參蛤散對H9c2 心肌細(xì)胞增殖的影響

邱伯雍,魏易洪,苑素云,毛美嬌,曹 敏,周 端,鄧 兵,沈 琳

參蛤散是中醫(yī)經(jīng)典方劑,本課題組在前期研究中發(fā)現(xiàn)該方可以改善心功能[1]、舒張主動脈[2]、減輕心肌氧化應(yīng)激[3],并能保護(hù)心臟線粒體功能[4]。在臨床試驗和動物實驗等方面均證實了參蛤散具有很好的抗心力衰竭作用[5]。但在細(xì)胞研究水平,目前尚未見參蛤散相關(guān)的較多報道。H9c2 心肌細(xì)胞是常用的心肌細(xì)胞株,多用于藥理及信號通路機(jī)制等研究。本實驗擬采用H9c2 心肌細(xì)胞為研究對象,同時制備參蛤散凍干粉進(jìn)行干預(yù),使用細(xì)胞計數(shù)試劑盒-8(CCK-8)法檢測細(xì)胞吸光度值(OD 值),細(xì)胞劃痕實驗檢測細(xì)胞遷移率,探討參蛤散對H9c2 心肌細(xì)胞增殖的作用,為后續(xù)進(jìn)一步研究參蛤散的藥效及藥理機(jī)制作鋪墊。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞 大鼠心肌細(xì)胞(H9c2)購自中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞資源中心。

1.2 藥物與試劑 人參購自上海上藥神象健康藥業(yè)公司(批號:180702);蛤蚧購自上海雷允上藥業(yè)西區(qū)有限公司(批號:190812)。參蛤散凍干粉制備:蛤蚧去頭足,加入3 倍蛤蚧質(zhì)量的人參,再加入5 倍干藥質(zhì)量的一級純水,煎煮2 遍,過濾藥液后濃縮。濃縮液裝入凍干機(jī)中制備凍干粉,加入等重DMEM 配成參蛤散凍干粉溶液,用0.22μm 微孔濾膜(MILLEXGP)過濾,配成1 g/mL的母液,置于-20 ℃冰箱保存。CCK-8 購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司。

1.3 實驗儀器 LGJ-10D 冷凍干燥機(jī)(北京四環(huán)科學(xué)儀器廠有限公司);多功能酶標(biāo)儀(美國Thermo 公司);ECLIPSE Ti2 TI-E 倒置式熒光顯微鏡(日本尼康公司);37 ℃培養(yǎng)箱(德國Heraues 公司)。

1.4 實驗方法

1.4.1 細(xì)胞培養(yǎng)及分組 將H9c2 心肌細(xì)胞培養(yǎng)于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中,待細(xì)胞生長到約80%融合時使用0.25%胰蛋白酶消化進(jìn)行傳代,平均約3 d 傳1 代。細(xì)胞傳代后,設(shè)立對照組(未作處理),參蛤散不同濃度組(0.5%DMEM 將參蛤散凍干粉母液稀釋成0.01 mg/mL、0.03 mg/mL、0.10 mg/mL、0.30 mg/mL、1.00 mg/mL)。

1.4.2 OD 值檢測 將對數(shù)生長期H9c2 細(xì)胞接種于96 孔板,每孔1×104個細(xì)胞,于10%DMEM 培養(yǎng)液、37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h 后,更換成0.5%DMEM 培養(yǎng)液以及不同濃度參蛤散溶液,于24 h、48 h、72 h 各時間點(每24 h 更換新培養(yǎng)液及藥液)抽掉細(xì)胞培養(yǎng)液,每孔加入100 μL 的CCK-8 溶液,于培養(yǎng)箱培養(yǎng)1 h 后,用酶標(biāo)儀檢測細(xì)胞OD 值。

1.4.3 細(xì)胞劃痕實驗 將對數(shù)生長期H9c2 細(xì)胞接種于6 孔板,每孔5×105個細(xì)胞,于10%DMEM 培養(yǎng)液、37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h 后,用200μL 移液槍槍頭垂直孔板劃痕,磷酸鹽緩沖液(PBS)沖洗2次或3 次后,更換成0.5%DMEM 培養(yǎng)液以及不同濃度參蛤散溶液,于24 h、48 h、72 h 各時間點(每24 h 更換新培養(yǎng)液及藥液)進(jìn)行顯微鏡拍照。采用Image J軟件分析劃痕面積以計算細(xì)胞遷移率,細(xì)胞遷移率(%)=(0 h 劃痕面積―各時間點劃痕面積)/0 h 劃痕面積×100%。

1.5 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS 22.0 軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)處理。定量資料符合正態(tài)分布時以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示,組間數(shù)據(jù)比較采用單因素方差分析(One Way ANOVA)及最小顯著差異法(LSD )檢驗。以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 各時間點H9c2 心肌細(xì)胞OD 值 24 h 參蛤散0.03 mg/mL、0.10 mg/mL、0.30 mg/mL、1.00 mg/mL 組OD值高于對照組(P＜0.05);48 h 參蛤散各濃度組OD值均高于對照組(P＜0.05);72 h 參蛤散0.01 mg/mL組OD 值高于對照組(P＜0.05)。詳見表1、圖1。

圖1 各組H9c2 心肌細(xì)胞OD 值

表1 各組H9c2 心肌細(xì)胞OD 值(±s)

表1 各組H9c2 心肌細(xì)胞OD 值(±s)

