基于高通量測(cè)序數(shù)據(jù)挖掘探討小鼠射血分?jǐn)?shù)保留心力衰竭的發(fā)病機(jī)制

尤紅俊,趙倩倩,任淑婷,刁佳宇,茍棋玲,董夢(mèng)雅

射血分?jǐn)?shù)保留心力衰竭(heart failure with preserved ejection fraction,HFpEF)是一種除以高血壓、心肌肥厚和舒張功能障礙為特征的血流動(dòng)力學(xué)紊亂之外,伴肥胖癥和糖尿病等參與的多系統(tǒng)綜合征,涉及心、肺、腎、骨骼肌、脂肪組織、血管系統(tǒng)、免疫和炎癥反應(yīng)等。隨著人均壽命延長(zhǎng),迄今為止其占心力衰竭總?cè)巳航?/3[1]。目前,心肌肥厚、心肌纖維化、興奮性收縮偶聯(lián)缺陷、肌節(jié)功能障礙、氧化-氮化應(yīng)激、微血管功能不全、炎癥、線粒體和代謝缺陷等多因素被認(rèn)為可能參與HFpEF 病理生理學(xué)過(guò)程[2]。因相關(guān)的并存疾病引起的表型復(fù)雜,其病理生理機(jī)制仍不甚清楚,故也缺乏針對(duì)病因及機(jī)制的有效治療措施,其死亡率仍偏高,2 年內(nèi)全因死亡率約35%,造成嚴(yán)重的社會(huì)經(jīng)濟(jì)學(xué)問(wèn)題[3]。因而,探討其發(fā)病機(jī)制將有助于臨床診療工作。

既往關(guān)于HFpEF 的基礎(chǔ)研究多基于高血壓、糖尿病或高齡等單一因素誘導(dǎo)的心臟舒張功能障礙;而高脂飲食聯(lián)合血管緊張素Ⅱ雙重因素誘導(dǎo)的HFpEF 動(dòng)物模型,可更近似模擬人群HFpEF 的復(fù)合表型,如糖脂代謝紊亂、氧化/氮化應(yīng)激等,且其機(jī)制探索性研究尚未見(jiàn)報(bào)道。本研究基于基因表達(dá)綜合數(shù)據(jù)庫(kù)(Gene Expression Omnibus,GEO)來(lái)源的HFpEF 模型小鼠左心室組織轉(zhuǎn)錄組高通量測(cè)序數(shù)據(jù),應(yīng)用生物信息學(xué)手段,尋找疾病差異表達(dá)基因(differentially expressed genes,DEGs),構(gòu)建蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用(protein-protein interaction,PPI)網(wǎng)絡(luò),鑒定核心基因,再進(jìn)行富集分析及疾病關(guān)聯(lián)性分析,探討HFpEF 發(fā)病機(jī)制,從而為疾病診療提供理論支持。

1 資料與方法

1.1 數(shù)據(jù)下載 在GEO 數(shù)據(jù)庫(kù)(www.ncbi.nlm.nih.gov/GEO)[4-5]中搜索“HFpEF”,獲取高通量轉(zhuǎn)錄譜測(cè)序數(shù)據(jù)集GSE153923,其來(lái)源于荷蘭赫布雷希特研究所發(fā)育生物學(xué)和干細(xì)胞研究系,由Withaar 等[6]研究者提供。該數(shù)據(jù)集以高脂飲食聯(lián)合血管緊張素Ⅱ干預(yù)雌性C57BL/6J 小鼠(18～22 月齡)構(gòu)建HFpEF 模型,作為實(shí)驗(yàn)組(樣本量為4),以月齡、體重匹配的雌性小鼠低脂飲食飼養(yǎng)作為對(duì)照組(樣本量為4),取左心室組織標(biāo)本進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序分析。采用GPL19057 Illumina NextSeq 500(Mus musculus)平臺(tái)。

