維多利亞藍(lán)彈性纖維染色常見(jiàn)問(wèn)題分析與質(zhì)量控制

虞文偉，張順民，鄭建明，唐 峰，冼志紅

特殊染色技術(shù)在日常病理診斷中具有重要意義[1-2]，彈性纖維染色對(duì)評(píng)估疾病組織中彈性纖維變化、惡性腫瘤的血管侵犯及某些腫瘤的鑒別診斷有重要價(jià)值[3-4]。經(jīng)典的Verhoeff彈性纖維染色法只能顯示粗大的彈性纖維[5]；維多利亞藍(lán)彈性纖維染色步驟相對(duì)較少，可顯示細(xì)小彈性纖維，顏色清新；與Van-Gieson復(fù)染組合，可對(duì)結(jié)締組織成分做出良好的評(píng)估。為了普及和提高該染色技術(shù)，上海市臨床病理專科委員會(huì)聯(lián)合上海市臨床病理質(zhì)量控制中心，對(duì)上海市50家醫(yī)院病理科進(jìn)行了維多利亞藍(lán)彈性纖維染色技術(shù)室間質(zhì)量控制測(cè)評(píng)。本文對(duì)測(cè)評(píng)中出現(xiàn)的染色缺陷的關(guān)鍵問(wèn)題進(jìn)行分析，并探討其主要原因及解決方案，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 材料收集2021年5月上海交通大學(xué)附屬新華醫(yī)院病理科肺腫瘤切除標(biāo)本，選擇5例含有胸膜和肺腺癌的代表性蠟塊，由上海醫(yī)學(xué)會(huì)病理分會(huì)技術(shù)組專家制作特殊染色比賽切片。

1.2 方法

1.2.1切片 標(biāo)本均經(jīng)10%中性福爾馬林固定，常規(guī)取材，組織脫水，石蠟包埋，4 μm厚連續(xù)切片，行HE染色。將5例石蠟標(biāo)本切片分發(fā)至各參評(píng)單位，行維多利亞藍(lán)彈性纖維染色。

1.2.2試劑 (1)高錳酸鉀溶液；(2)草酸溶液；(3)彈性纖維染液；(4)Van-Gieson染液。試劑經(jīng)2～8 ℃冰箱保存待用，維多利亞藍(lán)彈性纖維染色液購(gòu)自貝索生物公司。

1.2.3染色步驟 (1)石蠟切片常規(guī)脫蠟至水；(2)高錳酸鉀溶液氧化5 min，稍水洗；(3)草酸溶液漂白2～3 min至切片無(wú)色為止，細(xì)流水沖洗；(4)95%乙醇稍洗，浸入彈性纖維染液中常溫作用8～24 h(加蓋，避免染液揮發(fā))；(5)95%乙醇或1%鹽酸乙醇分化，快速浸洗至無(wú)多余染液脫下(必要時(shí)鏡下控制，避免脫色過(guò)度)；(6)細(xì)流水沖洗3～5 min；(7)用Van-Gieson染液復(fù)染1 min，傾去染液，不可經(jīng)水洗；(8)95%乙醇快速分化數(shù)秒，無(wú)水乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹(shù)膠封固。

1.3 結(jié)果判斷高倍鏡下切片彈性纖維染色呈藍(lán)黑色，膠原纖維呈紅色，肌纖維和紅細(xì)胞呈黃色。

1.4 質(zhì)控評(píng)分評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)預(yù)先由專家委員會(huì)制定，經(jīng)兩位主任醫(yī)師閱片并按標(biāo)準(zhǔn)評(píng)分(表1)。本次質(zhì)控著重對(duì)染色質(zhì)量進(jìn)行評(píng)分，不包括前期組織處理、組織切片及染色后封固質(zhì)量。評(píng)分結(jié)果按下列分?jǐn)?shù)定級(jí)：甲級(jí)片≥90分(優(yōu))，乙級(jí)片：75～89分(良)，丙級(jí)片：60～74分(基本合格)，丁級(jí)片：<60(不合格)。

表1 維多利亞藍(lán)彈性纖維染色評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)

2 結(jié)果

本次室間質(zhì)量控制測(cè)評(píng)，切片合計(jì)50張，有48家單位提交染色切片。根據(jù)兩位專家的評(píng)分結(jié)果，其中甲級(jí)片14張，乙級(jí)片26張，丙級(jí)片5張，丁級(jí)片3張(表2)。

優(yōu)良染色的切片定位準(zhǔn)確，染色強(qiáng)度恰當(dāng)，無(wú)非特異性著色，各種染色對(duì)比清晰。彈性纖維染色呈藍(lán)黑色，膠原纖維呈紅色，肌纖維和紅細(xì)胞呈黃色(圖1)?？汕宄@示肺組織內(nèi)動(dòng)脈管壁的彈性纖維，呈藍(lán)色，較細(xì)、呈波浪狀斷續(xù)曲折，并可顯示損傷的動(dòng)脈管壁的彈性纖維變性、斷裂和缺失(圖2)。正常肺泡中彈性纖維沿肺泡勾勒出肺泡的大體輪廓(圖3)；可清楚地判斷肺癌細(xì)胞與臟層胸膜的關(guān)系。肺癌累及胸膜時(shí)，彈性纖維膜斷裂并顯著減少(圖4)。

常見(jiàn)的染色缺陷：(1)彈性纖維淡染，與細(xì)胞質(zhì)對(duì)比差(圖5)；(2)彈性纖維染色過(guò)深而模糊，細(xì)胞胞質(zhì)呈灰藍(lán)色(圖6)；(3)膠原蛋白呈錯(cuò)誤的染色或染色不均勻，如膠原蛋白未著色或整個(gè)切片染成藍(lán)色等假象(圖7)；(4)肌肉和紅細(xì)胞未染色或灰色，而不是黃色(表2，圖8)。

