一株8型豬鏈球菌的分離鑒定及藥敏試驗(yàn)

李元亮，賀安文，劉言言，徐耀輝，唐光武，陳 益，蔣增海

(河南牧業(yè)經(jīng)濟(jì)學(xué)院 動物醫(yī)藥學(xué)院，河南 鄭州 450046)

豬鏈球菌(Streptococcussuis,SS)是養(yǎng)豬業(yè)中最重要的病原菌之一，可引起豬敗血癥、腦膜炎、關(guān)節(jié)炎、流產(chǎn)及突然死亡等，它也是一種重要的人畜共患病原體，可導(dǎo)致人類發(fā)生敗血癥，甚至可能伴有敗血性休克、腦膜炎等[1]。根據(jù)莢膜抗原分類的不同，可將豬鏈球菌分為35個血清型(1～34型和1/2型)，其中1型、1/2型、2型、7型、9型和14型均可感染人，以2型致病性最強(qiáng)[2]。最新研究認(rèn)為，豬鏈球菌只包含29個血清型(1～19型、21型、23～25型、27～31型、1/2型)[3]，其中血清1型、1/2型、2型、7型、9型、14型及血清8型對豬致病性最強(qiáng)[4，5]。

近年來，全國各地豬鏈球病的報道較多[6-10]，但關(guān)于致腦膜炎豬鏈球菌病的報道較少[11，12]。2020年10月底，河南省豫西某規(guī)?；i場，60日齡階段保育仔豬發(fā)生零星猝死，有的病豬瀕死前表現(xiàn)為顫抖、運(yùn)動失調(diào)、倒地后四肢劃水狀，疑似腦膜炎型鏈球菌病。本研究無菌采集發(fā)病仔豬的腦部組織，進(jìn)行病原菌的分離鑒定及藥敏試驗(yàn)，旨在為腦膜炎型豬鏈球菌病的防控與治療提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 病料來源

2020年10月，采集河南省豫西某規(guī)?；i場發(fā)病保育豬的腦部組織。

1.2 主要試劑

腦心浸液肉湯購自英國OXOID公司；5%鮮血瓊脂平板購自江門市凱林貿(mào)易有限公司；2XPCR Taq MasterMix(dye)購自加拿大ABM公司；DL2,000 DNA Marker由TaKaRa公司提供；核酸染料由天恩澤公司提供；藥敏片購自北京天壇藥物生物技術(shù)開發(fā)公司；快速革蘭染色液購自珠海貝索生物技術(shù)有限公司。

1.3 儀器與設(shè)備

PCR擴(kuò)增儀(ETC811，北京東勝生物科技公司)；氣浴恒溫振蕩器(SHZ-82，金壇市杰瑞爾電器有限公司)；電熱恒溫培養(yǎng)箱(HP-9272，上海百典儀器設(shè)備有限公司)；立式壓力蒸汽滅菌器(LDZX-50KB，上海申安醫(yī)療器械廠)；超凈工作臺(W-CJ-1FD，蘇州安泰凈化設(shè)備有限公司)；電泳儀(DYY-10C，北京市六一儀器廠)；凝膠成像分析系統(tǒng)(Gel DocTMXR，美國 BIO-RAD 公司)；高速離心機(jī)(5424R，德國Eppendorf公司)。

1.4 細(xì)菌的分離培養(yǎng)

無菌采集病變仔豬的腦部組織，直接涂片進(jìn)行瑞氏染色、鏡檢，接種環(huán)滅菌后再次挑取腦部組織，接種于血瓊脂平板，37 ℃培養(yǎng)24 h。挑取生長大小均勻一致的單菌落接種于血瓊脂平板，37 ℃培養(yǎng)24 h，進(jìn)一步傳代純化，挑取純化后的單菌落，進(jìn)行革蘭染色、鏡檢，觀察細(xì)菌的形態(tài)特征。

1.5 細(xì)菌的PCR鑒定

挑取分離純化的單菌落，接種于腦心浸液肉湯中，37 ℃過夜培養(yǎng)，然后水煮法提取分離菌株DNA,以此DNA作為擴(kuò)增模板，針對豬鏈球菌谷氨酸脫氫酶基因gdh，按照參考文獻(xiàn)[13]設(shè)計合成特異性引物(P1:5′-GCAGCGTATTCTGTCAAACG-3′，P2:5′-CCATGGACAGATAAAGATGG-3′，預(yù)期擴(kuò)增片段大小為689 bp)，引物由生工生物工程(上海)有限公司合成。

