周椿富,于銳,王翔,闖紹闖,楊洪杏,謝越
安徽科技學(xué)院資源與環(huán)境院,安徽 鳳陽(yáng) 233100
抗生素是由某些微生物產(chǎn)生或通過(guò)人工合成的,能夠起到抑制微生物和其他細(xì)胞增殖作用的一類化學(xué)物質(zhì)(顧覺(jué)奮,2002;劉文英,2003)。由于可以促進(jìn)動(dòng)物生長(zhǎng)和預(yù)防疾?。˙aran et al.,2011;Liao et al.,2016),故作為飼料添加劑在畜禽養(yǎng)殖行業(yè)中廣泛應(yīng)用,全球每年抗生素使用量約為10—20萬(wàn)噸,其中70%用于畜牧業(yè)(Van et al.,2015;Qian et al.,2017;陳俊輝,2010;隋倩雯等,2015)。經(jīng)人體或動(dòng)物攝入的抗生素中 85%會(huì)以原形或代謝產(chǎn)物的形式排入環(huán)境且仍具有生物活性,并能轉(zhuǎn)化形成代謝物母體(Amorim et al.,2014;Topal et al.,2016;王冉等,2006)。土霉素(Oxytetracycline,OTC)等四環(huán)素類、恩諾沙星(Enrofloxacin,ENR)等第三代氟喹諾酮類、磺胺二甲嘧啶(Sulfamethazine,SM2)等磺胺類藥物因其具有廣譜高效的特點(diǎn),當(dāng)前在我國(guó)生產(chǎn)量最大,使用量最多,在畜禽養(yǎng)殖行業(yè)中廣泛應(yīng)用(Yang et al.,2010;杜黎明等,2006;金彩霞等,2010;魏子艷等,2014),其在使用中產(chǎn)生的環(huán)境問(wèn)題也備受關(guān)注。當(dāng)前抗生素濫用造成嚴(yán)重的環(huán)境問(wèn)題,土壤和水體中均檢測(cè)到大量抗生素殘留,其帶來(lái)的環(huán)境污染問(wèn)題已成為研究熱點(diǎn)(Zhu et al.,2013;Qin et al.,2019)。
土壤酶是土壤的重要成分,參與土壤中所有復(fù)雜的生化過(guò)程,對(duì)土壤中營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)轉(zhuǎn)化、養(yǎng)分固定與釋放起關(guān)鍵作用,與土壤供肥能力緊密相關(guān),是目前評(píng)價(jià)土壤肥力的重要指標(biāo)(劉超等,2019;陸琴等,2020)。張昊等(2012)在土霉素暴露對(duì)小麥根際抗生素抗性細(xì)菌及土壤酶活性的影響研究中發(fā)現(xiàn),土壤磷酸酶、脫氫酶等活性在土霉素暴露環(huán)境中均有所下降。金蘭淑等(2013)研究表明,不同濃度四環(huán)素對(duì)土壤脲酶和土壤磷酸酶活性影響表現(xiàn)出差異,低濃度四環(huán)素促進(jìn)土壤兩種酶活性,高濃度四環(huán)素抑制兩種土壤酶活性。閆賽紅(2015)在研究中發(fā)現(xiàn),恩諾沙星單一污染在第14天對(duì)蔗糖酶活性具有促進(jìn)作用,而第7、21、28天表現(xiàn)為抑制作用。張晨等(2018)研究了典型磺胺類抗生素對(duì)土壤酶活性的影響,結(jié)果表明磺胺甲惡唑和磺胺甲基嘧啶對(duì)土壤脫氫酶和過(guò)氧化氫酶活性產(chǎn)生抑制作用,而磺胺甲基嘧啶和磺胺噻唑?qū)ν寥烂摎涿讣斑^(guò)氧化氫酶活性呈現(xiàn)誘導(dǎo)作用。然而,目前抗生素在不同類型土壤中對(duì)土壤酶活性的影響尚未見(jiàn)報(bào)道。通過(guò)開(kāi)展抗生素對(duì)酸性、中性和堿性土壤中土壤酶活影響的研究,分析抗生素對(duì)土壤酶活性的影響,明確抗生素與土壤酶兩者間的關(guān)系。