1.2 差異表達(dá)基因分析 采用統(tǒng)計(jì)軟件R 語(yǔ)言(版本R 4.1.1)“DESeq2”包[7]進(jìn)行基因差異表達(dá)分析。以|log fold change|≥1,adjustedP＜0.05 為DEGs 的篩選條件,以R 語(yǔ)言“ggplot2”包(https://cran.r-project.org/web/packages/ggplot2/)繪制火山圖以可視化DEGs。

1.3 PPI 網(wǎng)絡(luò)分析 將DEGs 導(dǎo)入STRING(Search Tool for the Retrieval of Interacting Genes,http://string-db.org/cgi/input.pl)進(jìn)行PPI 網(wǎng)絡(luò)分析[8]。設(shè)定可信度(confidence)為0.4,輸出TSV 格式文件,用于后續(xù)Cytoscape 分析篩選核心基因[9]。

1.4 核心基因鑒定 使用Cytoscape 3.7.3 軟件插件CytoHubba (http://hub.iis.sinica.edu.tw/cytohubba/)篩選出PPI 網(wǎng)絡(luò)中的核心基因[10]。拓?fù)湓u(píng)分策略之一Degree 代表基因/蛋白間相互作用關(guān)系連通度,以Degree值排序前30 位的基因作為PPI 網(wǎng)絡(luò)中的核心基因。

1.5 基因本體(GO)和京都基因與基因組百科全書(shū)(KEGG)富集分析 使用R 語(yǔ)言對(duì)DEGs 和核心基因分別進(jìn)行GO(http://www.geneontology.org)和KEGG通路富集分析[11-12]。GO 富集分析分別在生物學(xué)過(guò)程(biological processes,BP)、細(xì)胞組分(cellular component,CC)和分子功能(molecular function,MF)3 個(gè)方面對(duì)基因進(jìn)行功能注釋[13]。利用R 語(yǔ)言“ggplot2”包將結(jié)果可視化。P＜0.05 被認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

1.6 核心基因與心力衰竭(舒張性)的相互作用 利用比較毒理基因組學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)(Comparative Toxicogenomics Database,CTD,http://ctdbase.org/)的數(shù)據(jù)分析核心基因與心力衰竭(舒張性)風(fēng)險(xiǎn)之間的關(guān)系。CTD 整合了包括化合物-基因/蛋白質(zhì)相互作用、化合物-疾病和基因-疾病關(guān)系在內(nèi)的信息,以探索與疾病發(fā)病機(jī)制相關(guān)的假設(shè)[14]。

2 結(jié) 果

2.1 基因差異表達(dá)分析 以Log(fold change)≥1,adjustedP＜0.05 為標(biāo)準(zhǔn),與對(duì)照組比較,HFpEF 小鼠左心室組織中337 個(gè)基因存在差異表達(dá),其中,212個(gè)表達(dá)上調(diào),125 個(gè)表達(dá)下調(diào)?；虿町惐磉_(dá)譜的火山圖見(jiàn)圖1。

圖1 差異基因表達(dá)譜的火山圖

2.2 DEGs 富集分析 DEGs GO 富集分析提示,在BP 方面,DEGs 主要參與細(xì)胞外結(jié)構(gòu)和基質(zhì)的構(gòu)成、損傷應(yīng)答和愈合、膠原纖維構(gòu)成、血液凝固和細(xì)胞趨化性等;在CC 方面,DEGs 主要參與細(xì)胞外基質(zhì)、含膠原的細(xì)胞外基質(zhì)、細(xì)胞外基質(zhì)成分、膠原三聚體和帶狀膠原纖維等;在MF 方面,DEGs 主要參與細(xì)胞外基質(zhì)結(jié)構(gòu)成分、糖胺聚糖結(jié)合、受體配體活性、纖連蛋白結(jié)合和肝素結(jié)合等。詳見(jiàn)圖2。

圖2 DEGs GO 富集分析部分可視化(氣泡圖)

DEGs KEGG 富集分析提示,DEGs 參與細(xì)胞外基質(zhì)-受體相互作用、黏著斑、磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B(PI3K-Akt)、血小板活化、糖尿病并發(fā)癥中的晚期糖化終產(chǎn)物(AGEs)及其受體(RAGE)、缺氧誘導(dǎo)因子(hypoxia-inducible factor,HIF)1 等信號(hào)通路中。詳見(jiàn)圖3。

