甘草次酸的差向異構(gòu)體對順鉑誘導(dǎo)H9c2心肌細(xì)胞損傷的保護機制

馬治，王欣爽，劉玥，魏麗萍，齊新△

隨著現(xiàn)代醫(yī)療技術(shù)的進步，癌癥患者生存期顯著延長，心血管疾病已成為癌癥患者最常見的非癌癥死亡原因［1］。化療是抗腫瘤治療的常用方法之一，但多種化療藥物引起的心臟毒性可增加癌癥患者心力衰竭的風(fēng)險［2］。鉑類化療藥物作為廣譜抗腫瘤藥物應(yīng)用廣泛，近年來其誘發(fā)的急慢性臟器毒性備受關(guān)注，研究鉑類化療藥物心臟毒性發(fā)生發(fā)展機制，對減輕鉑類化療患者心臟毒性和提出防治策略具有重要意義。中藥在改善化療藥物不良反應(yīng)方面有積極意義。甘草具有良好的抗炎、抗氧化作用，對心臟、肝臟、大腦等多個臟器具有保護作用［3］。甘草酸作為甘草中的有效活性成分，在體內(nèi)水解為甘草次酸（glycyrrhetinic acid，GA）發(fā)揮藥理作用。研究發(fā)現(xiàn)，GA能直接作用于心肌細(xì)胞發(fā)揮保護作用［4-6］。由于甘草酸18位手性碳原子的構(gòu)型不同，存在一對差向異構(gòu)體，即18α-甘草酸和18β-甘草酸，兩者經(jīng)水解后可生成相應(yīng)18α-甘草次酸（18α-GA）和18β-甘草次酸（18β-GA）［7］。兩種構(gòu)型的甘草次酸親水性不同，在體內(nèi)發(fā)揮作用效果也存在一定差異［8］。本研究應(yīng)用18α-GA和18β-GA分別對順鉑（cisplatin，CDDP）作用的H9c2心肌細(xì)胞進行干預(yù)，探究其緩解CDDP誘導(dǎo)心肌細(xì)胞損傷的保護機制。

1 材料與方法

1.1 材料H9c2心肌細(xì)胞購自武漢普諾賽生命科技有限公司；CDDP、18β-GA購自MedChem Express公司；18α-GA購自美國sigma公司；胎牛血清購自依科賽生物科技有限公司；DMEM培養(yǎng)基購自美國Gibco公司；0.25%胰酶、CCK-8試劑盒、活性氧（ROS）檢測試劑盒購自翌圣生物科技（上海）股份有限公司；Hoechst33258凋亡染色試劑盒、Mito-Tracker Red CMXRos試劑盒購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；兔抗B-淋巴細(xì)胞瘤基因-2（Bcl-2）抗體購自Affinity公司；兔抗Bcl-2相關(guān)X蛋白（Bax）、細(xì)胞色素C（Cyt-c）抗體購自武漢三鷹生物技術(shù)有限公司；兔抗剪切化胱天蛋白酶3（C-Caspase3）抗體購自美國Cell Signaling Technology公司；辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔IgG二抗購自北京博奧森生物技術(shù)有限公司；BCA蛋白定量試劑盒、SDS-PAGE凝膠試劑盒購自北京索萊寶科技有限公司；CO2培養(yǎng)箱（美國Thermo公司）；熒光倒置顯微鏡（日本Nikon公司）；Western blot電泳儀（美國Bio-Rad公司）。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)及分組

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)H9c2細(xì)胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清和1%雙抗的DMEM高糖培養(yǎng)基中，置于37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)。待H9c2心肌細(xì)胞生長至80%融合度時，將細(xì)胞以1∶3的比例進行傳代。根據(jù)細(xì)胞生長狀況，每周換液2~3次。

1.2.2 CDDP毒性濃度篩選分組對照組采用0 μmol/L的CDDP處理，其他組分別使用1、5、10、20、40、60 μmol/L的CDDP孵育24 h。藥物干預(yù)結(jié)束后，棄去舊培養(yǎng)基，加入含有10%CCK-8溶液的DMEM培養(yǎng)基孵育2 h，于酶標(biāo)儀450 nm波長處檢測吸光度。