因此,本研究以酸性、中性和堿性土壤為研究對(duì)象,通過(guò)添加土霉素、恩諾沙星和磺胺二甲嘧啶進(jìn)行處理,分析土壤中脲酶、過(guò)氧化氫酶和磷酸酶活性的變化情況,旨在揭示在抗生素殘留背景下農(nóng)田土壤的生態(tài)系統(tǒng)功能穩(wěn)定性,以期為抗生素污染農(nóng)田土壤的恢復(fù)工作提供數(shù)據(jù)支持和科學(xué)依據(jù)。
實(shí)驗(yàn)土壤取自安徽省黃山市黃山區(qū)湯口鎮(zhèn)農(nóng)田(30°07′N,118°18′E,pH 為 5.8),安徽省滁州市鳳陽(yáng)縣安徽科技學(xué)院九華山試驗(yàn)田(32°87′N,117°57′E,pH為7.1),安徽省滁州市鳳陽(yáng)縣黃灣村水稻田(32°98′N,117°72′E,pH 為 7.6)。以五點(diǎn)取樣法采集距地表5—15 cm處土壤,在陰涼處風(fēng)干后研磨過(guò)0.425 mm篩。
試驗(yàn)設(shè)不同pH土壤(Ac:酸性、Ne:中性、Al:堿性),分別添加不同抗生素(CK:不添加抗生素、OTC:添加土霉素、ENR:添加恩諾沙星、SM2:添加磺胺二甲嘧啶),抗生素添加量見(jiàn)表1,共12個(gè)處理,每個(gè)處理3次重復(fù)。分別將500 g供試土樣分裝至盆缽中,每盆土樣添加抗生素后用蒸餾水完全潤(rùn)濕并混勻,置于恒溫箱中培養(yǎng)28 d,培養(yǎng)期間保持土壤濕潤(rùn),采集0、7、14、21、28 d樣品于負(fù)20 ℃保存,用于檢測(cè)分析。
表1 不同土壤處理下的抗生素添加量Table 1 Antibiotic addition under different soil treatments
各土壤酶活性參照關(guān)松蔭(1986)方法測(cè)定,脲酶活性采用苯酚鈉次氯酸鈉比色法測(cè)定,將10 g土樣與2 mL甲苯混合靜止15 min,加10 mL尿素溶液和20 mL檸檬酸鹽緩沖液混勻,37 ℃培養(yǎng)24 h后定容至100 mL,取1 mL濾液顯色后在578 nm下比色,最終以 g·kg-1(37 ℃,24 h)表示。磷酸酶活性采用磷酸苯二鈉比色法,將1 g土樣加入50 mL錐形瓶中,添加0.2 mL甲苯、4 mL緩沖液、1 mL 0.05 moL·L-1對(duì)硝基苯磷酸二鈉溶液,混勻后37 ℃下培養(yǎng)1 h,顯色后在410 nm下比色,最終以g·kg-1(37 ℃,24 h)表示。過(guò)氧化氫酶活性采用高錳酸鉀滴定法測(cè)定,將3 g土樣加入150 mL錐形瓶中,添加40 mL蒸餾水和5 mL的0.3% H2O2混勻,震蕩20 min后添加5 mL的3.0 mol·L-1H2SO4,過(guò)濾后取25 mL濾液用0.1 mol·L-1KMnO4滴定至淡粉紅色,最終過(guò)氧化氫酶活性由單位干土消耗的 0.1 mol·L-1KMnO4含量計(jì),以 g·kg-1(37 ℃,20 min)表示。
實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)應(yīng)用Microsoft Excel 2010軟件計(jì)算平均值及標(biāo)準(zhǔn)偏差,應(yīng)用SPSS 22.0軟件進(jìn)行單因素方差分析(one-way ANOVA)和Duncan氏多重比較檢驗(yàn),應(yīng)用Origin 2022軟件進(jìn)行圖件繪制。
