崔媛媛,葉德盛,鄭煒煒,譚穎,馬從順,詹雪君,宋革*
(1.廣東省生殖醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)中心,廣州 510600;2.廣東省生殖科學(xué)研究所,廣州 510600;3.國家衛(wèi)生健康委男性生殖與遺傳重點實驗室,廣州 510600;4.廣州市婦女兒童醫(yī)療中心生殖醫(yī)學(xué)中心,廣州 510623)
自1978年世界上第1例試管嬰兒出生,輔助生殖技術(shù)(ART)尤其是體外受精-胚胎移植(IVF-ET)技術(shù)已成為治療不孕癥的有效手段。垂體降調(diào)節(jié)藥物使促排卵更高效,胚胎玻璃化冷凍技術(shù)大大提升胚胎利用率,臨床妊娠率逐步提高。但事實上,由于胚胎的種植機制仍不明確,即便經(jīng)過遺傳學(xué)篩查胚胎著床率仍較低,孕早期流產(chǎn)率和早產(chǎn)率較高,反復(fù)著床失敗患者缺乏有效的臨床治療手段[1]。因此,改善子宮內(nèi)膜容受性及妊娠結(jié)局,成為ART發(fā)展的瓶頸。近年研究發(fā)現(xiàn),生殖系統(tǒng)微生物組異常不僅導(dǎo)致生殖道感染和女性不孕癥[2-3],還與胚胎移植后的妊娠結(jié)局有關(guān)[4-6],是改善IVF預(yù)后的新突破口。
隨著基因測序技術(shù)的發(fā)展,借助高通量測序技術(shù)對可變區(qū)進(jìn)行測序,結(jié)合生物信息學(xué)分析,可全面了解機體內(nèi)的菌群多樣性,同時了解菌群質(zhì)和量的變化與疾病發(fā)生發(fā)展的關(guān)系,也為了解未知菌屬在疾病中的作用開辟了新的研究方法。本文通過高通量測序技術(shù),研究新鮮取卵周期移植日宮頸微生態(tài)菌群對IVF妊娠結(jié)局的影響。
選擇2020年3—9月在廣東省生殖醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)中心行IVF/ICSI新鮮周期胚胎移植的患者為研究對象,提取其宮頸分泌物作菌群檢測。
納入標(biāo)準(zhǔn):(1)年齡<35歲;(2)卵泡刺激素(FSH)<10 U/L且抗苗勒管激素(AMH)>1.1 ng/ml;(3)可用胚胎>2個;(4)宮腔鏡檢查排除子宮內(nèi)膜炎;(5)移植術(shù)前3個月內(nèi)行宮頸黏液檢查,排除衣原體、淋病奈瑟菌感染;一周內(nèi)行陰道分泌物檢查,排除陰道特異性及非特異性炎癥;無陰道瘙癢、白帶增多等自覺癥狀;(6)取樣前1個月內(nèi)未使用抗生素;取樣3 d內(nèi)未行陰道沖洗,無性生活。
排除標(biāo)準(zhǔn):(1)女方急慢性宮頸炎;(2)子宮畸形、宮腔粘連、子宮黏膜下肌瘤、子宮內(nèi)膜息肉、子宮腺肌癥、子宮內(nèi)膜異位癥、輸卵管積水;(3)合并抗磷脂綜合征、甲狀腺功能異常、糖尿病等嚴(yán)重系統(tǒng)性疾?。?4)有復(fù)發(fā)性流產(chǎn)、反復(fù)著床失敗病史。
所有研究對象均簽署書面知情同意書。本研究已獲得廣東省生殖醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)(倫理審查號:論審研第[2019](25)號)。
本研究共收取標(biāo)本33例,其中活產(chǎn)17例,生化妊娠1例,流產(chǎn)2例,未孕13例,選取活產(chǎn)及未孕患者共30例進(jìn)行分析。
