粉被蟲(chóng)草的分離鑒定和培養(yǎng)初探*

楊珍福，劉紹雄，華 蓉，孫達(dá)鋒，尚陸娥，馬 明，馮云利，和 勇，李建英**

（1.中華全國(guó)供銷(xiāo)合作總社昆明食用菌研究所，云南 昆明 650221；2.云南省食用菌產(chǎn)業(yè)發(fā)展研究院，云南 昆明 650221）

冬蟲(chóng)夏草是世界聞名的名貴中藥材，藥用價(jià)值和商業(yè)價(jià)值巨大，但野生冬蟲(chóng)夏草生長(zhǎng)條件苛刻，自然寄生率低，加上人們的濫采，導(dǎo)致天然資源緊缺，價(jià)格昂貴[1]。因此，代用品的開(kāi)發(fā)成為必然趨勢(shì)。目前，蟲(chóng)草的種類(lèi)繁多，是子囊菌中多樣性較高的類(lèi)群之一，全世界已報(bào)道的種有近千個(gè)[2]?，F(xiàn)代藥理藥化研究發(fā)現(xiàn)，不同蟲(chóng)草種類(lèi)所含成分千差萬(wàn)別，其功效也各有不同[3]。因此調(diào)查和研究中國(guó)蟲(chóng)草資源以及如何合理利用眾多的蟲(chóng)草資源不僅有重要的理論研究意義，而且也具有極其珍貴的應(yīng)用價(jià)值。蟲(chóng)草素和N6-（2-羥乙基）腺嘌呤核苷（HEA）是冬蟲(chóng)夏草中非常重要的生物活性物質(zhì)，而粉被蟲(chóng)草是蟲(chóng)草素和HEA的良好來(lái)源，可以作為冬蟲(chóng)夏草的替代品[4]。

粉被蟲(chóng)草（Cordyceps pruinosa Petch），又名繭草、繭蟲(chóng)草，常寄生于多種鱗翅目昆蟲(chóng)的蛹繭上，是著名真菌學(xué)家Petch在1924年發(fā)現(xiàn)及命名的，其無(wú)性型新種—粉被馬利亞霉（Mariannaea pruinosa）由我國(guó)學(xué)者梁宗琦確證、鑒定和命名[5-8]。現(xiàn)有報(bào)道中粉被蟲(chóng)草主要分布于我國(guó)貴州、浙江、江西、福建、湖北、廣東、吉林、遼寧、臺(tái)灣等省[7-10]。試驗(yàn)證實(shí)，粉被蟲(chóng)草具鈣離子拮抗、抗紫外線(xiàn)輻射損害、抑制細(xì)菌、抗炎、抗腫瘤、抗巨噬細(xì)胞吞噬和調(diào)節(jié)機(jī)體免疫力等生物活性[11-17]。由此可見(jiàn)，粉被蟲(chóng)草是一種具有廣泛生物學(xué)活性、可作為冬蟲(chóng)夏草替代品，且具有較高利用價(jià)值、較大開(kāi)發(fā)前景的蟲(chóng)草資源。

云南是冬蟲(chóng)夏草的主產(chǎn)區(qū)之一，近些年來(lái)由于過(guò)度采挖，野生冬蟲(chóng)夏草資源緊缺，因此尋找和選育出可更好地替代冬蟲(chóng)夏草的蟲(chóng)草菌種，以保護(hù)蟲(chóng)草資源多樣性和日益枯竭的冬蟲(chóng)夏草資源就顯得尤為重要。本研究中，在云南采集到一株野生粉被蟲(chóng)草，對(duì)其無(wú)性型進(jìn)行了分離培養(yǎng)，同時(shí)對(duì)菌株進(jìn)行分子生物學(xué)鑒定，并對(duì)其培養(yǎng)特性和馴化栽培進(jìn)行初步研究，以期為該菌的開(kāi)發(fā)利用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試菌株與培養(yǎng)基