施加抗生素對(duì)酸性土壤中土壤酶活性的影響如圖 1。各試驗(yàn)組酸性土壤中脲酶活性較對(duì)照組均顯著受到抑制,其中 SM2對(duì)酸性土壤中脲酶活性抑制程度最高,與對(duì)照組相比OTC、ENR和SM2對(duì)脲酶活性最高抑制率分別達(dá) 38.03%、74.31%和84.13%(圖1a)。添加OTC對(duì)酸性土壤中過(guò)氧化氫酶活性有先抑制后促進(jìn)的作用,最高抑制率和促進(jìn)率分別為41.43%和222.99%,添加ENR和SM2對(duì)酸性土壤中過(guò)氧化氫酶活性具有顯著促進(jìn)作用,最高促進(jìn)率分別為24.88%和268.25%(圖1b)。添加OTC對(duì)酸性土壤中磷酸酶活性具有先抑制后促進(jìn)的作用,最高抑制率和促進(jìn)率分別為 37.90%和71.63%;添加 ENR、SM2后對(duì)土壤中磷酸酶活性具有顯著促進(jìn)作用,最高促進(jìn)率分別為 43.72%和51.21%,但分別在21 d和7 d后促進(jìn)效果減弱并逐步抑制,其中添加ENR第28天磷酸酶活性與對(duì)照組基本持平,而添加SM2第21天后磷酸酶活性顯著降低,最大抑制率為76.28%(圖1c)。
圖1 抗生素對(duì)酸性土壤中酶活性的影響Figure 1 Effect of antibiotics on enzyme activity in acid soil
施加抗生素對(duì)中性土壤中土壤酶活性的影響如圖2。中性土壤添加OTC、ENR和SM2與對(duì)照組相比,均顯著抑制中性土壤中脲酶活性,最高抑制率分別為 70.88%、73.70%和 76.96%(圖 2a)。然而對(duì)過(guò)氧化氫酶活性均起到顯著促進(jìn)效果,最高促進(jìn)率分別為73.13%、51.05%和124.09%,但添加ENR對(duì)于過(guò)氧化氫酶活性的促進(jìn)作用呈先增強(qiáng)后逐漸減弱趨勢(shì),第 28天時(shí)過(guò)氧化氫酶活性低于對(duì)照組(圖2b)。中性土壤中添加OTC和ENR對(duì)土壤中磷酸酶活性均產(chǎn)生先抑制后促進(jìn)的效果,其中添加OTC后,磷酸酶活性在0—14 d內(nèi)顯著降低,且在第14天抑制效果最明顯,抑制率為48.74%,之后活性逐漸上升并顯著高于對(duì)照組,并在28 d促進(jìn)程度最高,促進(jìn)率為101.26%;添加ENR后,對(duì)磷酸酶在0—7 d內(nèi)顯著降低,7—21 d內(nèi)顯著增高,21 d后逐漸趨于一致,最高抑制和促進(jìn)率分別為5.78%和17.26%;添加SM2后磷酸酶活性較對(duì)照組具有先促進(jìn)后抑制的效果,在0—14 d內(nèi)顯著提升,14 d后促進(jìn)程度逐漸減弱,抑制效果加強(qiáng),21—28 d磷酸酶活性顯著低于對(duì)照組,該組最大促進(jìn)率和抑制率分別為33.24%和65.15%(圖2c)。
圖2 抗生素對(duì)中性土壤中酶活性的影響Figure 2 Effect of antibiotics on enzyme activity in neutral soil
施加抗生素對(duì)堿性土壤中土壤酶活性的影響如圖3。添加OTC與對(duì)照組相比對(duì)脲酶活性具有先抑制后促進(jìn)效果,添加OTC后的0—14 d內(nèi)脲酶活性受到顯著抑制,抑制率達(dá)56.48%,14 d后抑制效果逐漸減弱,21—28 d脲酶活性顯著上升并在28 d達(dá)到最高,最高促進(jìn)率為28.43%;添加ENR和SM2對(duì)堿性土壤中脲酶活性均具有顯著抑制作用,且抑制效果隨時(shí)間推移逐漸增強(qiáng),在第28 d抑制程度最高,抑制率分別為55.88%和96.08%(圖3a)。