植物精油與有機酸鹽聯(lián)合對曲霉菌的抑制作用

張桂枝，楊雪茹，陳旭勃，王 強，靳雙星

(1.河南牧業(yè)經(jīng)濟學(xué)院，河南 鄭州 450046；2.河南省家禽疾病防控工程技術(shù)研究中心，河南 鄭州 450046；3.廣州智龍生物科技有限公司，廣東 廣州 510032)

曲霉菌為自然環(huán)境中廣泛存在的一種腐生真菌，主要包括煙曲霉菌、黃曲霉菌、土曲霉菌和黑曲霉菌等，其中煙曲霉菌和黃曲霉菌是常見的致病真菌，也是引發(fā)禽曲霉菌病的主要致病菌，對人畜也構(gòu)成嚴(yán)重危害。植物精油對多種霉菌生長有顯著的抑制作用，可有效地破壞霉菌的結(jié)構(gòu)，減少霉菌毒素的產(chǎn)生。鄔本成等[1]研究發(fā)現(xiàn)，由肉桂醛和香芹酚組成的復(fù)合精油能有效抑制飼料中青霉菌和黑曲霉菌的生長。馮文旭等[2]報道，丁香油、肉桂油、牛至油和山蒼子油的納米乳液均可有效抑制禾谷鐮刀菌菌絲生長。雙乙酸鈉作為一種新型高效低毒的防霉劑，對黑曲霉、黃曲霉等多種霉菌的生長有顯著抑制作用。靳雙星等[3]研究發(fā)現(xiàn)，雙乙酸鈉與丁酸鈉聯(lián)合對黃曲霉菌的生長有協(xié)同增強作用。目前，關(guān)于植物精油與有機酸鹽聯(lián)合對曲霉菌生長的抑制作用報道較少。本試驗選擇對家禽危害最嚴(yán)重的兩種曲霉菌—黃曲霉菌和煙曲霉菌為研究對象，探討植物精油與有機酸鹽聯(lián)合對兩種曲霉菌的抑菌效果。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 菌種

黃曲霉ATCC28539購于上海北思生物公司；煙曲霉CICC41022購于北京陸橋技術(shù)股份有限公司。

1.1.2 藥品

PDA培養(yǎng)基購于北京奧博星生物技術(shù)有限公司；RPMI1640培養(yǎng)基購于南京建成生物工程研究所；雙乙酸鈉、丙酸鈣、丁酸鈉和山梨酸鉀均購自河南省萬家標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)研發(fā)中心有限公司；肉桂醛和大蒜素由上海易恩化學(xué)技術(shù)有限公司提供；香芹酚、丁香酚、檸檬醛由Aladdin有限公司提供；百里香酚由天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司提供；松油醇由天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司提供。

1.2 方法

1.2.1 試驗菌液的制備

取保存的黃曲霉和煙曲霉菌株接種于PDA培養(yǎng)基，28 ℃培養(yǎng)3天。待平板長滿菌絲后，用含有0.1%吐溫-80的無菌鹽水沖洗，用巴氏吸管輕輕吹打使孢子游離出來。無菌紗布過濾去除菌絲，用pH 7.0的RPMI1640培養(yǎng)液重懸孢子，采用血細(xì)胞計數(shù)板計數(shù)，調(diào)整孢子液濃度為(2～5)×105cfu/mL。

1.2.2 抑菌圈直徑的測定

用吐溫-80作乳化劑，滅菌丙酮作溶劑，配制濃度為200 mg/mL的肉桂醛、檸檬醛、香芹酚、丁香酚、百里香酚、松油醇和大蒜素溶液。采用絲狀真菌紙片擴散法進行藥物敏感試驗。取100 μL菌懸液均勻涂布于PDA培養(yǎng)基表面，夾取直徑為6 mm的濾紙片貼于平板表面，吸取10 μL精油丙酮液滴于濾紙片表面，28 ℃培養(yǎng)48 h，測量抑菌圈直徑，每個樣品做三個重復(fù)。

1.2.3 最小抑菌濃度(MIC)測定

配制濃度均為256 mg/mL的肉桂醛、香芹酚、丁香酚和百里香酚溶液，配制方法同1.2.2，參照美國臨床標(biāo)準(zhǔn)化委員會提出的M38-A2方案進行操作。在平底的96孔培養(yǎng)板上加樣，同時設(shè)立陰性對照組(藥物對照組)和無藥陽性對照組。加樣結(jié)束后，將培養(yǎng)板置于28 ℃培養(yǎng)72 h，觀察真菌生長情況，同時在倒置顯微鏡下觀察曲霉菌的孢子和菌絲。無真菌生長的最小藥物濃度即為MIC。平行重復(fù)三次，若MIC值只差一個濃度梯度，取最高濃度。

1.2.4 最低殺菌濃度(MFC)測定

培養(yǎng)72 h后，從微量試驗孔和無藥陽性對照孔各吸取20 μL菌懸液傾注到PDA瓊脂平板，28 ℃培養(yǎng)48 h后進行菌落計數(shù)，小于3 cfu/mL的最低藥物濃度即為MFC。