野生蟲(chóng)草子實(shí)體采集自云南省昆明市西山（101°25′59″E，24°59′27″N），保存于中華全國(guó)供銷(xiāo)合作總社昆明食用菌研究所。

PDA培養(yǎng)基：馬鈴薯200 g、葡萄糖20 g、瓊脂18 g，水1 000 mL，pH自然。

察氏培養(yǎng)基：硝酸鈉3 g、磷酸二氫鉀1 g、硫酸鎂0.5 g、氯化鉀0.5 g、硫酸亞鐵0.01 g、蔗糖30 g、瓊脂18 g，水1 000 mL。

PDA液體綜合培養(yǎng)基：馬鈴薯200 g、葡萄糖20 g、酵母粉 2 g、MgSO4·7H2O 0.5 g、KH2PO41 g，水1 000 mL，pH自然。

大米培養(yǎng)基：20 g大米加入40 mL營(yíng)養(yǎng)液。

小麥培養(yǎng)基：20 g小麥加入40 mL營(yíng)養(yǎng)液。

營(yíng)養(yǎng)液：葡萄糖 10 g·L-1、蛋白胨 10 g·L-1、酵母粉 10 g·L-1。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 菌株子實(shí)體形態(tài)學(xué)鑒定

對(duì)野生蟲(chóng)草進(jìn)行宏觀(guān)和顯微形態(tài)特征觀(guān)察，參照參考文獻(xiàn)[6，8，9]進(jìn)行形態(tài)學(xué)初步鑒定。

1.2.2 菌株分離培養(yǎng)

對(duì)野生蟲(chóng)草子實(shí)體進(jìn)行組織分離。選擇完整的蟲(chóng)草，用清水清洗表面，再用75%酒精浸泡1 min左右，然后用無(wú)菌水沖洗并擦干。在超凈工作臺(tái)內(nèi)，用無(wú)菌手術(shù)刀切開(kāi)子座頂端部分，用鑷子夾取2 mm～4 mm組織塊，接于PDA培養(yǎng)基斜面，置于25℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)。挑取無(wú)污染的菌絲，反復(fù)純化，將純化后菌株接種到察氏培養(yǎng)基上，觀(guān)察菌落形態(tài)及菌絲顯微結(jié)構(gòu)。

1.2.3 菌株分子生物學(xué)學(xué)鑒定

取待鑒定菌絲體，液氮研磨后用TaKaRa生物有限公司生產(chǎn)的Ezup柱式真菌基因組DNA抽提試劑盒進(jìn)行DNA基因組的提取，DNA溶液于-20℃保存?zhèn)溆谩２捎蒙虾Ｉど锕こ碳夹g(shù)公司合成的通用引物ITS1和ITS4，參照參考文獻(xiàn)[18]進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR產(chǎn)物檢測(cè)后送昆明碩擎生物科技有限公司進(jìn)行測(cè)序。所得ITS序列與GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中已知的相關(guān)序列進(jìn)行同源性比較，用MEGA 6.0軟件采用鄰接法NJ（Neighbor-joining） 構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。

1.2.4 碳源對(duì)菌株生長(zhǎng)的影響試驗(yàn)

以加20 g葡萄糖的PDA基礎(chǔ)培養(yǎng)基為對(duì)照，其他處理分別用等量的麥芽糖、乳糖、蔗糖、甘油、果糖、可溶性淀粉替代葡萄糖作為碳源。用已滅菌的直徑5 mm打孔器均勻截取活化好的菌絲塊接種，常溫培養(yǎng)，每個(gè)處理均設(shè)3個(gè)重復(fù)。

1.2.5 氮源對(duì)菌株生長(zhǎng)的影響試驗(yàn)

在PDA基礎(chǔ)培養(yǎng)基中分別加入2 g的蛋白胨、酵母粉、尿素、氯化銨、酒石酸銨、過(guò)硫酸銨、玉米粉作為氮源。其余操作同1.2.4。

1.2.6 粉被蟲(chóng)草出菇培養(yǎng)

