǎn)及未孕患者共30例進(jìn)行分析。

    二、研究方法

    1.IVF/ICSI-ET治療:采用長方案或拮抗劑方案,常規(guī)劑量啟動(150~300 U),定期監(jiān)測排卵,根據(jù)卵泡生長情況及激素水平適當(dāng)調(diào)整促排藥物劑量。當(dāng)1個卵泡直徑≥18 mm或3個卵泡直徑≥17 mm 時,注射重組人絨毛膜促性腺激素(HCG,艾澤,默克雪蘭諾,德國)或/和GnRH-a(達(dá)菲林,博福-益普生,法國)扳機,36~37 h后取卵。取卵后予黃體酮(浙江仙琚) 60 mg/d 肌肉注射黃體支持,3~5 d后行胚胎移植。移植后予地屈孕酮(達(dá)芙通,雅培,荷蘭) 30 mg/d + 黃體酮凝膠(雪諾同,默克雪蘭諾,德國) 90 mg/d 黃體支持。移植后12 d抽血查β-HCG,生化妊娠者(HCG>5 U/L)繼續(xù)黃體支持。移植28 d后行陰道B超檢查可見宮內(nèi)孕囊確定為臨床妊娠,臨床妊娠者黃體支持至孕10~11周。按常規(guī)流程進(jìn)行隨訪。

    2.標(biāo)本采集:患者均于胚胎移植手術(shù)時留取宮頸管分泌物標(biāo)本。清潔外陰,消毒鋪巾,窺陰器撐開陰道,無菌棉球擦拭宮頸表面,用干燥無菌棉簽插入宮頸管內(nèi)轉(zhuǎn)動10圈,待棉簽吸取分泌物后,取出棉簽放入干燥無菌管,折斷尾部。取樣過程中,棉簽避免接觸陰道口及陰道壁,以防發(fā)生標(biāo)本污染。所有研究對象的取樣和移植均為同一操作者。

    3.宮頸微生物菌群的檢測:(1)宮頸細(xì)菌總DNA提取:采用PowerSoilDNA分離試劑盒提取宮頸棉簽上的細(xì)菌總DNA,分離出的總DNA含量通過PicoGreen DNAassay(Invitrogen)進(jìn)行定量檢測,并按純化試劑盒說明進(jìn)行純化;(2)16S rRNA基因高可變區(qū)V3-V4高通量測序:使用PCR引物338F(5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3′)和806R(5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′)對總DNA中的16S rRNA V3-V4區(qū)域進(jìn)行PCR擴增(TransStartFastPfu DNA Polymerase),并使用Illumina MiSeq平臺進(jìn)行測序;(3)生物信息學(xué)分析:使用QIIME進(jìn)行生物信息學(xué)分析。根據(jù)OTU分類鑒定結(jié)果,獲得樣本在界、門、綱、目、科、屬、種水平的具體組成和豐度。后續(xù)分析包括聚類分析、Alpha多樣性、Beta多樣性分析、顯著性差異分析、線性判別分析及相關(guān)性熱圖。

    三、統(tǒng)計學(xué)分析

    結(jié) 果

    一、患者基本情況比較

    本研究共納入患者30例,其中未孕組13例,活產(chǎn)組17例。兩組患者年齡、不孕年限、BMI、基礎(chǔ)FSH、竇卵泡數(shù)(AFC)、原發(fā)不孕比例及不孕因素差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)(表1)。

    表1 兩組患者基本情況比較[(-±s),n(%)]

    二、患者促排卵及胚胎發(fā)育情況比較

    兩組患者促排卵方案、受精方式、平均Gn用量、HCG日P水平、HCG日內(nèi)膜厚度、獲卵數(shù)、可用胚胎數(shù)、優(yōu)胚數(shù)、移植胚胎數(shù)及移植優(yōu)胚數(shù)比較均無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05),活產(chǎn)組Gn天數(shù)及HCG日E2水平均顯著高于未孕組(P<0.05)(表2)。

    表2 兩組患者促排卵及胚胎發(fā)育情況比較[(-±s),n(%)]

    三、兩組患者的宮頸微生物組成

    1.菌群多樣性分析:兩組樣本共檢測出有效序列數(shù)2 349 161條。以序列數(shù)與物種數(shù)或多樣性指數(shù)構(gòu)建稀釋曲線。Alpha多樣性是對樣品中物種多樣性的分析,包含物種的豐富度和均勻度兩個方面。其中,Chao1估計菌落中包含物種的數(shù)目;Good’s_coverage代表微生物覆蓋率;Shannon指數(shù)表示物種多樣性。各個標(biāo)本多樣性物種含量經(jīng)秩和檢驗,兩組宮頸菌群在物種豐富度和均勻度方面比較均無統(tǒng)計學(xué)差異(圖1 A~F)。

    采用Beta多樣性對兩組生物多樣性進(jìn)行比較。Beta多樣性指不同群落之間的物種差異,通過計算樣品間的距離矩陣,觀察樣本間差異。本文采用PCA主成分分析觀察樣本之間的差異,數(shù)據(jù)顯示兩組患者宮頸微生物菌群組成成分有統(tǒng)計學(xué)差異(P=0.002);通過UPGMA層次聚類分析,直觀顯示不同組中的微生物進(jìn)化的差異程度較小(P=0.1)(圖1 G~H)。