圖3 DEGs KEGG 富集分析部分可視化(氣泡圖)

2.3 PPI 網(wǎng)絡(luò)及核心基因鑒定 對(duì)337 個(gè)DEGs 采用STRING 在線數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行PPI 網(wǎng)絡(luò)分析,構(gòu)建PPI 網(wǎng)絡(luò),隱去離散節(jié)點(diǎn)后,所構(gòu)建的PPI 網(wǎng)絡(luò)中節(jié)點(diǎn)(蛋白數(shù))321 個(gè)、邊數(shù)(蛋白間作用關(guān)系)1 183 條,平均節(jié)點(diǎn)度值為7.37,PPI 富集P值＜1.0e-16。輸出TSV 格式文件并導(dǎo)入Cytoscape 軟件,進(jìn)行cytoHubba 運(yùn)算,篩選出Degree 值排名前30 位及與其直接作用的節(jié)點(diǎn),構(gòu)成子網(wǎng)絡(luò),節(jié)點(diǎn)數(shù)為128 個(gè),邊數(shù)為998 條,詳見(jiàn)圖4。Degree 值排名前30 位的鑒定為核心基因,即Fn1、Mki67、Mmp9、Col1a1、Ctgf、Col1a2、Col3a1、Timp1、Cdk1、Hmmr、Foxm1、Racgap1、Ckap2、Spag5、Ncapg、Cenpe、Fbn1、Spp1、Thbs1、Shcbp1、Cdca3、Ckap2l、Tpx2、Cenpf、Kif20a、Cep55、Prc1、Ect2、Lox 和Anln。

圖4 DEGs 構(gòu)成的PPI 網(wǎng)絡(luò)中鑒定核心基因

2.4 核心基因富集分析 核心基因GO 分析提示,BP方面,顯著富集的子集包括有絲分裂、胞質(zhì)分裂和細(xì)胞骨架依賴性胞質(zhì)分裂等;CC 方面,核心基因主要參與構(gòu)成有絲分裂紡錘體、含膠原的細(xì)胞外基質(zhì)和細(xì)胞外基質(zhì)等;在MF 方面,主要參與微管結(jié)合、細(xì)胞黏附分子結(jié)合和賦予拉伸強(qiáng)度的細(xì)胞外基質(zhì)結(jié)構(gòu)成分等。詳見(jiàn)圖5。

圖5 核心基因GO 富集分析部分可視化(氣泡圖)

核心基因KEGG 富集分析提示,核心基因參與細(xì)胞外基質(zhì)-受體相互作用、黏著斑、糖尿病并發(fā)癥中的AGE-RAGE、PI3K-Akt、血 小 板 活化、轉(zhuǎn)化生 長(zhǎng) 因 子(TGF)-β和p53 等信號(hào)通路中。詳見(jiàn)圖6。

圖6 核心基因KEGG 富集分析部分可視化(氣泡圖)

2.5 核心基因與心力衰竭(舒張性)的相互作用關(guān)聯(lián)性分析 本研究利用CTD 數(shù)據(jù)庫(kù)分析核心基因與心力衰竭(舒張性)風(fēng)險(xiǎn)之間的關(guān)系。核心基因與心力衰竭(舒張性)的相互作用關(guān)聯(lián)性分析所示,Col1a1、Fn1、Mmp9、Timp1、Spp1、Col3a1、Cdk1 和Thbs1 等與心力衰竭(舒張性)關(guān)聯(lián)性評(píng)分較高。詳見(jiàn)圖7。

圖7 CTD 數(shù)據(jù)庫(kù)中核心基因與心力衰竭(舒張性)關(guān)聯(lián)性評(píng)分

3 討 論

HFpEF 是一種表型極其復(fù)雜的疾病綜合征,涉及炎癥、氧化應(yīng)激、心肌肥厚/纖維化、代謝紊亂等,病理機(jī)制研究仍不甚透徹,且缺乏特效治療。故進(jìn)一步探索其致病機(jī)制有著深遠(yuǎn)的意義。本研究基于GEO 數(shù)據(jù)進(jìn)行生物信息學(xué)分析,有助于為疾病的防治提供理論支持。

