基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)及分子對接研究石菖蒲-郁金藥對治療冠心病合并焦慮/抑郁的作用機(jī)制

張心慈,王鳳榮

冠狀動脈粥樣硬化性心臟病(coronary heart disease,CHD)又稱冠心病,是動脈粥樣硬化引起冠狀動脈血管狹窄或堵塞造成心肌缺血、缺氧或壞死的一種缺血性心臟病[1]。心臟冠狀動脈病變引起心排血量減少,可表現(xiàn)為前胸壓榨性疼痛或憋悶感覺,導(dǎo)致病人內(nèi)心恐懼、擔(dān)憂,進(jìn)而引發(fā)焦慮[2]。同時,長期的緊張和焦慮情緒會影響心血管病病人的康復(fù)進(jìn)程和生活質(zhì)量[3-4]。冠心病病人的心臟癥狀與焦慮、抑郁等情緒變化相互影響,交織為病,此即為中醫(yī)學(xué)“雙心疾病”[5]。

冠心病可歸屬于中醫(yī)的“胸痹”“真心痛”范疇,焦慮、抑郁狀態(tài)可歸屬于中醫(yī)的“郁證”“臟躁”“百合病”范疇。冠心病合并焦慮/抑郁狀態(tài)的中醫(yī)基本病機(jī)可為氣血失調(diào),從而導(dǎo)致痰飲、瘀血等主要病理產(chǎn)物阻滯脈絡(luò),其病性虛實(shí)夾雜,治療應(yīng)重在調(diào)肝、健脾、養(yǎng)心,久病遷延不愈予以補(bǔ)腎調(diào)治。在臨床治療方面,針對“雙心疾病”,西藥治療靶點(diǎn)單一,很難對疾病進(jìn)行全方位的干預(yù),同時病人多難以忍受抗焦慮或抗抑郁藥物的不良反應(yīng)和成癮性等。中藥具備整體調(diào)節(jié)的特點(diǎn),副作用小,且療效顯著。藥對不僅是中藥配伍的基本形式,也是方藥之間的橋梁。石菖蒲、郁金藥對出自《溫病全書》中的菖蒲郁金湯,具有清熱化痰、通竅利濕之功,主治痰熱蒙蔽心包,神昏譫語之證。

王鳳榮教授常運(yùn)用自擬方參七解郁顆粒治療“雙心疾病”,本研究選取其中君臣石菖蒲-郁金藥對,采取網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法,對石菖蒲-郁金治療冠心病合并焦慮/抑郁狀態(tài)的潛在作用靶點(diǎn)進(jìn)行分析,對其作用機(jī)制進(jìn)行系統(tǒng)研究。

1 資料與方法

1.1 石菖蒲-郁金活性成分的挖掘與篩選 通過中藥系統(tǒng)藥理學(xué)分析平臺(TCMSP,https://old.tcmsp-e.com/tcmsp.php)數(shù)據(jù)庫將石菖蒲、郁金兩味中藥分別進(jìn)行檢索,篩選同時符合口服生物利用度(OB)≥30%、藥物相似性(DL)≥0.18 兩個條件,得到其各自的活性成分,并通過TCMSP 查找成分對應(yīng)的靶點(diǎn)。應(yīng)用UniProt(http://www.uniprot.org)數(shù)據(jù)庫獲得所有對應(yīng)靶點(diǎn)信息的基因名并校正。

1.2 挖掘冠心病合并焦慮/抑郁疾病靶點(diǎn) 通過GeneCards(https://www.genecards.org)數(shù)據(jù)庫以“coronary heart disease”“depression”“anxiety disorder”為關(guān)鍵詞檢索收集疾病相關(guān)的基因。應(yīng)用Uniprot 數(shù)據(jù)庫對蛋白靶點(diǎn)數(shù)據(jù)實(shí)施標(biāo)準(zhǔn)化處理。之后利用Venny 2.1.0 在線工具得到兩者的交集靶點(diǎn),繪制出韋恩圖。

1.3 藥物-活性成分-交集靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建與分析 采用Cytoscape 3.9.0 軟件將以上所得的石菖蒲-郁金活性成分以及與疾病的交集靶點(diǎn)進(jìn)行可視化處理,構(gòu)建藥物-活性成分-交集靶點(diǎn)相互作用網(wǎng)絡(luò)圖,并對其進(jìn)行分析。