    A:Chao1指數(shù)稀釋曲線;B:Chao1指數(shù)小提琴圖;C:Goods_coverage稀釋曲線;D:Goods_coverage指數(shù)小提琴圖;E:Shannon指數(shù)稀釋曲線;F:Shannon指數(shù)小提琴圖;G:Beta多樣性PCA分析;H:UPGMA層次聚類分析。N:未孕組;P:活產(chǎn)組。

    2.兩組物種豐度聚類分析及組間菌群門、科、屬、種水平差異:根據(jù)feature結(jié)果和各樣品feature特征表,獲得界、門、綱、目、科、屬、種水平物種豐度表,并對兩組間物種組成及差異進(jìn)行分析。選取豐度最高的30個物種分類,將每組在門、屬的相對豐度以氣泡圖形式展現(xiàn)。采用熱圖展示兩組在門-科-屬-種水平上菌群結(jié)構(gòu)不同(圖2)。

    菌門水平,共檢測到25種,相對豐度在1%以上共4種,為厚壁門、變形桿菌門、放線菌門、擬桿菌,占宮頸樣本微生物總數(shù)的90%以上。

    科水平,活產(chǎn)組相對豐度最多的為乳桿菌科(67.34%)、雙歧桿菌科(9.99%)、莫拉菌科(2.94%);未孕組豐度最多的為乳桿菌科(58.40%)、雙歧桿菌科(9.26%)、假單胞菌科(4.64%),兩組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

    屬水平,活產(chǎn)組相對豐度最多的為乳桿菌屬(67.33%)、加德納菌屬(9.90%)、不動細(xì)菌屬(2.76%);未孕組相對豐度最多的為乳桿菌屬(58.40%)、加德納菌屬(8.84%)、假單胞菌屬(4.64%)、大腸桿菌志賀氏菌屬(2.76%)。兩組患者主導(dǎo)菌群均為厚壁門乳桿菌屬,活產(chǎn)組乳桿菌屬豐度較高,但兩組差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

    種水平,兩組主導(dǎo)菌群差異顯著?;町a(chǎn)組豐度最高的分別為卷曲乳桿菌(43.71%)、惰性乳桿菌(13.90%)、陰道加德納菌(6.81%)、詹氏乳桿菌(3.55%)、未培養(yǎng)的乳桿菌(3.19%);未孕組為惰性乳桿菌(50.29%)、陰道加德納菌(6.90%)、卷曲乳桿菌(3.86%)、假單胞菌(3.37%)、未分類的志賀氏菌(2.83%)。兩組比較,卷曲乳桿菌和惰性乳桿菌相對豐度差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

    采用線性判別分析(LEfSe)方法對兩組患者宮頸微生物群進(jìn)行分析,共發(fā)現(xiàn)7個生物標(biāo)記物,包括屬水平2個,種水平5個。其中,活產(chǎn)組生物標(biāo)記物主要有種水平的卷曲乳酸桿菌和奧爾塞內(nèi)拉菌,未孕組生物標(biāo)記物有胃瘤球菌屬、理研菌屬,種水平有惰性乳桿菌、未識別的胃瘤球菌、里肯內(nèi)拉菌及未識別的里肯內(nèi)拉菌。

    3.環(huán)境因素相關(guān)性分析:為研究環(huán)境因素與宮頸微生物群的影響,采用Spearman秩相關(guān)系數(shù)分析各組不孕類型、年齡、AFC、基礎(chǔ)FSH、促排卵方案、HCG日E2水平、Gn天數(shù)等環(huán)境因素對胚胎移植日宮頸菌群屬、種相對豐度最多的10種菌群的關(guān)系。結(jié)果顯示,屬水平,乳桿菌屬相對豐度與各環(huán)境因素?zé)o相關(guān)性,韋榮球菌屬和鏈球菌屬相對豐度與促排卵天數(shù)正相關(guān)(P<0.05);種水平,優(yōu)勢菌群惰性乳桿菌與促排卵天數(shù)負(fù)相關(guān)(P<0.05),未培養(yǎng)的乳桿菌與BMI負(fù)相關(guān)(P<0.05)。其他非優(yōu)勢菌群中,AY-2011-RS11假單胞菌與促排卵方案相關(guān)(P<0.01);HCG日雌激素水平與屬、種水平豐度前十位菌群均無相關(guān)性(圖3)。

    A:兩組菌群氣泡圖;B:兩組門水平熱圖分析;C:兩組科水平熱圖分析;D:兩組屬水平熱圖分析;E:兩組種水平聚類分析;F:種水平主要菌群詹氏卷曲乳桿菌、惰性乳桿菌兩組的相對豐度;G:兩組經(jīng)線性判別分析(LEfSe)有顯著性差異的物種。N:未孕組;P:活產(chǎn)組