表2 維多利亞藍(lán)彈性纖維染色效果

3 討論

3.1 染色機(jī)制彈性纖維染色的主要機(jī)制是帶負(fù)電荷的彈性蛋白(含二硫鍵及酸性基團(tuán))，與帶有弱正電荷的染料通過(guò)非極性吸附完成染色。維多利亞藍(lán)彈性纖維染液是維多利亞藍(lán)、間苯二酚染料與三氯化鐵絡(luò)合，形成維多利亞藍(lán)-鐵-間苯二酚色淀。這種復(fù)合物的酚基與彈性纖維的某些成分之間形成氫鍵，將彈性纖維染成藍(lán)黑色，Van-Gieson染色為對(duì)比染色。

維多利亞藍(lán)彈性纖維染色可能與以下因素有關(guān)：(1)高錳酸鉀氧化后，部分二硫鍵轉(zhuǎn)化為陰離子的硫酸衍生物，呈強(qiáng)嗜堿性，對(duì)染液中的堿性染料具有相對(duì)選擇性。高錳酸鉀、草酸處理可增強(qiáng)染色的對(duì)比度和深度，氧化時(shí)間過(guò)長(zhǎng)可導(dǎo)致非特異性染色。(2)維多利亞藍(lán)成分多樣，可影響彈性纖維的著色；三氯化鐵含有亞鐵鹽也可干擾染色結(jié)果。(3)鹽酸-乙醇分化是決定染色成敗的關(guān)鍵步驟，分化過(guò)度細(xì)纖維很容易消失。(4)Van-Gieson液的苦味酸如果不飽和，膠原、細(xì)胞質(zhì)和肌肉會(huì)染上淡粉色到淡橙色，高pH值膠原的選擇性染色減弱。

3.2 染色缺陷及解決方案本次室間質(zhì)量控制評(píng)價(jià)結(jié)果顯示，66.7%的染色切片彈性纖維定位準(zhǔn)確，染色強(qiáng)度恰當(dāng)，無(wú)非特異性著色，對(duì)比清晰，但也存在一些染色缺陷。(1)彈性纖維染色過(guò)淺、與背景對(duì)比差：可能與彈性纖維染液制備不當(dāng)、染液過(guò)舊、不同批號(hào)的維多利亞藍(lán)及染液中氯化鐵有雜質(zhì)相關(guān)。解決方案：應(yīng)按正確順序制備彈性纖維染液、使用經(jīng)過(guò)認(rèn)證的染料、維多利亞藍(lán)4R效果較好，在鏡下檢查切片分化程度，過(guò)度分化可重新染色切片。(2)彈性纖維染色過(guò)深、背景呈藍(lán)灰色：主要原因是切片脫色不足，應(yīng)延長(zhǎng)在乙醇或鹽酸-乙醇溶液中的分化時(shí)間，并在鏡下檢查分化程度。(3)膠原、肌肉和紅細(xì)胞未染色或呈灰藍(lán)色：主要原因包括Van-Gieson染色試劑陳舊或多次使用，苦味酸未飽和，彈性纖維分化不夠；應(yīng)及時(shí)更換試劑，確保Van-Gieson染色劑中苦味酸的飽和性和適當(dāng)?shù)膹椥岳w維分化。(4)組織結(jié)構(gòu)成分出現(xiàn)錯(cuò)誤的顏色或染色不均勻：主要原因包括組織固定不充分、染色分化不當(dāng)、染色液pH值不正確；應(yīng)更換固定良好的組織塊，正確的分化并驗(yàn)證染液的pH值為2.5或更低。

①②③④⑤⑥⑦⑧圖1 彈性纖維染色呈藍(lán)黑色,膠原纖維呈紅色,肌纖維和紅細(xì)胞呈黃色,維多利亞藍(lán)彈性纖維染色法 圖2 肺組織內(nèi)動(dòng)脈管壁的彈性纖維呈藍(lán)色,損傷的動(dòng)脈管壁的彈性纖維變性、斷裂和缺失,維多利亞藍(lán)彈性纖維染色法 圖3 正常肺泡中彈性纖維沿肺泡勾勒出肺泡的大體輪廓,維多利亞藍(lán)彈性纖維染色法 圖4 肺癌累及胸膜,彈性纖維膜斷裂并顯著減少,維多

3.3 維多利亞藍(lán)彈性纖維染色質(zhì)量控制影響彈性纖維染色結(jié)果的因素包括氧化時(shí)間、染料純度和溶液pH值、染色和分化時(shí)間等[6]。設(shè)置陽(yáng)性對(duì)照切片最為關(guān)鍵，使用組織芯片與待檢測(cè)組織在同一張切片上進(jìn)行染色。最好使用較小的肌性動(dòng)脈，因?yàn)轱@示肌壁內(nèi)的細(xì)彈性纖維可更好地確定分化終點(diǎn)，管壁平滑肌黃色；血管周膠原纖維紅色。全自動(dòng)特殊染色已應(yīng)用于日常工作，為染色條件的一致性、結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性提供保證。

綜上所述，彈性纖維染色影響因素較多，操作流程中應(yīng)嚴(yán)格掌握和控制染色溫度、染色時(shí)間、pH值、試劑配制及保存等細(xì)節(jié)，規(guī)范化操作，做好質(zhì)控，以保證染色的穩(wěn)定性和可靠性，更好地服務(wù)于臨床病理診斷。