1.4 蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用(PPI)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建與關(guān)鍵靶點(diǎn)的篩選 將篩選得到的交集靶點(diǎn)上傳到STRING(https://cn.string-db.org/)數(shù)據(jù)庫進(jìn)行PPI 網(wǎng)絡(luò)分析,得到相互作用網(wǎng)絡(luò)圖。將獲得的數(shù)據(jù)利用R 語言軟件根據(jù)Count 值排名前30 位得到關(guān)鍵靶點(diǎn)并制作柱狀圖。

1.5 基因本體(GO)富集分析及京都基因與基因組百科全書(KEGG)通路富集分析 通過Metascape 數(shù)據(jù)庫對交集靶點(diǎn)實(shí)施GO 富集分析和KEGG 通路分析。GO 分析包括生物過程(BP)、分子功能(MF)和細(xì)胞成分(CC)。以P≤0.01 為篩選條件,按照P值降序,選取各分析結(jié)果的前10 位繪制柱狀圖和氣泡圖。

1.6 活性成分與關(guān)鍵靶點(diǎn)的分子對接驗(yàn)證 選取靶點(diǎn)連接數(shù)目前3 位的活性成分作為配體,PPI 網(wǎng)絡(luò)中Count 值前3 位的靶點(diǎn)作為受體,進(jìn)行分子對接。通過RCSB 數(shù)據(jù)庫(http://www.rcsb.org/)下載靶點(diǎn)蛋白的三維晶體結(jié)構(gòu),并以pdb 格式進(jìn)行保存。通過Pubchem 數(shù)據(jù)庫(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)下載候選化合物的3D 化學(xué)結(jié)構(gòu)以sdf 格式保存,通過Open Babe 2.4.1 將其轉(zhuǎn)換為mol2 格式,再利用AutodockTools 1.5.7 轉(zhuǎn)換為pdbqt 格式文件。利用pymol 軟件將靶點(diǎn)蛋白結(jié)構(gòu)去除水分子、提取配體、確定對接box 大小和去除雜質(zhì),再利用Autodock vina 加氫、加電荷并保存為pdbqt 格式文件。利用Autodock vina進(jìn)行分子對接并將結(jié)果可視化處理,以對接評分結(jié)合能來篩選結(jié)合活性較好的活性成分與靶點(diǎn)。

2 結(jié) 果

2.1 石菖蒲-郁金藥對活性成分及其靶點(diǎn)篩選 通過TCMSP 數(shù)據(jù)庫檢索,篩選后得到石菖蒲主要化學(xué)成分4 個、郁金15 個,無重復(fù)項(xiàng),共獲得有效活性成分19 個,刪除無對應(yīng)靶點(diǎn)信息的活性成分后共計(jì)7 個(見表1)。經(jīng)過UniProt 數(shù)據(jù)庫校正后,通過轉(zhuǎn)換得到石菖蒲-郁金作用靶點(diǎn)113 個。

表1 石菖蒲、郁金主要有效活性成分基本信息

2.2 冠心病合并焦慮/抑郁狀態(tài)疾病靶點(diǎn)篩選 采用GeneCards 數(shù)據(jù)庫,分別對冠心病、焦慮癥、抑郁癥的靶點(diǎn)進(jìn)行收集,輸入數(shù)據(jù)庫搜索的疾病名稱“coronary heart disease”“anxiety disorder”“depression”檢索獲得冠心病靶點(diǎn)7 719 個、焦慮癥靶點(diǎn)5 592 個、抑郁癥靶點(diǎn)12 902 個。將冠心病靶點(diǎn)與焦慮癥靶點(diǎn)取交集,共計(jì)2 603 個,將冠心病靶點(diǎn)與抑郁癥靶點(diǎn)取交集,共計(jì)4 535 個,整合冠心病合并焦慮/抑郁去除重復(fù)項(xiàng),最終獲得疾病靶點(diǎn)數(shù)量共計(jì)4 657 個。將藥物靶點(diǎn)與疾病作用靶點(diǎn)整合,取得石菖蒲-郁金藥對治療冠心病合并焦慮/抑郁交集靶點(diǎn)100 個。詳見圖1。

圖1 石菖蒲-郁金藥對與冠心病合并焦慮/抑郁的韋恩圖

2.3 藥物-活性成分-交集靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建與分析 將得到的交集靶點(diǎn),通過Cytoscape 3.9.0 軟件繪制藥物-活性成分-交集靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖(見圖2)。該網(wǎng)絡(luò)圖中包含109 個節(jié)點(diǎn)和151 條邊,其中,正方形綠色節(jié)點(diǎn)代表藥物,六邊形藍(lán)色節(jié)點(diǎn)代表活性成分,圓形紅色節(jié)點(diǎn)代表交集靶點(diǎn),形狀越大、顏色越深代表其節(jié)點(diǎn)度值越高,每條邊代表藥物、活性成分與靶點(diǎn)之間的相互作用關(guān)系。由網(wǎng)絡(luò)圖分析可知,作用靶點(diǎn)較多的活性成分有山奈酚(kaempferol)、柚皮素(naringenin)、β-谷甾醇(beta-sitosterol)、8-異戊烯基山奈酚(8-Isopentenylkaempferol)等。