    A:環(huán)境因素與宮頸微生物群屬水平相對豐度前10位菌群相關(guān)性熱圖;B:環(huán)境因素與宮頸微生物群種水平相對豐度前10位菌群相關(guān)性熱圖。

    討 論

    人體不同部位的菌群(例如腸道/呼吸道/皮膚及陰道等)與多種疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[7],現(xiàn)已成為新的研究熱點。生殖系統(tǒng)的微生物約占人體總菌群的9%。女性正常陰道菌群中,以不同類型的乳酸桿菌為主,還寄生了雙歧桿菌、擬桿菌、腸球菌、鏈球菌、加德納菌等多種細(xì)菌,以及支原體、假絲酵母菌等,它們相關(guān)制約、相互作用,共同構(gòu)成陰道微生態(tài)環(huán)境[8]。同時,陰道微生物隨月經(jīng)周期變化而改變,在排卵期和黃體中期豐度最高[9]。生殖系統(tǒng)的微生態(tài)平衡對女性生育能力影響顯著,菌群紊亂引起生殖系統(tǒng)的炎癥,不僅可能導(dǎo)致不孕[2],還與子宮內(nèi)膜容受性、早期妊娠維持、早產(chǎn)等有關(guān)[5,10-11]。

    絕大多數(shù)學(xué)者認(rèn)為,測序技術(shù)發(fā)現(xiàn)的陰道-宮頸及子宮內(nèi)膜的微生物菌群異常對胚胎移植的妊娠結(jié)局產(chǎn)生不可忽視的影響[12]。陰道主要菌群為非乳桿菌更容易出現(xiàn)反復(fù)著床失敗、子宮內(nèi)膜炎及復(fù)發(fā)性流產(chǎn)。付敏等[6]留取移植日陰道分泌物,發(fā)現(xiàn)不明原因反復(fù)著床失敗患者陰道微生物多樣性增加,表現(xiàn)為乳桿菌豐度降低,而陰道乳酸桿菌占主導(dǎo)者具有較高的臨床妊娠率。Moreno等[4]采用基因芯片測定內(nèi)膜容受期宮腔內(nèi)菌群進(jìn)行分析,發(fā)現(xiàn)在容受期內(nèi)膜菌群高度穩(wěn)定,乳酸桿菌為優(yōu)勢菌群組有更好的臨床妊娠結(jié)局。

    對于一般人群,生殖道微生物群分析能否預(yù)測IVF/ICSI-ET妊娠結(jié)局,目前尚存有爭議。2012年Hyman等[13]將高通量測序技術(shù)用于IVF周期內(nèi)患者陰道菌群檢測,發(fā)現(xiàn)移植日陰道菌群會影響IVF妊娠結(jié)局。2017年Franasiak團隊[14]發(fā)現(xiàn),移植管尖端乳酸桿菌占優(yōu)勢的患者臨床妊娠結(jié)局并沒有出現(xiàn)顯著性增高。目前大部分文獻(xiàn)報道以陰道取樣標(biāo)本為主,但從胚胎移植手術(shù)的操作流程考慮,宮頸內(nèi)菌群在移植過程中會被直接帶入宮腔。因此,本研究選擇年輕(<35歲)、可用胚胎>2個、無反復(fù)種植失敗病史的預(yù)后良好患者作為研究對象,分析其宮頸微生物菌群與臨床妊娠結(jié)局的相關(guān)性。研究結(jié)果顯示,活產(chǎn)組與未孕組在門、屬水平均以乳桿菌為優(yōu)勢菌群,其中活產(chǎn)組的屬水平乳桿菌相對豐度較高,但兩組差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05);未孕組患者在胃瘤球菌屬、理研菌屬等異常菌群顯著增加,這與Chen等[15]研究結(jié)果相似。Chen等[15]研究發(fā)現(xiàn),在IVF/ICSI治療過程中,妊娠組和未孕組厚壁門、乳桿菌屬等優(yōu)勢菌群差異無統(tǒng)計學(xué)意義,乳桿菌屬在患有子宮內(nèi)膜炎妊娠組和未孕組比較仍無差異;菌群異常主要體現(xiàn)在非優(yōu)勢菌群,如放線菌屬、酸桿菌屬等。以上研究均提示,在一般人群,乳酸菌屬優(yōu)勢菌群并不是正常生殖道微生物群和良好妊娠結(jié)局的保障。