挑取一定量的菌絲接入PDA液體綜合培養(yǎng)基，在25℃震蕩培養(yǎng)7 d，得到液體菌種。然后取10 mL液體菌種分別接入大米和小麥培養(yǎng)基，每個(gè)處理設(shè)10個(gè)重復(fù)。25℃黑暗培養(yǎng)，菌絲長(zhǎng)滿(mǎn)培養(yǎng)基表面后進(jìn)行光照培養(yǎng)。觀(guān)察記錄子實(shí)體出菇情況。

1.3 生長(zhǎng)速度測(cè)定

采用“十”字交叉法測(cè)定菌落直徑，記錄各菌株生長(zhǎng)情況，計(jì)算菌絲體每天平均生長(zhǎng)速度。

菌絲體生長(zhǎng)速度（V，mm·d-1）的計(jì)算公式為：

V=S/D

式中：S為菌絲長(zhǎng)度（mm）；D為菌絲生長(zhǎng)天數(shù)（d）。

1.4 數(shù)據(jù)分析

數(shù)據(jù)采用DPS軟件進(jìn)行差異顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 野生子實(shí)體和菌絲體的鑒定

子實(shí)體形態(tài)特征見(jiàn)圖1。

圖1 粉被蟲(chóng)草有性型Fig.1 The teleomorph of Cordyceps pruinosa

如圖1所示，野生子實(shí)體（圖1A）子座出自昆蟲(chóng)蛹繭殼上，多個(gè)，長(zhǎng)度為3 cm～5 cm；柄稍彎曲，基部有白色菌絲體；頭部棒狀，頂端尖，橘紅色；子囊殼（圖1B） 表生，長(zhǎng)卵圓形；子囊柱狀（圖1C），囊孢子比子囊稍短，線(xiàn)形，可斷裂形成分孢子。上述特征符合粉被蟲(chóng)草的特征描述，初步確定其為粉被蟲(chóng)草。

將反復(fù)純化培養(yǎng)獲得的菌株命名為ZJJZ494，保存于中華全國(guó)供銷(xiāo)合作總社昆明食用菌研究所。菌株形態(tài)特征見(jiàn)圖2。

圖2 粉被蟲(chóng)草無(wú)性型菌株形態(tài)Fig.2 The characteristics and microscopic features of Cordyceps pruinosa

如圖2所示，菌株ZJJZ494在察氏培養(yǎng)基上菌落平展呈絨毛狀有輪紋，培養(yǎng)初期（圖2A），菌落中心呈白色、略微突起，中間為橘黃色至黃色，最邊緣呈白色；培養(yǎng)較長(zhǎng)時(shí)間后，菌落邊緣呈白色，中間部分全為橘黃色至黃色；形成指狀可分叉的孢梗束。分生孢子梗單生、對(duì)生或輪狀分枝。產(chǎn)孢細(xì)胞瘦長(zhǎng)錐形，分生孢子透明、光滑，卵圓形或柱狀（圖2B），典型的疊瓦狀排列。上述特征與粉被蟲(chóng)草的無(wú)性型粉被瑪利亞霉的描述一致，因此可以鑒定該菌株為粉被瑪利亞霉。

2.2 菌絲體分子生物學(xué)分析結(jié)果

對(duì)測(cè)序后得到的菌株ZJJZ494菌絲體的ITS序列進(jìn)行BLAST比對(duì)。結(jié)果表明，菌株ZJJZ494的ITS序列與 GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中登錄號(hào)為 MT012347、AY491995等多個(gè)粉被蟲(chóng)草菌株的同源性都達(dá)99%以上。以GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)內(nèi)下載的多條相似序列作為參考序列，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，見(jiàn)圖3。

圖3 基于ITS序列構(gòu)建的Neighbor-joining系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)Fig.3 Neighbor-joining phylogenetic tree based on ITS sequences