2.4 PPI 網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建與關(guān)鍵靶點(diǎn)的篩選 將獲得的100個交集靶點(diǎn)上傳至STRING 數(shù)據(jù)庫,設(shè)置物種為“Homo sapiens”,最小互作分?jǐn)?shù)值為0.9,隱藏不相關(guān)蛋白,取得相應(yīng)的蛋白相互作用信息,得到PPI 網(wǎng)絡(luò)互作圖(見圖3),根據(jù)Count 值獲得石菖蒲-郁金治療冠心病合并焦慮/抑郁排名前30 位的關(guān)鍵靶點(diǎn)(見圖4)。

圖3 疾病與藥物交集靶點(diǎn)的PPI 網(wǎng)絡(luò)圖

2.5 GO 功能富集分析和KEGG 通路富集分析 利用Metascape 平臺對石菖蒲-郁金治療冠心病合并焦慮/抑郁的交集靶點(diǎn)進(jìn)行功能及通路富集分析。GO 富集分析共得到1 605 個,包括BP 1 397 個、CC 85 個和MF 123 個。其中,BP、CC、MF log(P)值降序前10 位的GO 分析結(jié)果見圖5。BP 主要包括調(diào)節(jié)細(xì)胞對轉(zhuǎn)化生長因子β刺激的反應(yīng)(regulation of cellular response to transforming growth factor beta stimulus)、細(xì)胞周期相變的負(fù)調(diào)控(negative regulation of cell cycle phase transition)等。CC 主要包括Z 板(Z disc)、轉(zhuǎn)運(yùn)復(fù)合物(transporter complex)、頂端質(zhì)膜(apical plasma membrane)等。MF 主要包括細(xì)胞黏附分子結(jié)合(cell adhesion molecule binding)、電子轉(zhuǎn)移活性(electron transfer activity)等。

圖5 石菖蒲-郁金治療冠心病合并焦慮/抑郁的GO 分析圖

KEGG 富集分析共得到信號通路292 條,根據(jù)基因數(shù)目降序選取前10 條進(jìn)行KEGG 通路分析(見圖6)。通路主要包括癌癥通路(pathways in cancer)、丙肝通路(hepatitis C)、乙肝通路(hepatitis B)、EB 病毒感染通路(Epstein-Barr virus infection)、糖基化終末產(chǎn)物及其受體信號通路(AGE-RAGE signaling pathway in diabetic complications)、弓形體病(toxoplasmosis)、非酒精性脂肪肝(non-alcoholic fatty liver disease)、磷脂酰肌醇3-激酶-蛋白激酶B信號通路(PI3K-AKT signaling pathway)、腫瘤壞死因子信號通路(TNF signaling pathway)、流體剪切應(yīng)力與動脈粥樣硬化(fluid shear stress and atherosclerosis)。

圖6 石菖蒲-郁金治療冠心病合并焦慮/抑郁的KEGG 富集分析圖

2.6 分子對接 選取靶點(diǎn)連接數(shù)目前3 位的主要化學(xué)成分山奈酚、柚皮素、β-谷甾醇,分別與Count 值位于前3 位的核心基因靶點(diǎn)視黃醇類Ⅹ受體α(RXRA)、AKT1、絲裂原激活的蛋白激酶(MAPK)3 進(jìn)行分子對接(見表2),最終得到9 組受體-配體對接結(jié)果。其中,對接評分結(jié)合能＜-4.25 kcal/mol(-17.78 kJ/mol)可認(rèn)為配體與靶點(diǎn)之間具有結(jié)合活性,＜-5.0 kcal/mol(-20.9 kJ/mol)表明結(jié)合活性較佳,＜-7.0 kcal/mol(-29.3 kJ/mol)表明兩者之間有強(qiáng)烈的對接活性[6]。在9 組受體-配體結(jié)果中,結(jié)合能全部小于-5.0 kcal/mol(-20.9 kJ/mol),其中,6組結(jié)合能小于-7.0 kcal/mol(-29.3 kJ/mol)。對接得分最高的為:MAPK3-β-谷甾醇,分值為-10.1 kcal/mol(-42.3 kJ/mol);對接得分最低的為AKT1-柚皮素,分值為-5.5 kcal/mol(-23.0 kJ/mol)。這表明所篩選的潛在主要化合物與核心基因靶點(diǎn)之間具有較好的結(jié)合活性。對接結(jié)果可為今后進(jìn)一步開展相關(guān)中藥及成分的實(shí)驗(yàn)篩選設(shè)計(jì)提供數(shù)據(jù)支撐,分子對接結(jié)果見圖7。