    在種水平,本研究結(jié)果證實,一般人群中乳桿菌在種水平上的變化對妊娠有一定的預(yù)測作用。活產(chǎn)組以卷曲乳桿菌為主要生物標(biāo)記,未孕組則以惰性乳桿菌為主要生物標(biāo)記,兩組差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。荷蘭學(xué)者在303例接受IVF/ICSI治療的女性陰道菌群研究中得出相同的結(jié)論,該研究結(jié)果顯示,卷曲乳桿菌為優(yōu)勢菌群是預(yù)測妊娠的重要指標(biāo)[16]。在生育期,高水平的雌激素和孕激素維持乳酸桿菌在陰道內(nèi)占優(yōu)勢:雌激素使陰道上皮細(xì)胞內(nèi)糖原蓄積,孕激素促進(jìn)上皮細(xì)胞脫落,釋放糖原。乳酸桿菌將糖原分解為乳酸,維持正常陰道內(nèi)酸性環(huán)境,抑制其他細(xì)菌繁殖。然而,不同乳桿菌的作用完全不同。卷曲乳桿菌可抑制多種陰道致病菌的黏附和增殖,在健康女性陰道中相對豐度高,卷曲乳桿菌的缺失與菌群失調(diào)有密切關(guān)系[17]。研究表明,卷曲乳桿菌基因序列中包含了抑制陰道加德納菌的蛋白基因,并且可以產(chǎn)生抑菌物質(zhì)抑制白色假絲酵母菌生長以及菌絲形成[18]。而惰性乳桿菌很少與其他乳桿菌共存,容易被細(xì)菌取代,在陰道菌群失衡后大量繁殖而成為優(yōu)勢菌群。大多數(shù)研究認(rèn)為,惰性乳桿菌的增多與亞健康狀態(tài)有關(guān),惰性乳桿菌為優(yōu)勢菌增加了患細(xì)菌性陰道病及衣原體的易感性[3,17-19]。異常菌群的存在可能通過宮腔炎性反應(yīng)及影響內(nèi)膜容受性等方式影響胚胎著床[20]。

    本研究中,兩組患者在促排卵天數(shù)及HCG日E2水平上有顯著差異,而相關(guān)性分析表明環(huán)境因素對屬水平上的優(yōu)勢菌群無明顯相關(guān)性。2008年Jakobsson等[20]首次用16s RNA測序法研究降調(diào)周期促排卵期間陰道菌群變化,結(jié)果顯示陰道優(yōu)勢菌群保持相對穩(wěn)定,僅少部分菌群在促排卵過程發(fā)生變化。Zhao等[21]研究發(fā)現(xiàn),不孕女性在促排卵前后陰道菌群無顯著變化。以上結(jié)果提示生殖道菌群在個體中保持相對穩(wěn)定性,促排卵前菌群測定對預(yù)測IVF/ICSI治療結(jié)局仍有意義[16]。在種水平上,促排卵天數(shù)與惰性乳桿菌有相關(guān)性。既往研究表明,促排卵天數(shù)對妊娠結(jié)局無影響[22],由于本研究樣本量較小,仍需進(jìn)一步擴大樣本量分析環(huán)境因素對惰性乳桿菌種相對豐度的影響。

    綜上,本文首次采用16s rRNA測序方法研究新鮮周期胚胎移植日宮頸微生態(tài),針對預(yù)后良好的一般患者展開研究。研究表明,宮頸菌群中優(yōu)勢菌群多為厚壁屬乳桿菌,活產(chǎn)組與未孕組在菌群豐富度及均勻度上無顯著差異,但在物種分布上有顯著差異。卷曲乳桿菌為優(yōu)勢菌群可能是預(yù)測分娩的重要指標(biāo),而惰性桿菌為優(yōu)勢菌群則與著床失敗有關(guān),其可能原因為菌群失調(diào)導(dǎo)致的免疫紊亂。由于本文關(guān)注的為預(yù)后良好人群,且研究樣本量有限,因此宮頸菌群是否影響新鮮周期胚胎移植妊娠結(jié)局尚需擴大樣本量進(jìn)一步研究。本研究結(jié)論不適用于特殊人群,或者凍融胚胎移植周期。