1.IVF/ICSI-ET治療:采用長方案或拮抗劑方案,常規(guī)劑量啟動(150~300 U),定期監(jiān)測排卵,根據(jù)卵泡生長情況及激素水平適當(dāng)調(diào)整促排藥物劑量。當(dāng)1個卵泡直徑≥18 mm或3個卵泡直徑≥17 mm 時,注射重組人絨毛膜促性腺激素(HCG,艾澤,默克雪蘭諾,德國)或/和GnRH-a(達(dá)菲林,博福-益普生,法國)扳機,36~37 h后取卵。取卵后予黃體酮(浙江仙琚) 60 mg/d 肌肉注射黃體支持,3~5 d后行胚胎移植。移植后予地屈孕酮(達(dá)芙通,雅培,荷蘭) 30 mg/d + 黃體酮凝膠(雪諾同,默克雪蘭諾,德國) 90 mg/d 黃體支持。移植后12 d抽血查β-HCG,生化妊娠者(HCG>5 U/L)繼續(xù)黃體支持。移植28 d后行陰道B超檢查可見宮內(nèi)孕囊確定為臨床妊娠,臨床妊娠者黃體支持至孕10~11周。按常規(guī)流程進(jìn)行隨訪。
2.標(biāo)本采集:患者均于胚胎移植手術(shù)時留取宮頸管分泌物標(biāo)本。清潔外陰,消毒鋪巾,窺陰器撐開陰道,無菌棉球擦拭宮頸表面,用干燥無菌棉簽插入宮頸管內(nèi)轉(zhuǎn)動10圈,待棉簽吸取分泌物后,取出棉簽放入干燥無菌管,折斷尾部。取樣過程中,棉簽避免接觸陰道口及陰道壁,以防發(fā)生標(biāo)本污染。所有研究對象的取樣和移植均為同一操作者。
3.宮頸微生物菌群的檢測:(1)宮頸細(xì)菌總DNA提取:采用PowerSoilDNA分離試劑盒提取宮頸棉簽上的細(xì)菌總DNA,分離出的總DNA含量通過PicoGreen DNAassay(Invitrogen)進(jìn)行定量檢測,并按純化試劑盒說明進(jìn)行純化;(2)16S rRNA基因高可變區(qū)V3-V4高通量測序:使用PCR引物338F(5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3′)和806R(5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′)對總DNA中的16S rRNA V3-V4區(qū)域進(jìn)行PCR擴增(TransStartFastPfu DNA Polymerase),并使用Illumina MiSeq平臺進(jìn)行測序;(3)生物信息學(xué)分析:使用QIIME進(jìn)行生物信息學(xué)分析。根據(jù)OTU分類鑒定結(jié)果,獲得樣本在界、門、綱、目、科、屬、種水平的具體組成和豐度。后續(xù)分析包括聚類分析、Alpha多樣性、Beta多樣性分析、顯著性差異分析、線性判別分析及相關(guān)性熱圖。
本研究共納入患者30例,其中未孕組13例,活產(chǎn)組17例。兩組患者年齡、不孕年限、BMI、基礎(chǔ)FSH、竇卵泡數(shù)(AFC)、原發(fā)不孕比例及不孕因素差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)(表1)。
表1 兩組患者基本情況比較[(-±s),n(%)]
兩組患者促排卵方案、受精方式、平均Gn用量、HCG日P水平、HCG日內(nèi)膜厚度、獲卵數(shù)、可用胚胎數(shù)、優(yōu)胚數(shù)、移植胚胎數(shù)及移植優(yōu)胚數(shù)比較均無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05),活產(chǎn)組Gn天數(shù)及HCG日E2水平均顯著高于未孕組(P<0.05)(表2)。
表2 兩組患者促排卵及胚胎發(fā)育情況比較[(-±s),n(%)]
1.菌群多樣性分析:兩組樣本共檢測出有效序列數(shù)2 349 161條。以序列數(shù)與物種數(shù)或多樣性指數(shù)構(gòu)建稀釋曲線。Alpha多樣性是對樣品中物種多樣性的分析,包含物種的豐富度和均勻度兩個方面。其中,Chao1估計菌落中包含物種的數(shù)目;Good’s_coverage代表微生物覆蓋率;Shannon指數(shù)表示物種多樣性。各個標(biāo)本多樣性物種含量經(jīng)秩和檢驗,兩組宮頸菌群在物種豐富度和均勻度方面比較均無統(tǒng)計學(xué)差異(圖1 A~F)。