HFpEF 的發(fā)生發(fā)展涉及多種基因表達(dá)調(diào)控失衡。本研究發(fā)現(xiàn)HFpEF 小鼠心肌組織中337 個(gè)基因表達(dá)存在顯著性差異。富集分析提示DEGs 在細(xì)胞外結(jié)構(gòu)和基質(zhì)的構(gòu)成、損傷應(yīng)答和愈合、膠原纖維構(gòu)成、血液凝固、細(xì)胞趨化性、膠原纖維、糖胺聚糖結(jié)合、受體配體活性、纖連蛋白結(jié)合和肝素結(jié)合等不同GO 子集方面發(fā)揮重要作用。KEGG 提示DEGs 參與細(xì)胞外基質(zhì)-受體相互作用、黏著斑、PI3K-Akt、血小板活化、AGERAGE、HIF-1 等。在HFpEF 中,內(nèi)皮細(xì)胞在炎癥、應(yīng)激或損傷刺激下可分泌促炎因子,促進(jìn)單核細(xì)胞黏附、遷移及分化為巨噬細(xì)胞。而巨噬細(xì)胞可分泌多種介質(zhì)和促炎細(xì)胞因子驅(qū)動(dòng)靜止的成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化為增殖和基質(zhì)合成活躍的肌成纖維細(xì)胞,后者持續(xù)激活產(chǎn)生細(xì)胞外基質(zhì)蛋白如膠原蛋白等,促使心肌肥大僵硬而出現(xiàn)舒張性功能障礙。本研究分析發(fā)現(xiàn),DEGs 參與這些生物學(xué)過(guò)程及細(xì)胞外基質(zhì)-受體相互作用、黏著斑信號(hào)通路,與HFpEF 病理生理學(xué)過(guò)程相符合。同時(shí),PI3K-Akt 通路在HFpEF 中激活,PI3K-Akt 在調(diào)節(jié)心肌細(xì)胞生長(zhǎng)、心肌血管生成和細(xì)胞死亡中起重要作用。胰島素樣生長(zhǎng)因子1(IGF1)-PI3K-Akt 信號(hào)通路在調(diào)節(jié)運(yùn)動(dòng)誘導(dǎo)的生理性心臟肥大和心臟保護(hù)中發(fā)揮關(guān)鍵作用[15];增加的PI3K 活性對(duì)心臟功能和纖維化有利并削弱病理性生長(zhǎng)[16]。也有研究發(fā)現(xiàn),通過(guò)主動(dòng)脈橫向縮窄建立的兔舒張性心力衰竭模型中,黏著斑和PI3K-Akt 通路被激活[17];在高脂聯(lián)合N-ω-硝基-l-精氨酸甲酯(L-NAME)飼養(yǎng)誘導(dǎo)的HFpEF 小鼠模型甲基化研究中,PI3K-Akt 信號(hào)通路同樣被激活[18],這些進(jìn)一步證實(shí)了本研究分析結(jié)果的可靠性及PI3K-Akt 信號(hào)通路在HFpEF 發(fā)生發(fā)展中的重要作用。心力衰竭是一種促血栓狀態(tài),心力衰竭病人血小板及血管對(duì)一氧化氮(NO)的應(yīng)答被削弱;與健康個(gè)體相比,NO 供體硝普鈉對(duì)血小板聚集的抑制在HFpEF-心房顫動(dòng)病人中受損[19]。HFpEF 多伴有肥胖、糖尿病等表型,兩者都可能導(dǎo)致炎癥和纖維化心房和心室肌病的發(fā)展,是全身性血栓栓塞的危險(xiǎn)因素[20]。經(jīng)分析提示HFpEF 小鼠DEGs 參與血液凝固、血小板活化通路,該通路中富集的 DEGs 可能在 HFpEF 血栓事件中起作用。HFpEF 血糖代謝異常,晚期糖化終產(chǎn)物在體內(nèi)積聚并作用于受體,促進(jìn)成纖維細(xì)胞向肌成纖維細(xì)胞的分化,進(jìn)而觸發(fā)下游細(xì)胞外基質(zhì)的重塑、炎癥和氧化應(yīng)激等一系列病理過(guò)程[21]。富集于AGE-RAGE 信號(hào)通路中的DEGs 可能影響HFpEF 的進(jìn)程。HIF-1α是一種高度保守的轉(zhuǎn)錄因子,在組織對(duì)缺氧的反應(yīng)中起關(guān)鍵作用,在肥胖病人的脂肪組織中表達(dá)增加,導(dǎo)致膠原蛋白Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ和賴氨酰氧化酶等促纖維化轉(zhuǎn)錄程序上調(diào);HIF-1α也可介導(dǎo)肥胖相關(guān)炎癥的M1 巨噬細(xì)胞募集,釋放炎性細(xì)胞因子,并增加膠原蛋白、TGF-β和結(jié)締組織生長(zhǎng)因子等的表達(dá)。這些綜合因素加速心臟纖維化并損害心臟舒張功能;而抑制高脂飲食小鼠脂肪組織中HIF-1α的表達(dá)可抑制纖維化并減少脂肪組織中的炎癥[22]。本研究發(fā)現(xiàn)DEGs 參與HIF-1 通路,提示HIF-1α通路可能是促成HFpEF 的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。