    猜你喜歡
    活產(chǎn)胚胎菌群
    “云雀”還是“貓頭鷹”可能取決于腸道菌群
    中老年保健(2022年2期)2022-08-24 03:20:50
    女性年齡與獲卵數(shù)對體外受精-胚胎移植累積活產(chǎn)率的影響
    IVF/ICSI-ET取卵周期因素與不同移植次數(shù)結(jié)局的相關(guān)性分析
    母親肥胖竟然能導(dǎo)致胚胎缺陷
    “水土不服”和腸道菌群
    科學(xué)(2020年4期)2020-11-26 08:27:06
    母親肥胖竟然能導(dǎo)致胚胎缺陷
    中國婦女體外受精-胚胎移植累計活產(chǎn)率分析
    人口主要指標(biāo)
    DiI 在已固定人胚胎周圍神經(jīng)的示蹤研究
    肉牛剩余采食量與瘤胃微生物菌群關(guān)系
    国产精品久久久久久久久免| 久久精品久久精品一区二区三区| 免费女性裸体啪啪无遮挡网站| 欧美人与善性xxx| 美女中出高潮动态图| 男人添女人高潮全过程视频| 18禁观看日本| 国产精品蜜桃在线观看| 下体分泌物呈黄色| 成人亚洲欧美一区二区av| 精品国产一区二区三区四区第35| 中文字幕亚洲精品专区| 午夜福利视频精品| 中文精品一卡2卡3卡4更新| 日韩视频在线欧美| 国产免费又黄又爽又色| 男人舔女人的私密视频| 成人二区视频| 日韩欧美精品免费久久| 一级,二级,三级黄色视频| 香蕉丝袜av| 欧美日韩精品成人综合77777| 日本午夜av视频| 亚洲av成人精品一二三区| 只有这里有精品99| 交换朋友夫妻互换小说| 国产精品 国内视频| 国产精品一国产av| 搡女人真爽免费视频火全软件| 中国三级夫妇交换| 日韩制服骚丝袜av| 国产精品国产三级专区第一集| 大香蕉久久网| 国产永久视频网站| av又黄又爽大尺度在线免费看| 亚洲色图综合在线观看| 日韩 亚洲 欧美在线| 性色av一级| 十八禁高潮呻吟视频| 又黄又爽又刺激的免费视频.| 男人添女人高潮全过程视频| 日韩电影二区| 午夜av观看不卡| 尾随美女入室| 亚洲中文av在线| 制服丝袜香蕉在线| 成人手机av| 成人毛片a级毛片在线播放| 满18在线观看网站| 最近最新中文字幕大全免费视频 | 国产成人精品一,二区| kizo精华| 插逼视频在线观看| 日韩av不卡免费在线播放| 黄片无遮挡物在线观看| 国产精品无大码| 一级,二级,三级黄色视频| 青春草国产在线视频| 中文字幕最新亚洲高清| 久久热在线av| 久久久精品94久久精品| 亚洲综合色惰| 99热国产这里只有精品6| 亚洲国产精品专区欧美| 国产 一区精品| 波野结衣二区三区在线| 亚洲伊人色综图| 欧美亚洲日本最大视频资源| 国产精品蜜桃在线观看| tube8黄色片| 欧美人与善性xxx| 国产探花极品一区二区| 黄色一级大片看看| 在线天堂中文资源库| 亚洲中文av在线| 人人妻人人爽人人添夜夜欢视频| 国产免费现黄频在线看| 亚洲丝袜综合中文字幕| 日本黄色日本黄色录像| 亚洲精华国产精华液的使用体验| 国产午夜精品一二区理论片| 国产在线视频一区二区| 天天操日日干夜夜撸| 如日韩欧美国产精品一区二区三区| 女人精品久久久久毛片| 亚洲情色 制服丝袜| 国产在视频线精品| 中文字幕亚洲精品专区| 精品一品国产午夜福利视频| av在线观看视频网站免费| 国产成人精品婷婷| 黄网站色视频无遮挡免费观看| 熟女av电影| 国产精品无大码| 亚洲欧美日韩卡通动漫| 一个人免费看片子| 日韩av在线免费看完整版不卡| 久久久精品94久久精品| 蜜桃国产av成人99| 成人亚洲欧美一区二区av| 一本色道久久久久久精品综合| 我要看黄色一级片免费的| 亚洲欧美色中文字幕在线| 国产女主播在线喷水免费视频网站| 国产成人精品婷婷| 热re99久久精品国产66热6| 亚洲精品美女久久久久99蜜臀 | 狂野欧美激情性xxxx在线观看| 免费黄色在线免费观看| www.av在线官网国产| 精品国产乱码久久久久久小说| 18禁在线无遮挡免费观看视频| 精品人妻一区二区三区麻豆| 制服丝袜香蕉在线| 久久人人爽av亚洲精品天堂| 高清在线视频一区二区三区| 中文字幕人妻丝袜制服| 丰满乱子伦码专区| 在线亚洲精品国产二区图片欧美| 中文字幕人妻丝袜制服| 欧美性感艳星| 高清在线视频一区二区三区| 亚洲精品乱码久久久久久按摩| 亚洲av电影在线观看一区二区三区| 婷婷成人精品国产| 肉色欧美久久久久久久蜜桃| 男女国产视频网站| 乱人伦中国视频| av.