添加OTC、ENR和SM2對(duì)過(guò)氧化氫酶活性均具有促進(jìn)作用,其中添加OTC和SM2后對(duì)土壤中過(guò)氧化氫酶活性促進(jìn)作用較對(duì)照組相比持續(xù)顯著提高,第28天促進(jìn)程度最高,最高促進(jìn)率分別為 92.04%和102.17%,而添加ENR后促進(jìn)效果隨培養(yǎng)時(shí)間先上升后下降,最高促進(jìn)率為46.73%,在第28天過(guò)氧化氫酶活性顯著低于對(duì)照組(圖3b)。添加OTC對(duì)磷酸酶活性具有先抑制后促進(jìn)的作用,添加 OTC后0—14 d內(nèi)磷酸酶活性顯著降低,14 d后抑制效果逐漸減弱,磷酸酶活性逐漸增強(qiáng),21—28 d磷酸酶活性顯著高于對(duì)照組,但21 d后促進(jìn)效果減弱,該組最高促進(jìn)率和抑制率分別為 205.93%和86.62%;添加ENR和SM2對(duì)磷酸酶活性均具有先促進(jìn)后抑制的作用,其中添加ENR后磷酸酶活性在0—21 d內(nèi)顯著提升,最高促進(jìn)率為65.19%,但21 d后促進(jìn)效果減弱;添加SM2對(duì)磷酸酶活性在0—7 d內(nèi)具有顯著促進(jìn)作用,7 d后促進(jìn)效果減弱,抑制程度加深,21 d后磷酸酶活性顯著低于對(duì)照組,最高促進(jìn)率和抑制率分別為 35.22%和73.33%(圖3c)。
圖3 抗生素對(duì)堿性土壤中酶活性的影響Figure 3 Effect of antibiotics on enzyme activity in alkaline soil
土壤酶作為土壤生物化學(xué)特征的主要成分,以“催化劑”的作用參與到土壤中各種物質(zhì)交換和能量流動(dòng)過(guò)程(Jabborova et al.,2021)。有研究表明,土壤中的脲酶能夠影響土壤的供氮水平;過(guò)氧化氫酶能夠影響腐殖質(zhì)的分解與合成及化合物氧化速率,并對(duì)土壤中有害物質(zhì)也具有分解作用;磷酸酶能夠通過(guò)酶促反應(yīng)分解土壤中難溶性有機(jī)磷從而提升土壤中有效磷含量(Ma et al.,2020;Chen et al.,2021;Siwach et al.,2021)。因此,土壤酶活性在土壤肥力的改變中起到重要作用。本研究中,抗生素對(duì)土壤中土壤酶活性的影響與抗生素的類型、土壤的類型及暴露時(shí)間都有著密切關(guān)系。已有資料表明,抗生素的類型、土壤的類型及暴露時(shí)間均會(huì)對(duì)土壤酶活性產(chǎn)生影響(Zhang et al.,2013)。
本研究發(fā)現(xiàn),3種抗生素對(duì)不同土壤中脲酶活性均有明顯的抑制作用,這可能是抗生素的毒害作用導(dǎo)致土壤微生物的死亡,從而導(dǎo)致脲酶活性受到抑制。其中,OTC能夠通過(guò)特異性地與糖體30S亞基中A點(diǎn)位結(jié)合,阻止氨基酰-tRNA在該位點(diǎn)上的聯(lián)結(jié),影響蛋白質(zhì)的合成,從而致死微生物;ENR能夠作用于細(xì)菌遺傳物質(zhì)核酸、DNA螺旋酶的 A亞單位,通過(guò)影響酶的正常功能抑制DNA合成與復(fù)制,使細(xì)胞不再分裂導(dǎo)致微生物的死亡;磺胺類藥物與氨基苯甲酸(PABA)具有類似結(jié)構(gòu),二者產(chǎn)生競(jìng)爭(zhēng)關(guān)系影響微生物細(xì)胞內(nèi)二氫葉酸合成酶,進(jìn)而抑制四氫葉酸的含量并抑制微生物的增殖(徐東峰,2000;程章,2009)。因此認(rèn)為這 3種抗生素會(huì)通過(guò)影響土壤中相關(guān)微生物活性,最終導(dǎo)致脲酶活性的降低。