為進(jìn)一步剖析DEGs 在HFpEF 發(fā)病機(jī)制中的作用,本研究構(gòu)建PPI 網(wǎng)絡(luò),篩選出核心基因,即Fn1、Mki67、Mmp9、Col1a1、Ctgf、Col1a2、Col3a1、Timp1、Cdk1、Hmmr、Foxm1、Racgap1、Ckap2、Spag5、Ncapg、Cenpe、Fbn1、Spp1、Thbs1、Shcbp1、Cdca3、Ckap2l、Tpx2、Cenpf、Kif20a、Cep55、Prc1、Ect2、Lox 和Anln。并對(duì)核心基因進(jìn)行富集分析。研究表明,持續(xù)的壓力導(dǎo)致心臟重塑,其中,心肌細(xì)胞死亡超過(guò)更新,導(dǎo)致進(jìn)行性心力衰竭;在多數(shù)情況下,心肌細(xì)胞中的有絲分裂可能代表干細(xì)胞的成熟后代;心肌細(xì)胞更新可能主要由內(nèi)源性心臟干細(xì)胞和血源性干細(xì)胞介導(dǎo),但這種生物學(xué)現(xiàn)象的能力有限[23]。核心基因參與有絲分裂胞質(zhì)分裂,提示可能為心肌損傷后代償。核心基因參與細(xì)胞外基質(zhì)、微管結(jié)合、細(xì)胞黏附分子結(jié)合和賦予拉伸強(qiáng)度的細(xì)胞外基質(zhì)結(jié)構(gòu)成分等,與之前的分析符合,提示HFpEF 中存在活躍的結(jié)構(gòu)重塑。與DEGs 通路富集相比,核心基因還參與TGF-β等信號(hào)通路中。TGF-β信號(hào)通路在心力衰竭發(fā)生發(fā)展中有著極其重要的作用。在HFpEF 中,TGF-β信號(hào)傳導(dǎo)參與病理性肥大和纖維化的發(fā)展。核心基因Thbs1 和Fbn1 參與該通路。Thbs1 是TGF-β通路激活的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子,體外實(shí)驗(yàn)已證明,miR-221 可靶向抑制Thbs1 蛋白表達(dá),進(jìn)而抑制TGF-β信號(hào)通路的激活,削弱肌成纖維細(xì)胞活化、膠原蛋白分泌和心肌纖維化[24],提示該基因可能作為HFpEF 的治療靶點(diǎn)。Fbn1 家族包括潛在的TGF-β結(jié)合蛋白等成員,在體外控制TGF-β1的釋放、靶向和激活,并且還作為富含原纖維蛋白的微纖維的結(jié)構(gòu)成分發(fā)揮作用[25],在動(dòng)脈損傷應(yīng)答中起關(guān)鍵作用,但其在HFpEF 中的作用尚未見(jiàn)報(bào)道。