1.2.3 18α-GA和18β-GA安全濃度篩選分組對照組采用0 μmol/L的18α-GA和18β-GA處理，其他組分別加入3.125、6.25、12.5、25、50、100 μmol/L的18α-GA和18β-GA孵育24 h。篩選18α-GA和18β-GA的安全濃度，方法同1.2.2。

1.3 CCK-8法檢測心肌細(xì)胞活力將細(xì)胞隨機分為對照組（正常培養(yǎng)細(xì)胞）、CDDP組（加入20 μmol/L CDDP）、18α-GA低劑量組（加入20 μmol/L CDDP和3.125 μmol/L 18α-GA）、18α-GA中劑量組（加入20 μmol/L CDDP和50 μmol/L 18α-GA）、18α-GA高劑量組（加入20 μmol/L CDDP和100 μmol/L 18α-GA）、18β-GA低劑量組（加入20 μmol/L CDDP和3.125 μmol/L 18β-GA）、18β-GA中劑量組（加入20 μmol/L CDDP和50 μmol/L 18β-GA）、18β-GA高劑量組（加入20 μmol/L CDDP和100 μmol/L 18β-GA），分別干預(yù)細(xì)胞24 h后進行CCK-8實驗，選定18α-GA和18β-GA濃度進行后續(xù)實驗。

1.4 Hoechst 33258染色檢測細(xì)胞凋亡將細(xì)胞隨機分為對照組（正常培養(yǎng)細(xì)胞）、CDDP組（加入20 μmol/L CDDP）、18α-GA組（加入20 μmol/L CDDP和100 μmol/L 18α-GA）、18β-GA組（加入20 μmol/L CDDP和100 μmol/L 18β-GA）。將細(xì)胞接種于六孔板內(nèi)，加入藥物干預(yù)24 h后，使用PBS溶液洗滌3遍，加入0.5 mL固定液，固定20 min，用PBS將固定液清洗干凈。加入0.5 mL Hoechst 33258染色液，搖床染色5 min，PBS洗凈染色液。使用熒光顯微鏡檢測細(xì)胞凋亡情況。

1.5 流式細(xì)胞術(shù)檢測ROS含量各組藥物干預(yù)24 h后吸棄含有藥物培養(yǎng)基，離心收集細(xì)胞，使用預(yù)冷的PBS清洗細(xì)胞。按照1∶1 000用無血清培養(yǎng)液稀釋DCFH-DA，使其終濃度為10 μmol/L。加入適當(dāng)稀釋好的探針，用無血清細(xì)胞培養(yǎng)液洗滌細(xì)胞1~2次，充分去除未進入細(xì)胞內(nèi)的DCFH-DA。于流式細(xì)胞儀上檢測細(xì)胞熒光強度。使用FlowJoVX分析實驗結(jié)果。

1.6 Mito-Tracker Red CMXRos染色檢測線粒體活性 各組進行藥物干預(yù)后，棄去細(xì)胞培養(yǎng)板中原有的培養(yǎng)液，加入配制好的Mito-Tracker Red CMXRos工作液，37℃孵育20 min。棄掉Mito-Tracker Red CMXRos工作液，加入37℃預(yù)溫的新鮮細(xì)胞培養(yǎng)液，于熒光顯微鏡下觀察熒光強度。采用Image J的MINA分析線粒體網(wǎng)絡(luò)形態(tài)。

1.7 Western blot檢測各組細(xì)胞中C-Caspase3、Bcl-2、Bax、Cyt-c蛋白表達水平 各組加入含有PMSF的RIPA裂解液，提取蛋白，BCA法測蛋白濃度。10%SDS-PAGE電泳分離蛋白，PVDF轉(zhuǎn)膜；5%脫脂牛奶室溫?fù)u床封閉2 h?？贵w孵育：封閉結(jié)束，將一抗Bcl-2（1∶1 000）、Bax（1∶2 000）、CCaspase3（1∶1 000）、Cyt-c（1∶1 000）、β-actin（1∶2 000）分別按比例進行稀釋，4℃搖床過夜。取出一抗，TBST搖床洗膜3次。加入二抗（1∶10 000）室溫?fù)u床孵育2 h，TBST搖床洗膜3次。避光條件下采用化學(xué)發(fā)光法進行顯色。采用Image J軟件進行蛋白定量分析。