如圖3所示，菌株ZJJZ494與數(shù)據(jù)庫(kù)里的多個(gè)粉被蟲(chóng)草菌株序列聚在同一大支，表明同屬于一個(gè)種。結(jié)合子實(shí)體形態(tài)鑒定結(jié)果，將蟲(chóng)草菌株ZJJZ494鑒定為粉被蟲(chóng)草Cordyceps pruinosa。

2.3 不同碳氮源栽培試驗(yàn)結(jié)果

不同碳源培養(yǎng)基對(duì)菌株ZJJZ494菌絲生長(zhǎng)速度的影響見(jiàn)圖4。

由圖4可知，菌株ZJJZ494菌絲體在乳糖為碳源的培養(yǎng)基中日均生長(zhǎng)速度最快，為2.48 mm·d-1；其次是在葡萄糖的培養(yǎng)基中，菌絲體日均生長(zhǎng)速度為2.46 mm·d-1；之后依次是果糖、甘油、可溶性淀粉、蔗糖、麥芽糖；生長(zhǎng)速度最慢的是麥芽糖培養(yǎng)基，為2.05 mm·d-1。菌株ZJJZ494菌絲在不同碳源培養(yǎng)基上的日均長(zhǎng)速存在差異，其菌落顏色也有差異，見(jiàn)圖5。

圖4 不同碳源對(duì)菌株ZJJZ494菌絲體生長(zhǎng)速度的影響Fig.4 Mycelial growth speed of strain ZJJZ494 on media with different carbon sources

圖5 不同碳源培養(yǎng)基上菌株ZJJZ494的菌落形態(tài)特征Fig.5 Colony characteristics of strain ZJJZ494 on media with different carbon sources

如圖5所示，菌株ZJJZ494菌落邊緣多呈白色，中間顏色由淺黃色到橙黃色不等。菌絲體在蔗糖培養(yǎng)基上的氣生菌絲最短，但顏色最深；菌絲在麥芽糖培養(yǎng)基上日均生長(zhǎng)速度最慢，但其菌絲體的濃密度和長(zhǎng)度要比果糖、甘油、可溶性淀粉、蔗糖上的菌絲好。說(shuō)明碳源是菌絲生長(zhǎng)的重要營(yíng)養(yǎng)成分，菌株ZJJZ494菌絲體對(duì)不同碳源的利用能力不同。綜合菌株ZJJZ494菌絲的生長(zhǎng)速度和長(zhǎng)勢(shì)，確定其菌絲培養(yǎng)最適的碳源為乳糖和葡萄糖。

不同氮源培養(yǎng)基對(duì)菌株ZJJZ494菌絲生長(zhǎng)速度的影響見(jiàn)圖6。

由圖6可看出，菌株ZJJZ494菌絲在不同氮源培養(yǎng)基上長(zhǎng)勢(shì)有差異。氮源為過(guò)硫酸銨培養(yǎng)基中菌絲的長(zhǎng)速最快，為2.81 mm·d-1，其次為尿素、玉米粉、氯化銨、酒石酸銨、酵母粉、蛋白胨。菌落形態(tài)特征見(jiàn)圖7。

圖6 不同氮源對(duì)菌株ZJJZ494菌絲體生長(zhǎng)速度的影響Fig.6 Mycelial growth speed of strain ZJJZ494 on media with different nitrogen sources

圖7 不同氮源培養(yǎng)基上菌珠ZJJZ494的菌落形態(tài)特征Fig.7 Colony characteristics of strain ZJJZ494 on media with different nitrogen sources

由圖7可以看出，菌株ZJJZ494菌絲在不同的氮源培養(yǎng)基上菌落顏色和形態(tài)也有差異，相同培養(yǎng)條件下菌株ZJJZ494菌絲體在酒石酸銨培養(yǎng)基上顏色最深，在蛋白胨培養(yǎng)基上顏色偏白色。菌絲體在蛋白胨和酵母粉培養(yǎng)上的日均生長(zhǎng)速度雖然較低，但在這2種培養(yǎng)基上菌絲長(zhǎng)勢(shì)都很濃密。說(shuō)明菌株ZJJZ494菌絲對(duì)不同氮源的利用率也不同。綜合菌株ZJJZ494菌絲生長(zhǎng)速度和長(zhǎng)勢(shì)，確定菌株ZJJZ494菌絲生長(zhǎng)的最適氮源為過(guò)硫酸銨。