在线天堂| 一级片'在线观看视频| 欧美精品亚洲一区二区| 亚洲,欧美精品.| 日本午夜av视频| 99九九在线精品视频| 一级爰片在线观看| 只有这里有精品99| 婷婷色综合www| 男女无遮挡免费网站观看| 2022亚洲国产成人精品| 精品国产国语对白av| 国产日韩欧美在线精品| 欧美精品一区二区免费开放| 一级毛片我不卡| 国产色婷婷99| 免费观看a级毛片全部| 精品少妇内射三级| 久久婷婷青草| 少妇被粗大猛烈的视频| 中文字幕av电影在线播放| 欧美成人精品欧美一级黄| 日韩免费高清中文字幕av| 亚洲av福利一区| 一区二区三区四区激情视频| 美女福利国产在线| 五月天丁香电影| 久久精品久久久久久久性| 婷婷色av中文字幕| 日韩电影二区| 精品人妻熟女毛片av久久网站| 日本免费在线观看一区| 免费观看a级毛片全部| 在线观看国产h片| 精品少妇内射三级| 丝袜在线中文字幕| 蜜桃在线观看..| 精品人妻偷拍中文字幕| 亚洲国产欧美在线一区| 亚洲婷婷狠狠爱综合网| 蜜桃国产av成人99| 考比视频在线观看| 22中文网久久字幕| 一级毛片 在线播放| 少妇猛男粗大的猛烈进出视频| 婷婷成人精品国产| 黄色配什么色好看| 日韩精品有码人妻一区| 久久 成人 亚洲| 一级黄片播放器| 午夜影院在线不卡| 男人操女人黄网站| av女优亚洲男人天堂| 高清视频免费观看一区二区| 精品久久蜜臀av无| 男人舔女人的私密视频| 汤姆久久久久久久影院中文字幕| 最后的刺客免费高清国语| 午夜福利乱码中文字幕| 国产一区二区在线观看av| 亚洲国产色片| 色94色欧美一区二区| 一级a做视频免费观看| 人妻系列 视频| 2021少妇久久久久久久久久久| 丝袜脚勾引网站| 麻豆精品久久久久久蜜桃| 国产精品久久久av美女十八| 蜜桃在线观看..| 国产男女超爽视频在线观看| 最黄视频免费看| 欧美少妇被猛烈插入视频| 亚洲av免费高清在线观看| av不卡在线播放| 婷婷成人精品国产| 国产淫语在线视频| 日韩制服丝袜自拍偷拍| 考比视频在线观看| 久久久久久久久久久免费av| 巨乳人妻的诱惑在线观看| 大话2 男鬼变身卡| 中文精品一卡2卡3卡4更新| 久久久久精品性色| 欧美变态另类bdsm刘玥| 欧美日韩成人在线一区二区| 中文精品一卡2卡3卡4更新| 亚洲综合色网址| 嫩草影院入口| 久热久热在线精品观看| 赤兔流量卡办理| 一级,二级,三级黄色视频| 狂野欧美激情性xxxx在线观看| 最近的中文字幕免费完整| 免费人成在线观看视频色| 寂寞人妻少妇视频99o| 精品午夜福利在线看| 最后的刺客免费高清国语| 国产日韩欧美亚洲二区| 九九在线视频观看精品| 久久热在线av| 夜夜爽夜夜爽视频| 国产成人免费观看mmmm| 欧美成人精品欧美一级黄| 边亲边吃奶的免费视频| 91精品伊人久久大香线蕉| 午夜视频国产福利| 看非洲黑人一级黄片| 国产成人aa在线观看| 90打野战视频偷拍视频| 激情五月婷婷亚洲| 天天影视国产精品| 精品国产一区二区久久| 少妇 在线观看| 国产男女超爽视频在线观看| 啦啦啦中文免费视频观看日本| 精品一品国产午夜福利视频| 久久久久视频综合| 欧美成人午夜免费资源| 日本午夜av视频| 最近2019中文字幕mv第一页| 午夜福利在线观看免费完整高清在| 亚洲精品久久午夜乱码| 18禁国产床啪视频网站| 中国三级夫妇交换| av线在线观看网站| 日韩伦理黄色片| 水蜜桃什么品种好| 国产福利在线免费观看视频| 最近手机中文字幕大全| 看十八女毛片水多多多| 日韩成人av中文字幕在线观看| 成年动漫av网址| 中文字幕人妻熟女乱码| 久久人人爽人人片av| 国产av精品麻豆| 人人澡人人妻人| 日韩精品免费视频一区二区三区 | 大片免费播放器 马上看| 亚洲人成网站在线观看播放| 久久人人爽人人爽人人片va| 国产亚洲精品第一综合不卡 | 乱人伦中国视频| 国产精品成人在线| 午夜激情av网站| 精品国产露脸久久av麻豆| 人人妻人人添人人爽欧美一区卜| 精品国产一区二区三区四区第35| 免费不卡的大黄色大毛片视频在线观看| 久热久热在线精品观看| 国产精品无大码| 午夜激情av网站| 国产有黄有色有爽视频| 在线观看美女被高潮喷水网站| 国产淫语在线视频| 午夜激情久久久久久久| 国产乱人偷精品视频| 国产精品成人在线| 激情视频va一区二区三区| 中文天堂在线官网| 亚洲国产色片| 成人毛片60女人毛片免费| 嫩草影院入口| 久久精品人人爽人人爽视色| 久久 成人 亚洲| 午夜视频国产福利| 看非洲黑人一级黄片| 欧美日韩国产mv在线观看视频| 