1.8 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 26.0軟件進行數(shù)據(jù)分析，符合正態(tài)分布的計量資料采用±s表示。符合方差齊性檢驗，多組間比較采用單因素方差分析，多重比較采用Tukey?s檢驗；不符合方差齊性檢驗，多組間比較采用Welch檢驗，多重比較采用Dunnett?s T3檢驗。不符合正態(tài)分布的計量資料以M（P25，P75）表示，多組間比較采用Kruskal-WallisH檢驗，多重比較采用Tukey?s檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 18 α-GA及18β-GA對CDDP誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞活力的影響CCK-8結(jié)果提示，CDDP呈劑量依賴性引起心肌細(xì)胞活力降低，與0 μmol/L相比，20 μmol/L的CDDP顯著降低心肌細(xì)胞活力（P＜0.01），且細(xì)胞活力在50%左右，見圖1。與0 μmol/L相比，3.125、6.25、12.5、25、50及100 μmol/L的18α-GA和18β-GA對H9c2心肌細(xì)胞活力差異無統(tǒng)計學(xué)意義，見圖2。與CDDP組相比，18α-GA和18β-GA低劑量組細(xì)胞活力差異無統(tǒng)計學(xué)意義，18α-GA、18β-GA中劑量組和高劑量組均可改善CDDP導(dǎo)致的心肌細(xì)胞活力的降低（P＜0.01），見圖3。本研究采用20 μmol/L的CDDP、100 μmol/L的18α-GA和18β-GA進行后續(xù)實驗。

Fig.1 Effects of CDDP on viability of H9c2 cardiomyocytes圖1 CDDP對H9c2心肌細(xì)胞活力的影響

Fig.2 Effects of 18α-GA and 18β-GA on the viability of H9c2 cells圖2 18α-GA和18β-GA對H9c2心肌細(xì)胞活力的影響

Fig.3 Effects of low,medium and high doses of 18α-GA and 18β-GA on cisplatin-induced myocardial cell viability圖3 18α-GA及18β-GA低、中、高劑量對CDDP誘導(dǎo)心肌細(xì)胞活力的影響

2.2 18 α-GA及18β-GA對CDDP誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡情況影響與對照組相比，CDDP組細(xì)胞凋亡明顯，細(xì)胞數(shù)量減少，細(xì)胞核呈致密濃染且碎片狀，藍(lán)色熒光著色深；與CDDP組相比，18α-GA組和18β-GA組細(xì)胞形態(tài)規(guī)則、數(shù)量增多，且細(xì)胞核基本呈彌散、均勻的藍(lán)色熒光。見圖4。

2.3 18 α-GA及18β-GA對CDDP誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞ROS含量的影響對照組、CDDP組、18α-GA組和18β-GA組相對ROS含量分別為1.00±0.05、5.81±0.40、0.69±0.07和0.62±0.08，組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義（n=4，F(xiàn)=196.432，P＜0.01）。與對照組相比，CDDP組ROS含量增加（P＜0.01）；與CDDP組相比，18α-GA組和18β-GA組細(xì)胞內(nèi)ROS含量降低（P＜0.01）。見圖5。

2.4 18 α-GA及18β-GA對順鉑誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞線粒體活性的影響與對照組相比，CDDP組心肌細(xì)胞內(nèi)線粒體足長度和具有網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的線粒體數(shù)量明顯降低（P＜0.05）；與CDDP組相比，18α-GA組和18β-GA組線粒體足長度和具有網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的線粒體數(shù)量明顯增加（P＜0.05），見圖6、表1。

Fig.4 Effects of 18α-GA and 18β-GA on CDDP-induced apoptosis of cardiomyocytes(Hoechst staining,×400)圖4 18α-GA及18β-GA對CDDP誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡的影響（Hoechst染色，×400）