1.2.5 聯(lián)合抑菌試驗

選出抑菌效果好的兩種植物精油，按照1∶1、1∶2、1∶3、1∶4、1∶5、2∶1、3∶1、4∶1和5∶1的比例聯(lián)合，采用微量稀釋法測定MIC，計數(shù)分級抑菌濃度指數(shù)(FIC)。平行重復(fù)三次，選出最佳復(fù)配比例。采用同樣方法，測定復(fù)合植物精油和復(fù)合有機酸鹽按照不同比例配合的MIC和FIC 。FIC≤0.5為增強作用；0.52為拮抗作用。

2 結(jié)果與分析

2.1 植物精油對曲霉菌的抑菌圈直徑

由表1可知，7種植物精油對煙曲霉菌和黃曲霉菌抑菌效果有很大差異。肉桂醛對黃曲霉和煙曲霉菌抑菌圈直徑分別為28.3 mm、20.1 mm，為高度敏感。丁香酚對黃曲霉菌抑菌圈直徑為24.6 mm，為高度敏感，對煙曲霉菌中度敏感。香芹酚和百里香酚對黃曲霉和煙曲霉菌均為中度敏感。大蒜素、松油醇和檸檬醛對煙曲霉菌和黃曲霉菌的抑菌圈直徑均小于10 mm。稀釋液丙酮對煙曲霉菌和黃曲霉菌均無抑制作用。

表1 植物精油對黃、煙曲霉菌的抑菌圈直徑 mm

2.2 MIC和MFC測定結(jié)果

由表2和圖1、圖2可知，8.0 mg/mL的肉桂醛能夠完全殺滅黃曲霉菌和煙曲霉菌，在倒置顯微鏡下看不到菌絲和孢子；肉桂醛濃度為4.0 mg/mL時肉眼觀察不到真菌生長，在倒置顯微鏡下只看到極少量的菌絲和孢子；隨著肉桂醛濃度的降低，抑菌作用逐漸減弱，肉桂醛濃度為1.0 mg/mL時，在倒置顯微鏡下可看到多量的菌絲和孢子。丁香酚對黃曲霉菌和煙曲霉菌的MIC均為8.0 mg/mL，濃度為16.0 mg/mL的丁香酚完全殺滅黃曲霉菌和煙曲霉菌，在倒置顯微鏡下看不到菌絲和孢子。香芹酚和百里香酚對黃曲霉菌的MIC均為32.0 mg/mL，對煙曲霉菌的MIC均為16.0 mg/mL。

表2 4種植物精油對黃曲霉菌和煙曲霉菌的MIC、MFC mg/mL

圖1 不同濃度肉桂醛對黃曲霉菌的抑菌效果

圖2 不同濃度肉桂醛對煙曲霉菌的抑菌效果

2.3 植物精油聯(lián)合對曲霉菌的抑菌效果

由表3和圖3、圖4可知，肉桂醛與丁香酚按照9種不同比例聯(lián)合對黃曲霉菌和煙曲霉菌的FIC均小于1，二者聯(lián)合表現(xiàn)出協(xié)同作用。肉桂醛與丁香酚按照質(zhì)量比1∶2聯(lián)合抑菌效果最佳，對黃曲霉菌和煙曲霉菌的MIC分別為2.0 mg/mL和1.0 mg/mL，F(xiàn)IC分別為0.33和0.17，MFC均為4.0 mg/mL。

表3 肉桂醛與丁香酚聯(lián)合對黃曲霉菌、煙曲霉菌的MIC、MFC和FIC mg/mL

圖3 不同濃度的1∶2復(fù)合植物精油對黃曲霉菌的抑菌效果

圖4 不同濃度的1∶2復(fù)合植物精油對煙曲霉菌的抑菌效果

2.4 復(fù)合植物精油和復(fù)合有機酸鹽聯(lián)合對曲霉菌的抑菌效果

由表4和圖5、圖6可知，復(fù)合植物精油和復(fù)合有機酸鹽按照9種不同比例聯(lián)合對黃曲霉菌和煙曲霉菌的FIC均小于或等于2，二者聯(lián)合表現(xiàn)出協(xié)同或無關(guān)作用。不同比例聯(lián)合抑菌效果有很大差異，復(fù)合植物精油和復(fù)合有機酸鹽按照1∶5、1∶4聯(lián)合對黃曲霉菌和煙曲霉菌的MIC和FIC最小，抑菌效果最佳，為最佳復(fù)配組合。