一个人免费看片子| 亚洲精品视频女| 青青草视频在线视频观看| 亚洲av在线观看美女高潮| 国产一区二区激情短视频 | 亚洲av.av天堂| 精品久久国产蜜桃| 亚洲精品456在线播放app| 在线精品无人区一区二区三| 国产精品国产av在线观看| 中文字幕制服av| 91在线精品国自产拍蜜月| 2021少妇久久久久久久久久久| 男人添女人高潮全过程视频| 香蕉国产在线看| 精品卡一卡二卡四卡免费| 91成人精品电影| 亚洲av日韩在线播放| 中文字幕最新亚洲高清| 热99国产精品久久久久久7| 亚洲,欧美,日韩| 精品久久蜜臀av无| 成人二区视频| 在线天堂中文资源库| 国产精品国产三级国产av玫瑰| 又粗又硬又长又爽又黄的视频| 亚洲欧美日韩另类电影网站| 18禁观看日本| 亚洲成av片中文字幕在线观看 | 大片免费播放器 马上看| 99九九在线精品视频| 18禁在线无遮挡免费观看视频| 久久精品国产亚洲av天美| 日本黄色日本黄色录像| 婷婷色麻豆天堂久久| 欧美精品国产亚洲| 成人影院久久| 9色porny在线观看| 国产日韩欧美视频二区| 精品人妻在线不人妻| 午夜精品国产一区二区电影| 妹子高潮喷水视频| 熟女av电影| 制服诱惑二区| 有码 亚洲区| 熟女人妻精品中文字幕| 国产午夜精品一二区理论片| 日韩av不卡免费在线播放| 欧美少妇被猛烈插入视频| 男人舔女人的私密视频| 另类亚洲欧美激情| 日韩中字成人| 最近中文字幕高清免费大全6| 水蜜桃什么品种好| 人妻一区二区av| 超色免费av| 校园人妻丝袜中文字幕| 久热久热在线精品观看| 免费观看在线日韩| 啦啦啦中文免费视频观看日本| 国产色爽女视频免费观看| 超色免费av| 最近中文字幕高清免费大全6| 又黄又爽又刺激的免费视频.| 精品国产一区二区三区久久久樱花| 久久久久久久精品精品| tube8黄色片| 成人毛片60女人毛片免费| 免费大片18禁| 天堂俺去俺来也www色官网| 色94色欧美一区二区| 人成视频在线观看免费观看| 成年人免费黄色播放视频| 免费播放大片免费观看视频在线观看| 国产精品久久久久成人av| 考比视频在线观看| 桃花免费在线播放| 一边亲一边摸免费视频| 久久午夜福利片| 国产午夜精品一二区理论片| 国产极品粉嫩免费观看在线| 欧美 亚洲 国产 日韩一| 日韩在线高清观看一区二区三区| 天天躁夜夜躁狠狠久久av| 一二三四中文在线观看免费高清| 中文字幕制服av| 国产免费一级a男人的天堂| 啦啦啦在线观看免费高清www| 最近的中文字幕免费完整| 亚洲国产日韩一区二区| 亚洲第一区二区三区不卡| 亚洲欧洲精品一区二区精品久久久 | 如何舔出高潮| 精品国产露脸久久av麻豆| 欧美性感艳星| 国语对白做爰xxxⅹ性视频网站| 午夜免费男女啪啪视频观看| 日韩精品有码人妻一区| 亚洲五月色婷婷综合| 国产av码专区亚洲av| 青春草亚洲视频在线观看| 欧美国产精品一级二级三级| 日本vs欧美在线观看视频| 欧美精品亚洲一区二区| 人体艺术视频欧美日本| 97在线视频观看| 亚洲图色成人| 亚洲av日韩在线播放| 日韩成人av中文字幕在线观看| h视频一区二区三区| 视频区图区小说| 国产精品一二三区在线看| 中文字幕另类日韩欧美亚洲嫩草| 亚洲色图综合在线观看| 亚洲三级黄色毛片| 亚洲国产精品专区欧美| 婷婷色av中文字幕| 久久久久久久久久久久大奶| 丰满少妇做爰视频| 国产成人精品无人区| 老司机影院成人| 天天操日日干夜夜撸| 亚洲五月色婷婷综合| av播播在线观看一区| 亚洲五月色婷婷综合| 亚洲精品自拍成人| 热99国产精品久久久久久7| 18+在线观看网站| 久久精品国产鲁丝片午夜精品| 中文字幕人妻丝袜制服| 国产综合精华液| 久久国产精品男人的天堂亚洲 | 九色成人免费人妻av| 韩国av在线不卡| 日韩欧美一区视频在线观看| av.在线天堂| 多毛熟女@视频| 久久久a久久爽久久v久久| 成人毛片a级毛片在线播放| 性色avwww在线观看| 欧美激情国产日韩精品一区| 免费av中文字幕在线| 日本91视频免费播放| 欧美日韩成人在线一区二区| 国产精品嫩草影院av在线观看| 久久精品人人爽人人爽视色| av天堂久久9| 九九爱精品视频在线观看| 美女视频免费永久观看网站| 日韩av在线免费看完整版不卡| 免费久久久久久久精品成人欧美视频 | 制服丝袜香蕉在线| 日日摸夜夜添夜夜爱| 欧美日本中文国产一区发布| 九色成人免费人妻av| 国产精品久久久久久精品古装| 国产黄频视频在线观看| 韩国av在线不卡| 蜜臀久久99精品久久宅男| 九色亚洲精品在线播放| 欧美精品一区二区大全| 性色avwww在线观看| 伦理电影大哥的女人| 欧美另类一区| 97在线人人人人妻| 视频区图区小说| 丝袜在线中文字幕| 91国产中文字幕| 老司机亚洲免费影院| 精品亚洲成a人片在线观看| 蜜臀久久99精品久久宅男| 熟女人妻精品中文字幕| 天堂中文最新版在线下载| 婷婷色综合www| 亚洲中文av在线| 亚洲精品久久午夜乱码| 亚洲,欧美精品.