本研究還利用CTD 數(shù)據(jù)庫(kù)將核心基因與心力衰竭(舒張性)的相互作用進(jìn)行關(guān)聯(lián)性分析,關(guān)聯(lián)性評(píng)分較高的為Col1a1、Fn1、Mmp9、Timp1、Spp1、Col3a1、Cdk1 和Thbs1 等。這些基因單一或多個(gè)同時(shí)參與細(xì)胞外基質(zhì)-受體相互作用、黏著斑、PI3K-Akt、血小板活化、AGE-RAGE、血小板活化、HIF-1 等信號(hào)通路中,與心力衰竭發(fā)生相關(guān)。Hua 等[26]發(fā)現(xiàn)Col1a1 可能是心力衰竭的血漿生物標(biāo)志物,與心力衰竭進(jìn)展相關(guān),且可預(yù)測(cè)從心力衰竭發(fā)病到心臟移植后1 年生存率。通過(guò)腹主動(dòng)脈縮窄構(gòu)建的小鼠壓力過(guò)載性舒張性心力衰竭中,氧化還原失衡,基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)-2/9 的表達(dá)活性增加,膠原蛋白Col1a1 降解增加,從而誘發(fā)心力衰竭;而MMP 對(duì)Col1a1 基因的切割位點(diǎn)發(fā)生突變后可改善上述病理狀態(tài)[27]。纖連蛋白(Fn1 編碼)和膠原蛋白alpha-1(Ⅲ)鏈(Col3a1 編碼)均屬于細(xì)胞外基質(zhì)成分;在壓力過(guò)載性小鼠模型中使用骨橋蛋白(Spp1 編碼)治療可預(yù)防心肌細(xì)胞肥大和心臟纖維化,阻斷PI3K-Akt 通路磷酸化,降低纖連蛋白和膠原蛋白alpha-1(Ⅲ)鏈等的表達(dá),預(yù)防心力衰竭[28]。金屬蛋白酶組織抑制劑1(Timp1 編碼)是MMPs 的特異性抑制劑,與MMPs 共同作為細(xì)胞外基質(zhì)組成的關(guān)鍵調(diào)節(jié)劑,由于其動(dòng)態(tài)活性,可作為HFpEF 心肌纖維化及心臟功能的預(yù)后指標(biāo)[29]。重塑特異性標(biāo)志物骨橋蛋白(Spp1 編碼)可預(yù)測(cè)HFpEF 病人18 個(gè)月時(shí)的全因死亡率和/或心力衰竭相關(guān)再住院率[30]。氧化應(yīng)激是HFpEF 的表型之一,其誘導(dǎo)心肌細(xì)胞周期停滯,導(dǎo)致心肌細(xì)胞丟失;而補(bǔ)充硒劑可通過(guò)激活PI3K-Akt 通路使細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶1(Cdk1 編碼)表達(dá)增加,削弱氧化應(yīng)激對(duì)心力衰竭的影響。其余核心基因也可能涉及HFpEF 發(fā)病機(jī)制,值得進(jìn)一步探討。

綜上所述,本研究基于轉(zhuǎn)錄譜數(shù)據(jù)挖掘進(jìn)行研究,有助于進(jìn)一步了解HFpEF 發(fā)病機(jī)制,為疾病防治及后續(xù)科研提供一定的理論支持。但本研究也存在一定局限性,比如未能針對(duì)某一功能集或通路內(nèi)的DEGs 進(jìn)一步深度探討,這也是后續(xù)研究的方向。另外,HFpEF差異表達(dá)基因豐富,DEGs 參與眾多生物學(xué)功能和/或信號(hào)通路,本研究未能針對(duì)所有DEGs 及可能涉及的機(jī)制展開(kāi)討論。