采用Beta多樣性對兩組生物多樣性進(jìn)行比較。Beta多樣性指不同群落之間的物種差異,通過計算樣品間的距離矩陣,觀察樣本間差異。本文采用PCA主成分分析觀察樣本之間的差異,數(shù)據(jù)顯示兩組患者宮頸微生物菌群組成成分有統(tǒng)計學(xué)差異(P=0.002);通過UPGMA層次聚類分析,直觀顯示不同組中的微生物進(jìn)化的差異程度較小(P=0.1)(圖1 G~H)。
A:Chao1指數(shù)稀釋曲線;B:Chao1指數(shù)小提琴圖;C:Goods_coverage稀釋曲線;D:Goods_coverage指數(shù)小提琴圖;E:Shannon指數(shù)稀釋曲線;F:Shannon指數(shù)小提琴圖;G:Beta多樣性PCA分析;H:UPGMA層次聚類分析。N:未孕組;P:活產(chǎn)組。
2.兩組物種豐度聚類分析及組間菌群門、科、屬、種水平差異:根據(jù)feature結(jié)果和各樣品feature特征表,獲得界、門、綱、目、科、屬、種水平物種豐度表,并對兩組間物種組成及差異進(jìn)行分析。選取豐度最高的30個物種分類,將每組在門、屬的相對豐度以氣泡圖形式展現(xiàn)。采用熱圖展示兩組在門-科-屬-種水平上菌群結(jié)構(gòu)不同(圖2)。
菌門水平,共檢測到25種,相對豐度在1%以上共4種,為厚壁門、變形桿菌門、放線菌門、擬桿菌,占宮頸樣本微生物總數(shù)的90%以上。
科水平,活產(chǎn)組相對豐度最多的為乳桿菌科(67.34%)、雙歧桿菌科(9.99%)、莫拉菌科(2.94%);未孕組豐度最多的為乳桿菌科(58.40%)、雙歧桿菌科(9.26%)、假單胞菌科(4.64%),兩組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。
屬水平,活產(chǎn)組相對豐度最多的為乳桿菌屬(67.33%)、加德納菌屬(9.90%)、不動細(xì)菌屬(2.76%);未孕組相對豐度最多的為乳桿菌屬(58.40%)、加德納菌屬(8.84%)、假單胞菌屬(4.64%)、大腸桿菌志賀氏菌屬(2.76%)。兩組患者主導(dǎo)菌群均為厚壁門乳桿菌屬,活產(chǎn)組乳桿菌屬豐度較高,但兩組差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。
種水平,兩組主導(dǎo)菌群差異顯著?;町a(chǎn)組豐度最高的分別為卷曲乳桿菌(43.71%)、惰性乳桿菌(13.90%)、陰道加德納菌(6.81%)、詹氏乳桿菌(3.55%)、未培養(yǎng)的乳桿菌(3.19%);未孕組為惰性乳桿菌(50.29%)、陰道加德納菌(6.90%)、卷曲乳桿菌(3.86%)、假單胞菌(3.37%)、未分類的志賀氏菌(2.83%)。兩組比較,卷曲乳桿菌和惰性乳桿菌相對豐度差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。
采用線性判別分析(LEfSe)方法對兩組患者宮頸微生物群進(jìn)行分析,共發(fā)現(xiàn)7個生物標(biāo)記物,包括屬水平2個,種水平5個。其中,活產(chǎn)組生物標(biāo)記物主要有種水平的卷曲乳酸桿菌和奧爾塞內(nèi)拉菌,未孕組生物標(biāo)記物有胃瘤球菌屬、理研菌屬,種水平有惰性乳桿菌、未識別的胃瘤球菌、里肯內(nèi)拉菌及未識別的里肯內(nèi)拉菌。
3.環(huán)境因素相關(guān)性分析:為研究環(huán)境因素與宮頸微生物群的影響,采用Spearman秩相關(guān)系數(shù)分析各組不孕類型、年齡、AFC、基礎(chǔ)FSH、促排卵方案、HCG日E2水平、Gn天數(shù)等環(huán)境因素對胚胎移植日宮頸菌群屬、種相對豐度最多的10種菌群的關(guān)系。結(jié)果顯示,屬水平,乳桿菌屬相對豐度與各環(huán)境因素?zé)o相關(guān)性,韋榮球菌屬和鏈球菌屬相對豐度與促排卵天數(shù)正相關(guān)(P<0.05);種水平,優(yōu)勢菌群惰性乳桿菌與促排卵天數(shù)負(fù)相關(guān)(P<0.05),未培養(yǎng)的乳桿菌與BMI負(fù)相關(guān)(P<0.05)。其他非優(yōu)勢菌群中,AY-2011-RS11假單胞菌與促排卵方案相關(guān)(P<0.01);HCG日雌激素水平與屬、種水平豐度前十位菌群均無相關(guān)性(圖3)。
