基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的寬胸氣霧劑改善冠狀動(dòng)脈慢血流作用機(jī)制研究

許振宇,程可愛(ài),程勁松,王勝煌

冠狀動(dòng)脈慢血流(coronary slow flow,CSF)是一種特定的血管造影現(xiàn)象,主要表現(xiàn)為在排除明顯狹窄、瘤樣擴(kuò)張和痙攣等情況下,冠狀動(dòng)脈出現(xiàn)前向血流遲緩的現(xiàn)象[1]。近年來(lái),隨著冠狀動(dòng)脈造影技術(shù)的普及應(yīng)用,臨床上胸痛病人中CSF 的檢出率為5%～7%,且呈逐年遞增趨勢(shì)[2]。研究發(fā)現(xiàn)大約80%的CSF 病人可出現(xiàn)反復(fù)發(fā)作的胸痛癥狀,而且部分病人病情惡化,可發(fā)生心肌梗死甚至猝死等心血管不良事件,嚴(yán)重影響病人的生命質(zhì)量[3]。因此,CSF 已被認(rèn)為是一種需要積極治療的冠狀動(dòng)脈疾病表型[4]。遺憾的是,該病雖然已被發(fā)現(xiàn)多年,但現(xiàn)階段臨床上尚無(wú)有確切療效的治療方案[5-6],所以進(jìn)一步挖掘具有潛在治療作用的藥物刻不容緩。CSF 是西醫(yī)診斷,中醫(yī)辨證后多將此證歸屬于胸痹癥范疇[7]。目前中醫(yī)藥已經(jīng)作為防治胸痹癥的重要手段[8],其中,寬胸氣霧劑作為芳香溫通類創(chuàng)新性中成藥,由國(guó)醫(yī)大師陳可冀院士在古方《集驗(yàn)方》中“哭來(lái)笑去散”的基礎(chǔ)上進(jìn)一步精制研發(fā)而成[9]。近年來(lái)已廣泛應(yīng)用于各型胸痹癥的治療中,效果確切,特別是對(duì)心絞痛急性發(fā)作的緩解方面顯示出獨(dú)特優(yōu)勢(shì)[8]。并且有研究發(fā)現(xiàn)寬胸氣霧劑對(duì)于CSF 病人的冠狀動(dòng)脈血流有一定的改善作用[10],因此值得進(jìn)一步探究。但由于藥物的效應(yīng)成分較多,潛在的干預(yù)途徑較為復(fù)雜,受限于各種因素,目前寬胸氣霧劑改善CSF 的可能作用機(jī)制尚不明確。

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)是近年來(lái)新興的研究中藥復(fù)方制劑的一種新策略[11],該方法可以從局部到全局多維度地探索藥物和疾病之間的相互關(guān)聯(lián),這與中醫(yī)辨證中“整體觀”的治療理念十分契合[12-13]。目前國(guó)內(nèi)外尚無(wú)應(yīng)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)探究寬胸氣霧劑改善CSF 作用機(jī)制的文獻(xiàn)報(bào)道。故本研究首次運(yùn)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的策略,構(gòu)建“藥物-疾病-靶點(diǎn)-機(jī)制”的多元化網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu),分析寬胸氣霧劑改善CSF 的相關(guān)效應(yīng)成分、核心靶點(diǎn)等,并借助富集分析,初步預(yù)測(cè)相關(guān)藥理作用機(jī)制,從而為下一步的實(shí)驗(yàn)研究與臨床實(shí)踐提供借鑒。

1 資料與方法

1.1 寬胸氣霧劑活性成分篩選及作用靶點(diǎn)預(yù)測(cè) 結(jié)合既往研究報(bào)道[14],確定寬胸氣霧劑中細(xì)辛油、檀香油、高良姜油和蓽茇油中揮發(fā)性的活性化合物。同時(shí)利用本草組鑒數(shù)據(jù)庫(kù)(http://herb.ac.cn/),設(shè)定口服生物利用度(oral bioavailability,OB)閾值≥30%、類藥性(drug-likeness,DL)閾值≥0.18,篩選出冰片的活性化合物。進(jìn)一步應(yīng)用 PubChem 數(shù)據(jù)庫(kù)(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)獲取活性化合物所對(duì)應(yīng)的代謝物結(jié)構(gòu)(Canonical SMILES),再通過(guò)TargetNet數(shù)據(jù)庫(kù)(http://targetnet.scbdd.com/)設(shè)置曲線下面積(area under the curve,AUC)≥0.80,輸入上述化合物的Canonical SMILES,最終獲取相對(duì)應(yīng)的作用靶點(diǎn)。

1.2 CSF 疾病靶點(diǎn) 以“coronary slow flow”為關(guān)鍵詞檢索GeneCards 數(shù)據(jù)庫(kù)(https://www.genecards.org/)和OMIN 數(shù)據(jù)庫(kù)(https://omim.org/)。然后將數(shù)據(jù)庫(kù)檢索得到的人源性靶點(diǎn)進(jìn)行匯總?cè)ブ睾?建立CSF 匹配的靶點(diǎn)。

1.3 構(gòu)建化合物-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò) 將寬胸氣霧劑中的活性化合物及對(duì)應(yīng)的作用靶點(diǎn)輸入 Cytoscape 軟件(Version3.7.2,http://www.cytoscape.org)進(jìn)行化合物-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建,以進(jìn)一步明確活性化合物與作用靶點(diǎn)之間的關(guān)聯(lián)性,并篩選出主要的活性化合物。

1.4 藥物-疾病共有靶點(diǎn)篩選 將藥物的作用靶點(diǎn)和疾病的匹配靶點(diǎn)輸入韋恩圖制作軟件,獲取共有靶點(diǎn)并進(jìn)一步分析。