通過PCR擴(kuò)增對分離菌株進(jìn)行鑒定。反應(yīng)體系：2XPCR Taq MasterMix(dye)12.5 μL,P1 1 μL(10 μM),P2 1 μL(10 μM),細(xì)菌DNA 1 μL，去離子水9.5 μL。PCR擴(kuò)增程序如下：94 ℃預(yù)變性3 min；94 ℃變性30 s，51 ℃退火30 s，72 ℃延伸50 s，共30個循環(huán)；最后72 ℃延伸5 min。

1.6 血清型鑒定和毒力因子檢測

以水煮法提取分離菌株DNA為模板，按照參考文獻(xiàn)[14]合成4組多重PCR全套引物，鑒定33個豬鏈球菌血清型(1～31型、33型、1/2型)。分別進(jìn)行4組多重PCR擴(kuò)增，用于分離菌株的血清型鑒定，回收陽性擴(kuò)增條帶，將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物送生工生物工程(上海)有限公司進(jìn)行測序，測序結(jié)果與NCBI數(shù)據(jù)庫中序列進(jìn)行同源性比對。

按照參考文獻(xiàn)[15]合成鑒定豬鏈球菌毒力因子引物(表1)，采用多重PCR對分離菌株進(jìn)行毒力因子檢測。反應(yīng)體系：2XPCR Taq MasterMix(dye)12.5 μL,上游引物各0.2 μL(10 μM),下游引物各0.2 μL(10 μM),細(xì)菌DNA 1 μL，去離子水補(bǔ)至25 μL。PCR擴(kuò)增程序如下：94 ℃預(yù)變性3 min；94 ℃變性1 min，58 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min，共30個循環(huán)；最后72 ℃延伸7 min。所有引物均由生工生物工程(上海)有限公司合成。

1.7 藥敏試驗(yàn)

以大腸桿菌(ATCC25922)為質(zhì)控菌株，采用K-B法對分離菌株進(jìn)行藥敏試驗(yàn)。按照參考文獻(xiàn)[16]方法，挑取純化培養(yǎng)的單菌落接種于腦心浸液肉湯中，37 ℃培養(yǎng)12 h，用生理鹽水將菌液濃度調(diào)整為0.5麥?zhǔn)蠞岫葮?biāo)準(zhǔn)(1.5×108CFU/mL)；用滅菌棉簽蘸取稀釋好的菌液，均勻涂抹于血瓊脂平板；將藥敏紙片貼于平板上，置于37 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)18～24 h后，測定抑菌圈的直徑，根據(jù)說明書標(biāo)準(zhǔn)對結(jié)果進(jìn)行判定[16]。

表1 豬鏈球菌毒力因子PCR擴(kuò)增引物序列

2 結(jié)果

2.1 細(xì)菌的分離培養(yǎng)結(jié)果

解剖顱骨可見大腦組織局部出血明顯(圖1)，取病變的腦部組織進(jìn)行瑞氏染色，油鏡下可見單個、成對或者短鏈球菌(圖2)。取病變腦部接種血瓊脂平板，37 ℃培養(yǎng)24 h,可見白色或者灰白色、大小約1～1.5 mm、濕潤、圓形菌落，呈α溶血現(xiàn)象。挑取分離純化后的單菌落，革蘭染色呈陽性、短鏈球菌(圖3)。

圖1 腦部出血性病變

圖2 腦組織涂片，染色、鏡檢結(jié)果(1000×)

圖3 分離菌株革蘭染色結(jié)果(1000×)

2.2 細(xì)菌的PCR鑒定結(jié)果

對分離菌株進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂凝膠電泳后，凝膠成像系統(tǒng)觀察結(jié)果，可見擴(kuò)增條帶在500～750 bp之間(圖4)，與預(yù)期擴(kuò)增大小689 bp一致，表明分離菌株為豬鏈球菌。

M: DNA相對分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)(DL2000)；1,2：分離菌株；3：陰性對照