A:兩組菌群氣泡圖;B:兩組門水平熱圖分析;C:兩組科水平熱圖分析;D:兩組屬水平熱圖分析;E:兩組種水平聚類分析;F:種水平主要菌群詹氏卷曲乳桿菌、惰性乳桿菌兩組的相對豐度;G:兩組經(jīng)線性判別分析(LEfSe)有顯著性差異的物種。N:未孕組;P:活產(chǎn)組
A:環(huán)境因素與宮頸微生物群屬水平相對豐度前10位菌群相關(guān)性熱圖;B:環(huán)境因素與宮頸微生物群種水平相對豐度前10位菌群相關(guān)性熱圖。
人體不同部位的菌群(例如腸道/呼吸道/皮膚及陰道等)與多種疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[7],現(xiàn)已成為新的研究熱點。生殖系統(tǒng)的微生物約占人體總菌群的9%。女性正常陰道菌群中,以不同類型的乳酸桿菌為主,還寄生了雙歧桿菌、擬桿菌、腸球菌、鏈球菌、加德納菌等多種細(xì)菌,以及支原體、假絲酵母菌等,它們相關(guān)制約、相互作用,共同構(gòu)成陰道微生態(tài)環(huán)境[8]。同時,陰道微生物隨月經(jīng)周期變化而改變,在排卵期和黃體中期豐度最高[9]。生殖系統(tǒng)的微生態(tài)平衡對女性生育能力影響顯著,菌群紊亂引起生殖系統(tǒng)的炎癥,不僅可能導(dǎo)致不孕[2],還與子宮內(nèi)膜容受性、早期妊娠維持、早產(chǎn)等有關(guān)[5,10-11]。
絕大多數(shù)學(xué)者認(rèn)為,測序技術(shù)發(fā)現(xiàn)的陰道-宮頸及子宮內(nèi)膜的微生物菌群異常對胚胎移植的妊娠結(jié)局產(chǎn)生不可忽視的影響[12]。陰道主要菌群為非乳桿菌更容易出現(xiàn)反復(fù)著床失敗、子宮內(nèi)膜炎及復(fù)發(fā)性流產(chǎn)。付敏等[6]留取移植日陰道分泌物,發(fā)現(xiàn)不明原因反復(fù)著床失敗患者陰道微生物多樣性增加,表現(xiàn)為乳桿菌豐度降低,而陰道乳酸桿菌占主導(dǎo)者具有較高的臨床妊娠率。Moreno等[4]采用基因芯片測定內(nèi)膜容受期宮腔內(nèi)菌群進(jìn)行分析,發(fā)現(xiàn)在容受期內(nèi)膜菌群高度穩(wěn)定,乳酸桿菌為優(yōu)勢菌群組有更好的臨床妊娠結(jié)局。
對于一般人群,生殖道微生物群分析能否預(yù)測IVF/ICSI-ET妊娠結(jié)局,目前尚存有爭議。2012年Hyman等[13]將高通量測序技術(shù)用于IVF周期內(nèi)患者陰道菌群檢測,發(fā)現(xiàn)移植日陰道菌群會影響IVF妊娠結(jié)局。2017年Franasiak團隊[14]發(fā)現(xiàn),移植管尖端乳酸桿菌占優(yōu)勢的患者臨床妊娠結(jié)局并沒有出現(xiàn)顯著性增高。目前大部分文獻(xiàn)報道以陰道取樣標(biāo)本為主,但從胚胎移植手術(shù)的操作流程考慮,宮頸內(nèi)菌群在移植過程中會被直接帶入宮腔。因此,本研究選擇年輕(<35歲)、可用胚胎>2個、無反復(fù)種植失敗病史的預(yù)后良好患者作為研究對象,分析其宮頸微生物菌群與臨床妊娠結(jié)局的相關(guān)性。研究結(jié)果顯示,活產(chǎn)組與未孕組在門、屬水平均以乳桿菌為優(yōu)勢菌群,其中活產(chǎn)組的屬水平乳桿菌相對豐度較高,但兩組差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05);未孕組患者在胃瘤球菌屬、理研菌屬等異常菌群顯著增加,這與Chen等[15]研究結(jié)果相似。Chen等[15]研究發(fā)現(xiàn),在IVF/ICSI治療過程中,妊娠組和未孕組厚壁門、乳桿菌屬等優(yōu)勢菌群差異無統(tǒng)計學(xué)意義,乳桿菌屬在患有子宮內(nèi)膜炎妊娠組和未孕組比較仍無差異;菌群異常主要體現(xiàn)在非優(yōu)勢菌群,如放線菌屬、酸桿菌屬等。以上研究均提示,在一般人群,乳酸菌屬優(yōu)勢菌群并不是正常生殖道微生物群和良好妊娠結(jié)局的保障。