與對照組比較,①P ＜0.05。

組別 24 h 48 h 72 h對照組 0.72±0.03 0.81±0.02 0.89±0.03參蛤散0.01 mg/mL 組 0.70±0.03 0.93±0.03① 0.94±0.03①參蛤散0.03 mg/mL 組 0.78±0.03① 1.02±0.02① 0.92±0.03參蛤散0.10 mg/mL 組 0.78±0.03① 1.02±0.05① 0.90±0.02參蛤散0.30 mg/mL 組 0.80±0.02① 0.97±0.06① 0.86±0.02參蛤散1.00 mg/mL 組 0.81±0.02① 1.00±0.05① 0.89±0.04

2.2 各時間點H9c2 心肌細(xì)胞遷移情況 24 h 參蛤散0.10 mg/mL、0.30 mg/mL、1.00 mg/mL 組細(xì)胞遷移率大于對照組(P＜0.05);48 h 參蛤散0.01 mg/mL、0.10 mg/mL、0.30 mg/mL 組細(xì)胞遷移率大于對照組(P＜0.05);72 h 參蛤散0.01 mg/mL、0.30 mg/mL 組細(xì)胞遷移率大于對照組(P＜0.05)。詳見表2、圖2、圖3。

表2 各組H9c2 細(xì)胞遷移率 單位:%

圖2 各組H9c2 細(xì)胞遷移率情況

圖3 各組H9c2 細(xì)胞遷移情況

3 討 論

據(jù)估算,我國目前心血管病患病人數(shù)約2.9 億例,其死亡率占居民疾病死亡構(gòu)成40%以上,高于其他疾病,居于首位,是重大的公共衛(wèi)生問題,而心力衰竭病人約450 萬例,且患病率隨年齡增加顯著上升[6]。心力衰竭是各種心血管疾病的終末階段,最主要病因是原發(fā)性心肌損害和異常[7]。因此,保護(hù)心肌細(xì)胞、改善心臟功能是重要的研究方向。中醫(yī)學(xué)中沒有“心力衰竭”這個名詞,根據(jù)臨床癥狀通常納入“喘證”“心悸”“胸痹”等范疇。在中醫(yī)理論“異病同治”“心肺同治”理論指導(dǎo)下,本課題組周端教授提倡使用參蛤散進(jìn)行心力衰竭的治療,并且進(jìn)行了各項臨床及基礎(chǔ)研究,得到了較好的結(jié)果。

通常來說,中藥由于其成分的多樣性和制劑的復(fù)雜性,進(jìn)行體外的細(xì)胞實驗較為麻煩,常用的方法有使用藥物血清制備中藥凍干粉、中藥提取物等方法。本次實驗中,使用參蛤散凍干粉進(jìn)行心肌細(xì)胞的體外實驗,發(fā)現(xiàn)各濃度參蛤散對H9c2 細(xì)胞并無毒性,而在干預(yù)后24 h、48 h 和72 h 等各時間點很多藥物組的存活率高于對照組,說明參蛤散有一定的促進(jìn)H9c2 細(xì)胞生存的作用。另外,細(xì)胞劃痕實驗又稱為“細(xì)胞損傷修復(fù)實驗”,不僅可以觀察細(xì)胞遷移功能,亦可觀察細(xì)胞的增殖情況。在此次劃痕實驗中,發(fā)現(xiàn)一些參蛤散藥物組的細(xì)胞遷移率明顯高于對照組,并在24 h 和48 h尤為明顯,這說明參蛤散在一定濃度下可以促進(jìn)H9c2細(xì)胞的增殖。因此,可以認(rèn)為參蛤散具有促進(jìn)H9c2細(xì)胞增殖的作用。當(dāng)然,CCK-8 檢測和細(xì)胞劃痕實驗的結(jié)果在時間點和藥物濃度等方面略微有差異,這可能與不同的實驗和統(tǒng)計方法有關(guān)。

參蛤散由人參和蛤蚧組成,其促進(jìn)H9c2 細(xì)胞增殖作用的具體機(jī)制還需后續(xù)研究進(jìn)一步探討?，F(xiàn)已有諸多研究表明人參可以促進(jìn)血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)表達(dá),如人參皂苷F1 可以通過激活胰島素樣生長因子-1(IGF-1)/IGF-1 受體(IGF1R)通路促進(jìn)VEGF 表達(dá)[8],人參皂苷Rg1 亦可通過miR-214/內(nèi)皮型一氧化氮合酶(eNOS)通路促進(jìn)血管內(nèi)皮生長因子受體-2(VEGFR-2)表達(dá)以提高VEGF 功能[9]。魏英等[10]亦發(fā)現(xiàn),人參總皂苷可明顯促進(jìn)急性心肌梗死大鼠心臟功能恢復(fù),機(jī)制與上調(diào)心肌組織VEGF 有關(guān);張慶勇等[11]在冠狀動脈結(jié)扎的急性心肌缺血大鼠模型中,發(fā)現(xiàn)人參皂苷Rg1 可促進(jìn)大鼠急性缺血心肌血管再生,亦與VEGF 有關(guān)。而在本課題組前期研究中,發(fā)現(xiàn)人參水煎液和蛤蚧水煎液都能不同程度地促進(jìn)斑馬魚血管生長,且可能與VEGF 通路有關(guān)[12-13]。因此,參蛤散可能上調(diào)VEGF 通路。當(dāng)然,其是否通過VEGF通路促進(jìn)H9c2 細(xì)胞的增殖最終還需要后續(xù)的實驗進(jìn)一步加以探索。