2.4 粉被蟲(chóng)草出菇培養(yǎng)試驗(yàn)結(jié)果

用小麥和大米培養(yǎng)基進(jìn)行粉被蟲(chóng)草的出菇培養(yǎng)。在接種后45 d，2種培養(yǎng)基上均能獲得粉被蟲(chóng)草子實(shí)體。其中小麥培養(yǎng)基上收獲的子實(shí)體平均單瓶?jī)糁貫?.44 g，生物學(xué)效率為8.88%；大米培養(yǎng)基上收獲的子實(shí)體平均單瓶?jī)糁貫?.45 g，生物學(xué)效率為8.89%，說(shuō)明粉被蟲(chóng)草在2種培養(yǎng)基上的產(chǎn)量無(wú)明顯差異。但2種培養(yǎng)基上長(zhǎng)出的子實(shí)體形態(tài)和顏色有差異，見(jiàn)圖8。

圖8 菌株ZJJZ494在2種培養(yǎng)基上的出菇情況Fig.8 Fruiting situstion of strain ZJJZ494 on the two media

如圖8所示，小麥培養(yǎng)基上子實(shí)體整體顏色為深橙紅色，指狀孢梗束頂端分枝細(xì)而多（圖8W）；在大米培養(yǎng)基上子實(shí)體呈淡橙色，指狀孢梗束頂端分枝粗而少且為橙黃色（圖8R）。說(shuō)明在相同的培養(yǎng)條件下，培養(yǎng)基的成分能影響子實(shí)體的形態(tài)和顏色。

3 結(jié)論與討論

蟲(chóng)草是極具經(jīng)濟(jì)價(jià)值且待開(kāi)發(fā)的醫(yī)藥寶藏，自然界中蟲(chóng)草種類(lèi)繁多，作為世界上生物多樣性豐富的12個(gè)國(guó)家之一，我國(guó)更是具有豐富和獨(dú)特的蟲(chóng)草資源[19]。冬蟲(chóng)夏草是蟲(chóng)草中的極品，具有巨大的市場(chǎng)需求，但其野生資源非常稀缺，已被列為中國(guó)二級(jí)保護(hù)物種，2020年國(guó)際自然保護(hù)聯(lián)盟（IUCN）將冬蟲(chóng)夏草的受威脅等級(jí)也定為易危[2，20]。因此，冬蟲(chóng)夏草代用品的開(kāi)發(fā)成為必然趨勢(shì)。無(wú)論是科學(xué)研究，還是培養(yǎng)、生產(chǎn)蟲(chóng)草用于醫(yī)藥、食品、真菌殺蟲(chóng)劑及其他領(lǐng)域，都要依賴(lài)于蟲(chóng)草的無(wú)性型菌株制作菌種；分離的菌株是否為形成蟲(chóng)草的真菌，是研究和利用蟲(chóng)草的核心問(wèn)題，具有十分重要的學(xué)術(shù)意義和應(yīng)用價(jià)值[3，21]。粉被蟲(chóng)草作為民間藥用較廣的蟲(chóng)草，因與冬蟲(chóng)夏草具有多種相同成分逐漸受到人們的重視。云南是蟲(chóng)草物種多樣性分布的重要地區(qū)之一，但關(guān)于蟲(chóng)草種質(zhì)資源分離培養(yǎng)研究的報(bào)道極少，因此，急需立足本土資源優(yōu)勢(shì)，開(kāi)發(fā)選育可人工栽培的優(yōu)質(zhì)蟲(chóng)草種質(zhì)。