在種水平,本研究結(jié)果證實,一般人群中乳桿菌在種水平上的變化對妊娠有一定的預(yù)測作用。活產(chǎn)組以卷曲乳桿菌為主要生物標(biāo)記,未孕組則以惰性乳桿菌為主要生物標(biāo)記,兩組差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。荷蘭學(xué)者在303例接受IVF/ICSI治療的女性陰道菌群研究中得出相同的結(jié)論,該研究結(jié)果顯示,卷曲乳桿菌為優(yōu)勢菌群是預(yù)測妊娠的重要指標(biāo)[16]。在生育期,高水平的雌激素和孕激素維持乳酸桿菌在陰道內(nèi)占優(yōu)勢:雌激素使陰道上皮細(xì)胞內(nèi)糖原蓄積,孕激素促進(jìn)上皮細(xì)胞脫落,釋放糖原。乳酸桿菌將糖原分解為乳酸,維持正常陰道內(nèi)酸性環(huán)境,抑制其他細(xì)菌繁殖。然而,不同乳桿菌的作用完全不同。卷曲乳桿菌可抑制多種陰道致病菌的黏附和增殖,在健康女性陰道中相對豐度高,卷曲乳桿菌的缺失與菌群失調(diào)有密切關(guān)系[17]。研究表明,卷曲乳桿菌基因序列中包含了抑制陰道加德納菌的蛋白基因,并且可以產(chǎn)生抑菌物質(zhì)抑制白色假絲酵母菌生長以及菌絲形成[18]。而惰性乳桿菌很少與其他乳桿菌共存,容易被細(xì)菌取代,在陰道菌群失衡后大量繁殖而成為優(yōu)勢菌群。大多數(shù)研究認(rèn)為,惰性乳桿菌的增多與亞健康狀態(tài)有關(guān),惰性乳桿菌為優(yōu)勢菌增加了患細(xì)菌性陰道病及衣原體的易感性[3,17-19]。異常菌群的存在可能通過宮腔炎性反應(yīng)及影響內(nèi)膜容受性等方式影響胚胎著床[20]。
本研究中,兩組患者在促排卵天數(shù)及HCG日E2水平上有顯著差異,而相關(guān)性分析表明環(huán)境因素對屬水平上的優(yōu)勢菌群無明顯相關(guān)性。2008年Jakobsson等[20]首次用16s RNA測序法研究降調(diào)周期促排卵期間陰道菌群變化,結(jié)果顯示陰道優(yōu)勢菌群保持相對穩(wěn)定,僅少部分菌群在促排卵過程發(fā)生變化。Zhao等[21]研究發(fā)現(xiàn),不孕女性在促排卵前后陰道菌群無顯著變化。以上結(jié)果提示生殖道菌群在個體中保持相對穩(wěn)定性,促排卵前菌群測定對預(yù)測IVF/ICSI治療結(jié)局仍有意義[16]。在種水平上,促排卵天數(shù)與惰性乳桿菌有相關(guān)性。既往研究表明,促排卵天數(shù)對妊娠結(jié)局無影響[22],由于本研究樣本量較小,仍需進(jìn)一步擴大樣本量分析環(huán)境因素對惰性乳桿菌種相對豐度的影響。
綜上,本文首次采用16s rRNA測序方法研究新鮮周期胚胎移植日宮頸微生態(tài),針對預(yù)后良好的一般患者展開研究。研究表明,宮頸菌群中優(yōu)勢菌群多為厚壁屬乳桿菌,活產(chǎn)組與未孕組在菌群豐富度及均勻度上無顯著差異,但在物種分布上有顯著差異。卷曲乳桿菌為優(yōu)勢菌群可能是預(yù)測分娩的重要指標(biāo),而惰性桿菌為優(yōu)勢菌群則與著床失敗有關(guān),其可能原因為菌群失調(diào)導(dǎo)致的免疫紊亂。由于本文關(guān)注的為預(yù)后良好人群,且研究樣本量有限,因此宮頸菌群是否影響新鮮周期胚胎移植妊娠結(jié)局尚需擴大樣本量進(jìn)一步研究。本研究結(jié)論不適用于特殊人群,或者凍融胚胎移植周期。