| 国产日韩一区二区三区精品不卡| 美女中出高潮动态图| 在线观看三级黄色| 午夜福利视频在线观看免费| 七月丁香在线播放| 九九爱精品视频在线观看| 久久精品久久久久久噜噜老黄| av卡一久久| 蜜桃国产av成人99| 国产男女超爽视频在线观看| 丰满迷人的少妇在线观看| 男女无遮挡免费网站观看| 一本色道久久久久久精品综合| 国产深夜福利视频在线观看| 制服诱惑二区| 一级毛片我不卡| a级片在线免费高清观看视频| 久久久精品免费免费高清| 久久鲁丝午夜福利片| 男女高潮啪啪啪动态图| 成年av动漫网址| 成人综合一区亚洲| av福利片在线| 美国免费a级毛片| 久久久久久久久久成人| 精品久久蜜臀av无| 成人二区视频| 宅男免费午夜| 亚洲欧洲日产国产| 男人添女人高潮全过程视频| 男人操女人黄网站| 国产精品熟女久久久久浪| 欧美日韩综合久久久久久| 有码 亚洲区| 在线观看免费视频网站a站| 色吧在线观看| 精品一区在线观看国产| 性色av一级| 男女下面插进去视频免费观看 | 亚洲激情五月婷婷啪啪| 午夜福利在线观看免费完整高清在| 国产黄色免费在线视频| 亚洲欧美中文字幕日韩二区| 寂寞人妻少妇视频99o| 亚洲 欧美一区二区三区| a级毛片黄视频| 国产成人精品无人区| 国产精品99久久99久久久不卡 | 日韩制服骚丝袜av| 在现免费观看毛片| 久久毛片免费看一区二区三区| 日韩三级伦理在线观看| 天堂俺去俺来也www色官网| 超色免费av| 亚洲精品成人av观看孕妇| 2022亚洲国产成人精品| 亚洲精品国产色婷婷电影| 国产av一区二区精品久久| 亚洲国产av新网站| 国产乱人偷精品视频| 女人精品久久久久毛片| 国产精品久久久久久精品电影小说| a级毛片在线看网站| 亚洲色图综合在线观看| 亚洲三级黄色毛片| 搡女人真爽免费视频火全软件| 亚洲精品国产av蜜桃| 免费大片黄手机在线观看| 大码成人一级视频| 男人舔女人的私密视频| 国产一区二区在线观看av| 新久久久久国产一级毛片| 亚洲成国产人片在线观看| 国产日韩欧美在线精品| 视频区图区小说| 国产在线一区二区三区精| 国产熟女午夜一区二区三区| 蜜桃国产av成人99| 又大又黄又爽视频免费| 欧美成人精品欧美一级黄| 男的添女的下面高潮视频| a 毛片基地| 永久网站在线| 老司机影院成人| 日韩熟女老妇一区二区性免费视频| 中文字幕最新亚洲高清| 日韩精品免费视频一区二区三区 | 日韩中文字幕视频在线看片| 久久久久久久大尺度免费视频| 中文字幕另类日韩欧美亚洲嫩草| 免费大片18禁| 一区二区日韩欧美中文字幕 | 街头女战士在线观看网站| 狠狠婷婷综合久久久久久88av| 在线观看三级黄色| 在现免费观看毛片| 色5月婷婷丁香| 夫妻午夜视频| 赤兔流量卡办理| 日韩大片免费观看网站| 亚洲精品国产av蜜桃| 在线看a的网站| 久久精品久久精品一区二区三区| 国产日韩欧美在线精品| 日韩av在线免费看完整版不卡| 中国国产av一级| 久热久热在线精品观看| 亚洲精品aⅴ在线观看| 毛片一级片免费看久久久久| 国产色爽女视频免费观看| 如日韩欧美国产精品一区二区三区| www.熟女人妻精品国产 | tube8黄色片| 日韩中文字幕视频在线看片| 久久国产精品男人的天堂亚洲 | 久久久久久久国产电影| 亚洲美女黄色视频免费看| 国产精品国产三级国产专区5o| 狠狠婷婷综合久久久久久88av| 亚洲欧美日韩卡通动漫| 少妇被粗大的猛进出69影院 | 我的女老师完整版在线观看| 国产成人aa在线观看| 久久国产精品大桥未久av| 中文精品一卡2卡3卡4更新| 国产精品一区www在线观看| 夫妻性生交免费视频一级片| 久久人人爽人人爽人人片va| 久久精品夜色国产| 你懂的网址亚洲精品在线观看| 性色avwww在线观看| 插逼视频在线观看| 99九九在线精品视频| 九九在线视频观看精品| 日韩免费高清中文字幕av| 欧美最新免费一区二区三区| 丝袜美足系列| 国产精品久久久久久久电影| 亚洲成人手机| 国产探花极品一区二区| 亚洲成国产人片在线观看| 涩涩av久久男人的天堂| 亚洲伊人久久精品综合|