通過(guò)比較OTC在不同土壤pH下對(duì)脲酶的影響趨勢(shì)發(fā)現(xiàn),在培養(yǎng)周期內(nèi),OTC在酸性與中性土壤中可以持續(xù)抑制脲酶活性,而在堿性土壤中呈現(xiàn)出先抑制后解除的變化趨勢(shì)。而這一現(xiàn)象的可能原因是 OTC在酸性與中性土壤中的穩(wěn)定性更高,而在堿性土壤中容易降解(范菲菲等,2013)。張書(shū)菡(2019)在抗生素抑制土壤脲酶的毒性效應(yīng)與機(jī)制的研究中發(fā)現(xiàn),四環(huán)素類、β-內(nèi)酰胺類等抗生素對(duì)土壤中脲酶活性均有很強(qiáng)的抑制作用,與本研究結(jié)果一致。Lahr et al.(2005)研究表明,土霉素等抗生素對(duì)土壤微生物呼吸具有抑制作用,而呼吸作用反映微生物總活性,微生物活性的降低會(huì)導(dǎo)致酶活的減弱,也從側(cè)面驗(yàn)證了本研究結(jié)果。
本研究發(fā)現(xiàn),3種抗生素對(duì)不同土壤中過(guò)氧化氫酶活性均有明顯的促進(jìn)作用。當(dāng)土壤微生物受到抗生素毒害時(shí)會(huì)產(chǎn)生脅迫作用,需要分泌更多過(guò)氧化氫酶來(lái)抵抗土霉素毒害(劉莉莉等,2008)。張文婕等(2020)研究結(jié)果表明,施加中低濃度的恩諾沙星土壤中的過(guò)氧化氫酶具有相對(duì)明顯的激活作用,這與本研究結(jié)果相一致。吳杰等(2019)的研究結(jié)果表明,磺胺二甲嘧啶對(duì)微生物群落有激活作用,可能正是這種激活作用促進(jìn)微生物對(duì)過(guò)氧化氫酶的分泌,使得過(guò)氧化氫酶活性呈不斷提高的結(jié)果。此外,還有研究結(jié)果顯示,土壤中的有機(jī)質(zhì)對(duì)于土壤酶本身具有一定的保護(hù)作用(汪杏等,2016),并且土壤對(duì)于抗生素具有一定的吸附緩沖效果,從而造成了抗生素對(duì)于土壤酶的毒害作用得到緩解的現(xiàn)象,并結(jié)合微生物受到抗生素毒害所產(chǎn)生的脅迫作用,最終表現(xiàn)出對(duì)于過(guò)氧化氫酶活性的促進(jìn)作用。
本研究發(fā)現(xiàn),3種抗生素對(duì)不同土壤中磷酸酶活性的影響情況較為復(fù)雜,其中 OTC對(duì)于不同土壤中磷酸酶活性均呈現(xiàn)先抑制后促進(jìn)的作用,ENR對(duì)酸性、堿性土壤中磷酸酶活性呈現(xiàn)先促進(jìn)后抑制的作用而對(duì)中性土壤中磷酸酶活性呈現(xiàn)先抑制后促進(jìn)的作用,SM2對(duì)不同土壤中磷酸酶活性均呈現(xiàn)先促進(jìn)后抑制的作用。其造成不同抗生素、不同土壤環(huán)境中磷酸酶活性變化差異的主要原因,可能是抗生素毒害作用和微生物由此產(chǎn)生的脅迫作用共同影響導(dǎo)致的。陳智學(xué)(2013)進(jìn)行了土霉素對(duì)酶活性及微生物群落代謝影響的研究,其結(jié)果表明,受土霉素影響后磷酸酶活性處于先降后升再降的變化趨勢(shì),與本研究結(jié)果一致。毛書(shū)帥(2016)研究結(jié)果也表明,單獨(dú)施加恩諾沙星7 d后對(duì)土壤磷酸酶活性具有激活作用。Liu et al.(2009)研究結(jié)果表明,磺胺二甲嘧啶對(duì)磷酸酶有顯著影響,且楊玖(2014)研究結(jié)果也表明,磺胺二甲嘧啶對(duì)磷酸酶活性會(huì)產(chǎn)生顯著的抑制作用,試驗(yàn)結(jié)果均與本試驗(yàn)結(jié)果一致。