表2 主要活性成分與核心靶點(diǎn)結(jié)合能 單位:kcal/mol

圖7 主要活性成分與核心靶點(diǎn)分子對接結(jié)果

3 討 論

當(dāng)前冠心病是導(dǎo)致全球心血管病人死亡的主要原因之一,且發(fā)病人群明顯呈年輕化趨勢,嚴(yán)重威脅人類的身體健康。冠心病病人常常伴發(fā)焦慮、抑郁等不良情緒,影響病人的生活質(zhì)量及疾病的遠(yuǎn)期預(yù)后,由此,西醫(yī)提出“雙心醫(yī)學(xué)”模式,不僅需要治療心血管疾病,更需要關(guān)注病人的心理狀況。但是針對“雙心疾病”,西藥治療靶點(diǎn)單一,且病人多難以忍受應(yīng)用傳統(tǒng)抗焦慮、抗抑郁藥物的不良反應(yīng),故遠(yuǎn)期療效較差。中藥治療“雙心疾病”具有整體調(diào)節(jié)的特點(diǎn),既有多成分、多靶點(diǎn)的優(yōu)勢,且副作用小、療效顯著。

藥對是中藥復(fù)方中最常見的配伍形式。石菖蒲和郁金配伍在臨床應(yīng)用十分廣泛。石菖蒲,《神農(nóng)本草經(jīng)》言其“主風(fēng)寒濕痹,咳逆上氣,開心孔,補(bǔ)五臟”[7]。其味辛、苦,性微溫,歸心、肝、脾經(jīng)[8]。具備開竅豁痰、醒神益智、化濕開胃等功效,主治痰閉神昏之證。郁金,《本草經(jīng)疏》曰:“郁金為血中之氣藥”,其味辛、苦,性寒,歸肝、心、肺經(jīng),具有活血止痛、行氣解郁、清心涼血等功效,主治氣滯血瘀諸痛證[9]。石菖蒲重在開竅,郁金重在解郁,二藥相配為伍,一溫一寒,一開一清,互相促進(jìn),祛熱利濕,滌痰宣竅,活血化瘀,疏肝理氣,使氣機(jī)順而解郁,痰濁去而機(jī)竅開,化瘀而氣血通,神志自可清明[10]?，F(xiàn)代研究證實(shí),石菖蒲可調(diào)節(jié)人體神經(jīng)和心血管系統(tǒng),對神經(jīng)系統(tǒng)的作用主要體現(xiàn)在保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞,興奮與抑制的雙向調(diào)節(jié)[11-12];對心血管系統(tǒng)的作用主要反映在降低血壓、防止異位起搏點(diǎn)、減少心律失常[12-13]。郁金所含的姜黃二酮有明顯的中樞神經(jīng)抑制作用[14-15]。

本研究結(jié)果可知,石菖蒲-郁金藥對主要通過重要的化合物山奈酚、柚皮素、β-谷甾醇、8-異戊烯基山柰酚等來發(fā)揮作用。有研究表明,山奈酚可以通過沉默調(diào)節(jié)因子1 介導(dǎo)的線粒體途徑,顯著增加Bcl-2 的表達(dá),起到對缺氧心肌細(xì)胞的保護(hù),同時,山奈酚可以有效降低血管炎癥反應(yīng),具有抑制動脈粥樣硬化發(fā)生的潛在功能[16]。通過實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了山奈酚具有抗大鼠抑郁的作用,能提高抑郁癥大鼠腦內(nèi)5-羥色胺(5-HT)、多巴胺(DA)、去甲腎上腺素(NA)水平[17]。有研究證明了柚皮素對動脈粥樣硬化進(jìn)展具有抑制作用[18]。柚皮素通過調(diào)節(jié)活性氧(ROS)水平、雌激素相關(guān)途徑和線粒體鉀通道對心肌細(xì)胞衰老損傷具有潛在的保護(hù)作用[19]。β-谷甾醇可通過增強(qiáng)抗氧化防御系統(tǒng)并有效降低血清膽固醇水平發(fā)揮心血管保護(hù)作用[20]。8-異戊烯基山奈酚擁有廣泛的生物活性,具有較強(qiáng)的心血管保護(hù)作用[21],其脂溶性比山奈酚大,更易透過血腦屏障,有利于其發(fā)揮抗抑郁的效果,有待后續(xù)的藥理實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證[22]。