Fig.5 Effects of 18α-GA and 18β-GA on ROS content in cardiomyocytes induced by cisplatin圖5 18α-GA和18β-GA對順鉑誘導(dǎo)心肌細(xì)胞ROS含量的影響

Fig.6 Effects of 18α-GA and 18β-GA on mitochondrial activity of cardiomyocytes induced by CDDP(×400)圖6 18α-GA和18β-GA對CDDP誘導(dǎo)心肌細(xì)胞線粒體活性的影響（×400）

Tab.1 Comparison of mitochondrial foot length and number of mitochondria with reticular structure between the four groups表1各組細(xì)胞線粒體足長度和具有網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的線粒體數(shù)量比較 （n=6）

2.5 18 α-GA及18β-GA對順鉑誘導(dǎo)的線粒體相關(guān)凋亡蛋白表達的影響與對照組相比，CDDP組CCaspase3、Cyt-c蛋白表達水平升高，Bcl-2/Bax蛋白表達水平降低（P＜0.05）；與CDDP組相比，18α-GA組和18β-GA組的C-Caspase3和Cyt-c蛋白表達水平降低，Bcl-2/Bax蛋白表達水平升高（P＜0.05）。見表2、圖7。

Tab.2 Comparison of protein expression levels of CCaspase3,Bcl-2/Bax and Cyt-c between the four groups表2各組C-Caspase3、Bcl-2/Bax、Cyt-c的蛋白表達水平比較 （n=3，±s）

Tab.2 Comparison of protein expression levels of CCaspase3,Bcl-2/Bax and Cyt-c between the four groups表2各組C-Caspase3、Bcl-2/Bax、Cyt-c的蛋白表達水平比較 （n=3，±s）

＊＊P＜0.01；a與對照組相比，b與CDDP組相比，P＜0.05。

組別對照組CDDP組18α-GA組18β-GA組F C-Caspase3 1.06±0.40 2.15±0.40a 1.30±0.28b 1.30±0.35b 10.321＊＊Bcl-2/Bax 1.00±0.15 0.50±0.04a 0.97±0.18b 0.88±0.09b 9.768＊＊Cyt-c 0.97±0.41 2.66±0.22a 1.11±0.25b 0.57±0.04b 36.039＊＊

3 討論

腫瘤心臟病學(xué)作為一門新生交叉學(xué)科，在過去十年中取得了重大進展并形成國際專家共識［9］。國際指南對放化療及靶向藥物的心血管毒性及防治提供了臨床指導(dǎo)?？鼓[瘤藥物產(chǎn)生的心臟毒性反應(yīng)是腫瘤心臟病學(xué)的主要研究內(nèi)容之一，如放化療引起的心功能改變、化療后心肌損傷導(dǎo)致生物標(biāo)志物的變化以及心律改變等［10］。鉑類化療藥在對抗實體瘤方面具有良好的效果，然而隨著使用時間與劑量的增加，機體可出現(xiàn)不同程度的心臟毒性反應(yīng)。本研究發(fā)現(xiàn)，CDDP干預(yù)H9c2心肌細(xì)胞可使心肌細(xì)胞活力呈劑量依賴性下降。20 μmol/L的CDDP可致心肌細(xì)胞活力下降至50%左右，且細(xì)胞發(fā)生凋亡。

Fig.7 Effects of 18α-GA and 18β-GA on CDDP-induced mitochondrial-related apoptostic protein expression in cardiomyocytes圖7 18α-GA和18β-GA對CDDP誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞線粒體相關(guān)凋亡蛋白表達的影響