由于土壤性質(zhì)的不同,抗生素在不同土壤中的吸附、解吸、遷移轉(zhuǎn)化也會(huì)存在差異。鮑艷宇(2008)研究發(fā)現(xiàn),四環(huán)素類抗生素在不同土壤中都是物理吸附,但在不同土壤中的解吸具有一定程度的滯后性和差異性。本研究中,酸性和中性土壤中添加OTC后,脲酶活性持續(xù)受到抑制,而堿性土壤中添加 OTC則出現(xiàn)先抑制后促進(jìn)的現(xiàn)象,可能是由于不同酸堿度土壤對(duì)于OTC的吸附所存在的差異性,同樣的差異性也體現(xiàn)在酸性土壤中添加 OTC后過(guò)氧化氫酶活性變化與中、堿性土壤中添加 OTC的不同。李鑫(2015)在四環(huán)素類抗生素在不同質(zhì)地土壤中的遷移模擬研究中發(fā)現(xiàn),不同質(zhì)地土壤對(duì)四環(huán)素和土霉素的吸附存在快速吸附過(guò)程和慢速平衡過(guò)程的不同,四環(huán)素和土霉素在砂土中具有明顯的遷移效果。本研究中,3種不同抗生素添加到 3種土壤中,磷酸酶活性變化情況出現(xiàn)較為明顯差異,可能是由于土壤的機(jī)械組成對(duì)抗生素的吸附和遷移產(chǎn)生了影響所導(dǎo)致的。
單一的污染物其自身的理化性質(zhì)決定了其對(duì)于土壤微生物的毒性效應(yīng),而復(fù)合污染條件下,污染物的理化性質(zhì)及污染物的濃度等眾多因素均對(duì)其最終毒性效應(yīng)產(chǎn)生同等重要的作用。張晨等(2018)通過(guò)典型磺胺類抗生素對(duì)土壤脫氫酶和過(guò)氧化氫酶活性的影響研究表明,復(fù)合污染物對(duì)土壤酶活性的效應(yīng)與染毒質(zhì)量比及土壤酶的種類等均相關(guān)。李凱旋(2018)在研究中發(fā)現(xiàn),三氯生和克拉霉素復(fù)合污染情況下對(duì)土壤脲酶活性表現(xiàn)為高濃度抑制效應(yīng),而對(duì)過(guò)氧化氫酶活性表現(xiàn)為低濃度抑制。復(fù)合污染物的作用機(jī)理可為競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合位點(diǎn)、影響生物酶活性等多種途徑產(chǎn)生作用(Ensenbach et al.,1997;Donnelly et al.,1998),并產(chǎn)生不同效果,但當(dāng)前對(duì)于復(fù)合抗生素污染物對(duì)土壤酶活性影響的研究還較少。本研究補(bǔ)充了抗生素殘留背景下不同類型土壤的土壤酶活變化情況,但由于影響土壤酶敏感性的生物和理化因素的復(fù)雜性,研究?jī)H分析了抗生素對(duì)酶活的相對(duì)作用,還需要進(jìn)一步的研究來(lái)確定微生物數(shù)量、活動(dòng)和群落組成變化的情況,更準(zhǔn)確的揭示抗生素影響下土壤生態(tài)系統(tǒng)功能穩(wěn)定性及其驅(qū)動(dòng)機(jī)制。
本實(shí)驗(yàn)通過(guò)采集不同土壤樣本,對(duì)土壤添加抗生素進(jìn)行試驗(yàn),研究土霉素、恩諾沙星和磺胺二甲嘧啶3種抗生素對(duì)酸性、中性和堿性土壤中土壤酶活性的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,3種抗生素處理后,農(nóng)田土壤中脲酶活性整體呈現(xiàn)抑制趨勢(shì),過(guò)氧化氫酶活性整體呈現(xiàn)促進(jìn)趨勢(shì),磷酸酶活性在不同抗生素之間存在顯著的差異性。抗生素的殘留會(huì)削弱土壤氮循環(huán)相關(guān)酶的代謝功能及穩(wěn)定性,從而減弱土壤物質(zhì)循環(huán)及土壤生態(tài)系統(tǒng)的功能穩(wěn)定性。
生態(tài)環(huán)境學(xué)報(bào)2022年11期