2.3 血清型鑒定和毒力因子檢測

采用4組多重PCR對分離菌株進(jìn)行擴(kuò)增，結(jié)果表明在第一組多重PCR體系中，其擴(kuò)增條帶大小與8型豬鏈球菌的預(yù)期擴(kuò)增大小268 bp一致(圖5)，其他3組多重PCR均無擴(kuò)增條帶。將PCR產(chǎn)物回收后測序，并與NCBI數(shù)據(jù)庫中序列進(jìn)行同源性比對，顯示分離菌株與NCBI數(shù)據(jù)庫中8型豬鏈球菌的同源性大于95%，確定分離菌株即8型豬鏈球菌。

M: DNA相對分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)(DL2000)；1,2：分離菌株；3：陰性對照

采用多重PCR對分離的8型豬鏈球菌進(jìn)行毒力因子檢測，結(jié)果顯示，毒力因子sly對應(yīng)預(yù)期擴(kuò)增大小248 bp處出現(xiàn)擴(kuò)增條帶，而毒力因子mrp、epf分別對應(yīng)預(yù)期擴(kuò)增大小188bp、744 bp處均無擴(kuò)增條帶(圖6)，表明該豬鏈球菌的毒力因子基因型為mrp-/epf-/sly+。

2.4 藥敏試驗(yàn)

采用K-B法對分離菌株進(jìn)行藥敏試驗(yàn)，結(jié)果表明該分離菌株對青霉素、氨芐西林、頭孢噻肟、環(huán)丙沙星、復(fù)方新諾明等藥物敏感，對四環(huán)素、強(qiáng)力霉素、紅霉素耐藥(表2)。根據(jù)藥敏試驗(yàn)結(jié)果，針對本次病例可推薦青霉素、氨芐西林或者復(fù)方新諾明等進(jìn)行治療。

M: DNA相對分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)(DL2000)；1：分離菌株；2：陰性對照

表2 分離菌的藥敏試驗(yàn)結(jié)果

3 討論

豬鏈球菌是重要的人獸共患病原體，可引起豬腦膜炎和敗血癥等癥狀，并能通過黏膜或者傷口等傳播途徑感染人[17],本研究表明，8型豬鏈球菌可導(dǎo)致仔豬腦膜炎并致死。急性腦炎型鏈球菌病早期發(fā)現(xiàn)比較困難，對于豬場來說，需要每天監(jiān)測豬群2～3次。早期癥狀表現(xiàn)為耳朵朝后、眼睛斜視、犬坐姿勢，盡早發(fā)現(xiàn)，早期治療。仔豬腦膜炎型鏈球菌病在臨床容易與仔豬偽狂犬病、仔豬水腫病相混淆，注意鑒別診斷。

迄今，已經(jīng)鑒定了大約60種豬鏈球菌的毒力因子，其中莢膜多糖(CPS)、溶血素(SLY)、細(xì)胞外蛋白因子(EPF)、溶菌酶釋放相關(guān)蛋白(MRP)被認(rèn)為是豬鏈球菌的主要的毒力因子[18]，本研究中的豬鏈球菌毒力因子基因型為mrp-/epf-/sly+，Wisselink等[4]報道8型豬鏈球菌中有91%菌株呈mrp-/epf-毒力因子,基因型的研究結(jié)果一致。

藥敏試驗(yàn)結(jié)果表明，8型豬鏈球菌對強(qiáng)力霉素、四環(huán)素、紅霉素耐藥，對青霉素類藥物或磺胺類藥物比較敏感，因此可采用青霉素聯(lián)合地塞米松肌肉注射，或者大劑量磺胺類藥物肌肉注射治療。豬場出現(xiàn)病豬或者病死豬，可對同一圈舍的所有豬進(jìn)行全群治療，如可用阿莫西林飲水或者拌料，連用5～7 d。

4 結(jié)論

本研究結(jié)果表明，8型豬鏈球菌可導(dǎo)致仔豬腦膜炎，且對強(qiáng)力霉素、四環(huán)素、紅霉素等耐藥，但是對頭孢、青霉素或者磺胺類藥物敏感，因此,此類藥物可作為該病治療的首選藥物。