本研究PPI 網(wǎng)絡(luò)表明,RXRA、AKT1、MAPK3、轉(zhuǎn)錄因子AP-1(JUN)、MAPK1、RELA 原癌基因(RELA)、雌激素受體1(ESR1)、MAPK14、細(xì)胞色素P450 1A1(CYP1A1)等是石菖蒲-郁金治療冠心病合并焦慮/抑郁的關(guān)鍵靶點(diǎn)。其中,AKT1 通過一系列下游底物來調(diào)節(jié)機(jī)體代謝、細(xì)胞存活、生長和血管生成過程[23]。免疫炎癥反應(yīng)與神經(jīng)細(xì)胞受損、凋亡在冠心病、抑郁癥和焦慮癥的發(fā)生發(fā)展中起著關(guān)鍵作用。MAPK1 作為炎癥常用通路中的一員為重要的炎癥評價指標(biāo),與炎癥的嚴(yán)重程度有密切關(guān)系[24],可參與冠心病的炎性反應(yīng),還可影響冠心病的脂代謝和凝血功能[25]。研究表明,JUN 在炎癥與細(xì)胞凋亡等應(yīng)激過程中發(fā)揮重要作用[26]。

GO 與KEGG 分析結(jié)果顯示,靶點(diǎn)基因主要富集在調(diào)節(jié)細(xì)胞對轉(zhuǎn)化生長因子β刺激的反應(yīng)、細(xì)胞周期相變的負(fù)調(diào)控、細(xì)胞形態(tài)發(fā)生參與神經(jīng)元分化等生物過程以及PI3K-AKT 信號通路、腫瘤壞死因子信號通路、流體剪切應(yīng)力與動脈粥樣硬化等信號通路。PI3K-AKT 信號通路是生物體中重要的信號傳導(dǎo)途徑,磷酸化的AKT 可以激活內(nèi)皮型一氧化氮合酶和熱休克蛋白,發(fā)揮保護(hù)心肌的作用[27]。研究表明,缺血預(yù)處理刺激可以激活心肌細(xì)胞中的PI3K/AKT 信號通路,從而發(fā)揮減輕細(xì)胞凋亡、消除細(xì)胞內(nèi)ROS 種類、保護(hù)線粒體功能等作用[28]。PI3K-AKT 信號通路高表達(dá)可有效調(diào)控海馬神經(jīng)元凋亡、再生,影響海馬神經(jīng)突觸的可塑性,進(jìn)而起到抗抑郁的作用[29-30]。腫瘤壞死因子信號通路可促使促炎性細(xì)胞因子、趨化因子、生長因子等基因的表達(dá)來放大炎癥反應(yīng)和免疫效應(yīng)[31]。流體剪切應(yīng)力是血液在血管壁內(nèi)皮表面產(chǎn)生的摩擦力,在血管生物學(xué)中起中心作用,有助于動脈粥樣硬化的進(jìn)展[32]。

分子對接結(jié)果顯示,核心成分山奈酚、柚皮素、β-谷甾醇與核心蛋白RXRA、AKT1、MAPK3 的結(jié)合能均小于-5.0 kcal/mol,特別是柚皮素、β-谷甾醇與RXRA、MAPK3 靶點(diǎn)之間具有較好的結(jié)合力。說明核心成分能與核心蛋白結(jié)合起效,并通過激活或抑制核心蛋白的相關(guān)通路,從而達(dá)到治療冠心病合并抑郁/焦慮狀態(tài)的作用。

綜上所述,本研究初步預(yù)測了石菖蒲-郁金治療冠心病合并抑郁/焦慮狀態(tài)的活性成分-核心靶點(diǎn)作用機(jī)制,分析了核心靶點(diǎn)的功能及相關(guān)的信號通路,并通過分子對接驗(yàn)證了化合物與靶點(diǎn)之間的結(jié)合活性。揭示了石菖蒲-郁金通過多成分、多靶點(diǎn)和多途徑治療冠心病合并抑郁/焦慮的物質(zhì)基礎(chǔ)和作用機(jī)制,為石菖蒲-郁金藥對的開發(fā)利用提供了理論基礎(chǔ)和科學(xué)依據(jù)。