本研究通過(guò)利用形態(tài)學(xué)觀(guān)察和分子生物學(xué)鑒定相結(jié)合的方法，以及其有性型與無(wú)性型之間的對(duì)應(yīng)關(guān)系，確定在昆明西山采集的蟲(chóng)草確為粉被蟲(chóng)草Cordyceps pruinosa，且分離得到其無(wú)性型菌種粉被瑪利亞霉Mariannaea pruinosa。前人研究表明，粉被蟲(chóng)草與雙節(jié)棍植生蟲(chóng)草（Cordyceps ninchukispora）不僅在形態(tài)上極為相似，兩者還具有極近的親緣關(guān)系，不同之處在于粉被蟲(chóng)草寄生于昆蟲(chóng)上，而C.ninchukispora寄生于植物種子上[22]。本研究中，在NCBI進(jìn)行序列比對(duì)時(shí)，供試菌株序列與數(shù)據(jù)庫(kù)中C.ninchukispora的多條序列相識(shí)度也達(dá)到99%以上，因此在鑒定粉被蟲(chóng)草時(shí)需要有性型、無(wú)性型形態(tài)特征結(jié)合分子生物學(xué)手段鑒定。

對(duì)無(wú)性型菌株ZJJZ494進(jìn)行碳源、氮源的培養(yǎng)試驗(yàn)表明：ZJJZ494菌絲體培養(yǎng)最適的碳源為乳糖和葡萄糖，最適氮源為過(guò)硫酸銨。用小麥和大米培養(yǎng)基進(jìn)行粉被蟲(chóng)草的出菇培養(yǎng)，粉被蟲(chóng)草在2種培養(yǎng)基上的產(chǎn)量無(wú)顯著差異：在小麥培養(yǎng)基栽培的生物學(xué)效率為8.88%，大米培養(yǎng)基栽培的生物學(xué)效率為8.89%，但2種培養(yǎng)基上長(zhǎng)出的子實(shí)體形態(tài)和顏色有差異。不同培養(yǎng)基上菌絲體和子實(shí)體顏色均有差異，可能是粉被蟲(chóng)草色素的合成與培養(yǎng)基營(yíng)養(yǎng)也有關(guān)，還需進(jìn)行進(jìn)一步的研究。

王小董[23]的研究表明粉被蟲(chóng)草菌絲體甲醇粗提物中的天然色素物質(zhì)并非單一的化合物，而是多種黃色色素的混合物。野外采集的粉被蟲(chóng)草和人工栽培的粉被蟲(chóng)草均有鮮艷的顏色，后期可考慮對(duì)其色素進(jìn)行進(jìn)一步的研究。天然色素化合物可從顏色鮮艷的蟲(chóng)生真菌中篩選分離，不僅能解決天然色素來(lái)源問(wèn)題，還可以開(kāi)發(fā)一些具有特殊功效的食品色素添加劑。如果能從粉被蟲(chóng)草中篩選出有較好開(kāi)發(fā)前景的色素高產(chǎn)菌株，并將其應(yīng)用于生產(chǎn)生活之中，將具有很大的社會(huì)效益和經(jīng)濟(jì)效益。

何亞瓊等[24]的研究表明，人工培養(yǎng)的粉被蟲(chóng)草菌絲體和孢梗束代謝組差異顯著：粉被蟲(chóng)草菌絲體代謝物中磷脂類(lèi)、肽類(lèi)、氨基酸、脂肪酸和糖類(lèi)等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)較多，菌絲可能具有較高營(yíng)養(yǎng)價(jià)值；孢梗束代謝物中生物堿類(lèi)、核苷類(lèi)、萜類(lèi)、酮類(lèi)、酸酐等活性物質(zhì)含量較高，孢梗束具有較大的藥用價(jià)值。本研究?jī)H對(duì)粉被蟲(chóng)草的菌絲體和馴化栽培進(jìn)行了初步研究，未進(jìn)行蟲(chóng)草菌絲體和孢梗束成分的相關(guān)研究，后期值得對(duì)這兩部分的藥效考察和應(yīng)用研究做進(jìn)一步的研究。