表4 復(fù)合植物精油與復(fù)合有機酸鹽對黃曲霉菌和煙曲霉菌的MIC、MFC和FIC mg/mL

圖5 不同濃度的復(fù)合精油與復(fù)合有機酸鹽對黃曲霉菌的抑菌效果

圖6 不同濃度的復(fù)合精油與復(fù)合有機酸鹽對煙曲霉菌的抑菌效果

3 討論

3.1 植物精油對曲霉菌的抑制作用

植物精油的抗菌機理表現(xiàn)為破壞菌體細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)、增加菌體細(xì)胞膜的滲透性、影響菌體的物質(zhì)和能量代謝、抑制菌體對營養(yǎng)物質(zhì)的吸收利用以及抑制菌體DNA、RNA和蛋白質(zhì)的生物合成等[4]。Sun等[5]研究發(fā)現(xiàn)，肉桂醛可以破壞黃曲霉菌絲體，并能下調(diào)黃曲霉毒素合成調(diào)控基因aflR的表達，抑制黃曲霉產(chǎn)生毒素。Liang等[6]發(fā)現(xiàn)，丁香酚通過下調(diào)黃曲霉毒素生物合成基因aflR、aflT、aflD、aflM和aflP來降低AFB1的產(chǎn)生。Ultee等[7]研究發(fā)現(xiàn)，香芹酚可引起真菌細(xì)胞膜擴張，導(dǎo)致離子泄漏從而發(fā)揮抗真菌作用。張文平[8]等研究報道，檸檬醛和肉桂醛抑制煙曲霉菌和黃曲霉菌DNA、RNA和蛋白質(zhì)的合成，肉桂醛的抗曲霉菌效果優(yōu)于檸檬醛。鄔麗紅等[9]研究發(fā)現(xiàn)，肉桂醛能夠破壞煙曲霉菌的生物膜。孫琦[10]研究報道肉桂醛濃度為0.6 mmol/L時可顯著抑制黃曲霉菌生長，對AFB1毒素的抑制率達70.8%。梁丹丹等[11]研究報道肉桂醛和丁香酚可有效抑制黃曲霉的生長及產(chǎn)毒。本試驗表明，肉桂醛、檸檬醛、香芹酚、丁香酚、百里香酚、松油醇和大蒜素對煙曲霉菌和黃曲霉菌有不同程度的抑制作用，以肉桂醛對兩種曲霉菌的抑菌效果最佳，MIC為4.0 mg/mL，肉桂醛濃度為8.0 mg/mL時能夠完全殺滅黃曲霉菌和煙曲霉菌，在倒置顯微鏡下看不到其菌絲和孢子；其次是丁香酚，對黃曲霉菌和煙曲霉菌的MIC均為8.0 mg/mL；檸檬醛、松油醇和大蒜素對兩種曲霉菌的抑菌效果欠佳。

3.2 植物精油聯(lián)合的抗曲霉菌作用

不同植物精油之間合理配伍可產(chǎn)生協(xié)同抗菌作用。曲春陽等[12]研究報道，大蒜精油與肉桂精油按照體積比為1∶3聯(lián)合對黃曲霉菌的抑菌效果優(yōu)于單一植物精油。盧錕等[13]研究發(fā)現(xiàn)，肉桂精油與山蒼子精油按體積比3∶1聯(lián)合對黑曲霉和青霉有很好的抑制效果。本試驗表明，肉桂醛與丁香酚按照9種不同比例聯(lián)合對黃曲霉菌和煙曲霉菌的FIC均小于1，二者表現(xiàn)出協(xié)同作用，以肉桂醛、丁香酚1∶2聯(lián)合抑菌效果最佳。肉桂醛與丁香酚聯(lián)合產(chǎn)生協(xié)同抗菌作用的機制可能是二者結(jié)構(gòu)不同。

3.3 植物精油與有機酸鹽聯(lián)合抗菌作用

張桂枝等[14]研究發(fā)現(xiàn)，牛至油和丁酸鈉按照一定比例聯(lián)合對大腸桿菌、沙門氏菌、多殺性巴氏桿菌和鏈球菌的抑制效果優(yōu)于單獨牛至油，二者有協(xié)同增效作用。韓乾杰等[15]研究發(fā)現(xiàn)，肉桂醛與香蘭素組成的復(fù)合植物精油和丁酸鈉按照1∶1、1∶2、1∶3聯(lián)合對大腸桿菌、沙門氏菌和產(chǎn)氣莢膜梭菌的抑制效果顯著優(yōu)于復(fù)合植物精油，丁酸鈉能有效減少植物精油的用量。Cerisuelo等[16]研究發(fā)現(xiàn)，將低劑量的植物精油與丁酸鈉混合，對抑制沙門氏菌生長有很好的抑制效果。薩仁高娃[17]研究報道，0.05%百里香精油與海藻酸鹽復(fù)合涂膜處理可有效抑制鮮切瓜果上的大腸桿菌、霉菌和酵母菌的生長。本試驗結(jié)果顯示，由肉桂醛與丁香酚(W∶W=1∶2)組成的復(fù)合植物精油和由雙乙酸鈉與丁酸鈉(W∶W=3∶1)組成的復(fù)合有機酸鹽，按照1∶4或1∶5聯(lián)合配伍對黃曲霉菌和煙曲霉菌有很好的協(xié)同抑菌效果，可以顯著減少植物精油的用量。