多種中藥提取物應(yīng)用于臨床可起到多通路多靶點的心臟保護作用。研究發(fā)現(xiàn)，GA能夠減少心肌梗死面積、改善室性心律失常，并可保護心肌細(xì)胞免受缺氧缺糖誘導(dǎo)的損傷［11］。然而，GA能否對CDDP誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞損傷發(fā)揮保護作用尚不明確。本研究結(jié)果顯示，＜100 μmol/L的18α-GA和18β-GA對心肌細(xì)胞活力無明顯影響，進一步研究發(fā)現(xiàn)，50 μmol/L和100 μmol/L的18α-GA及18β-GA均可提升CDDP造成的心肌細(xì)胞活力的下降，且在100μmol/L時效果較好。Hoechst 33258凋亡染色結(jié)果提示，100 μmol/L的18α-GA和18β-GA均可有效抑制CDDP誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡。

鉑類化療藥物產(chǎn)生的臟器毒性反應(yīng)一般是多重因素共同作用所致，如DNA損傷、氧化應(yīng)激、炎癥反應(yīng)以及細(xì)胞相關(guān)凋亡通路的發(fā)生等。多項研究表明氧化應(yīng)激在順鉑誘導(dǎo)心臟毒性中發(fā)揮重要作用［12-14］。在CDDP誘導(dǎo)的細(xì)胞毒性中，ROS生成的增加是重要因素［15］。少量的ROS可對細(xì)胞發(fā)揮有益作用，然而大量的ROS過度堆積將對細(xì)胞產(chǎn)生有害的影響，特別是激活細(xì)胞凋亡通路。ROS過度積累可改變線粒體膜電位并破壞呼吸鏈，最終觸發(fā)凋亡。同時，線粒體是ROS的主要產(chǎn)出場所，線粒體損傷也可導(dǎo)致ROS的不斷產(chǎn)生，形成惡性循環(huán)。抑制ROS的產(chǎn)生可有效緩解CDDP導(dǎo)致的心肌損傷。研究發(fā)現(xiàn)GA可通過抑制ROS與細(xì)胞凋亡對心肌細(xì)胞發(fā)揮一定的保護作用［16-17］。本研究結(jié)果顯示，在CDDP作用下的H9c2心肌細(xì)胞內(nèi)ROS水平較對照組明顯增加，在給予18α-GA和18β-GA處理24 h后可顯著降低CDDP誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞ROS的產(chǎn)生。

研究發(fā)現(xiàn)，CDDP給藥后可在線粒體內(nèi)快速蓄積，使線粒體結(jié)構(gòu)和功能發(fā)生改變，最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡［18］。線粒體介導(dǎo)的內(nèi)源性凋亡是參與CDDP誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的主要形式［19］。當(dāng)細(xì)胞發(fā)生凋亡時，包括ROS在內(nèi)的應(yīng)激信號將調(diào)控線粒體膜通透性，此時線粒體外膜上的Bcl-2的表達降低，使得線粒體膜通透性增高，存在于胞漿內(nèi)的Bax可被轉(zhuǎn)移到線粒體，結(jié)合在線粒體外膜形成線粒體凋亡通道，導(dǎo)致Cyt-c釋放，激活Caspase級聯(lián)反應(yīng)［20］。為探究18α-GA和18β-GA能否改善CDDP引發(fā)的線粒體功能障礙，筆者對線粒體相關(guān)指標(biāo)進行檢測。結(jié)果顯示，與對照組相比，CDDP組細(xì)胞具有網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的線粒體數(shù)量和線粒體足長度明顯降低，說明具有生物活性的線粒體減少，線粒體碎片增多，同時線粒體相關(guān)蛋白Bcl-2/Bax的表達降低，引起線粒體膜通透性的增高，導(dǎo)致Cyt-c的外泄，引起Caspase3激活；經(jīng)過18α-GA和18β-GA干預(yù)后線粒體網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)明顯增加，線粒體碎片的產(chǎn)生減少，Bcl-2/Bax的表達升高，線粒體生物活性提高，抑制Cyt-c的外排以及Caspase3的表達。以上結(jié)果表明18α-GA和18β-GA可以改善線粒體功能，對CDDP誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞損傷發(fā)揮保護作用。

綜上，18α-GA和18β-GA可抑制ROS的生成并改善心肌細(xì)胞線粒體功能障礙，減輕CDDP對H9c2心肌細(xì)胞的損傷作用。GA在體的心肌保護作用需要進一步的實驗研究。