1.5 蛋白互作(protein-protein interaction,PPI)網(wǎng)絡(luò)及核心靶點(diǎn)篩選 將藥物-疾病共有靶點(diǎn)上傳至STRING 數(shù)據(jù)庫(kù)(https://cn.string-db.org/),物種限定為人源性,設(shè)置中位置信度評(píng)分為0.40,獲取PPI 網(wǎng)絡(luò)。使用將Cytoscape 軟件中對(duì)PPI 網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行聚類分析和可視化處理。同時(shí)利用軟件中的Cytohubba 算法進(jìn)一步篩選核心靶點(diǎn)。

1.6 富集分析 應(yīng)用Metascape 數(shù)據(jù)庫(kù)(https://metascape.org/)進(jìn)行基因本體(gene ontology,GO)和京都基因與基因組百科全書(shū)(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes,KEGG)的富集分析,探索寬胸氣霧劑改善CSF 潛在的生物過(guò)程和信號(hào)通路等。將共有靶點(diǎn)上傳至數(shù)據(jù)庫(kù),物種限定為人源性,設(shè)置最小交集為3、P截?cái)嘀禐?.01、最小富集為1.5 共3 個(gè)條件后進(jìn)行富集分析。按照-LogPvalue 排序,獲取GO 富集分析中生物過(guò)程(biological process,BP)、分子功能(molecular function,MF)和細(xì)胞組成(cellular component,CC)及KEGG 富集分析中處于前列的信號(hào)通路。同時(shí)使用R3.6.3 軟件對(duì)結(jié)果進(jìn)行可視化輸出。

2 結(jié) 果

2.1 寬胸氣霧劑中活性化合物的確定 依托既往研究提供的寬胸氣霧劑氣相質(zhì)譜(GC-MS)檢測(cè)信息[14]和HERB 數(shù)據(jù)庫(kù)檢索的結(jié)果,共獲得活性化合物共39個(gè),其中,細(xì)辛油10 個(gè),檀香油8 個(gè),高良姜油12 個(gè),蓽茇油7 個(gè),冰片3 個(gè)。石竹烯(C27)是高良姜油和蓽茇油的共同化合物。寬胸氣霧劑中活性化合物的具體信息見(jiàn)表1。

表1 寬胸氣霧劑活性化合物信息表

2.2 活性化合物-作用靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 經(jīng)過(guò)TargetNet 數(shù)據(jù)庫(kù)檢索匯總和去重,共獲得39 個(gè)活性化合物及對(duì)應(yīng)的作用靶點(diǎn)171 個(gè),網(wǎng)絡(luò)關(guān)系見(jiàn)圖1,其中,紫色節(jié)點(diǎn)代表細(xì)辛油的活性化合物,粉色節(jié)點(diǎn)代表檀香油的活性化合物,橙色節(jié)點(diǎn)代表高良姜油的活性化合物,紅色節(jié)點(diǎn)代表蓽茇油活性化合物,深綠色節(jié)點(diǎn)代表高良姜油和蓽茇油共有的活性化合物,黃綠色節(jié)點(diǎn)代表冰片的活性化合物,湖藍(lán)色節(jié)點(diǎn)代表對(duì)應(yīng)的作用靶點(diǎn)。進(jìn)一步分析節(jié)點(diǎn)度值,其中,β-蒎烯(C1)、欖香素(C10)、檀香醇(C12)、α紅沒(méi)藥醇(C13)、桉油精(C22)、石竹烯(C27)、龍腦酯(C38)等活性化合物在各自藥物成分中具有較高的度值,因此,推測(cè)可能是寬胸氣霧劑發(fā)揮相關(guān)藥效作用的主要化合物。這一結(jié)果體現(xiàn)了寬胸氣霧劑多活性成分和多作用靶點(diǎn)的特性。

圖1 寬胸氣霧劑活性化合物-作用靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖

2.3 CSF 疾病靶點(diǎn)查找和共有靶點(diǎn)篩選 通過(guò)Genecards 數(shù)據(jù)庫(kù)檢索出CSF 相關(guān)靶點(diǎn)641 個(gè),OMIN 數(shù)據(jù)庫(kù)獲取到82 個(gè)。經(jīng)過(guò)合并刪重后共得到CSF 匹配的靶點(diǎn)共699 個(gè),進(jìn)一步將699 個(gè)疾病靶點(diǎn)和171 個(gè)活性化合物對(duì)應(yīng)的作用靶點(diǎn)輸入韋恩圖制作軟件,最終獲得36 個(gè)共有靶點(diǎn)。詳見(jiàn)圖2。

圖2 藥物-疾病共有靶點(diǎn)韋恩圖

2.4 PPI 網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建及核心靶點(diǎn)篩選 應(yīng)用STRING數(shù)據(jù)庫(kù)構(gòu)建 PPI 網(wǎng)絡(luò)后獲取相關(guān)PPI 信息,輸入Cytoscape 軟件進(jìn)行圖像可視化(見(jiàn)圖3A)。圖中節(jié)點(diǎn)大小和顏色根據(jù)度值調(diào)整,越大、顏色越亮代表度值越大,線段粗細(xì)根據(jù)互作評(píng)分調(diào)整,越粗代表互作評(píng)分越高。然后根據(jù)Cytohubba 算法進(jìn)一步篩選出核心靶點(diǎn)(MCC 排名前10 位),分別是白細(xì)胞介素6(IL6)、腫瘤壞死因子(TNF)、熱休克蛋白90-AA1(HSP90AA1)、表皮生長(zhǎng)因子受體(EGFR)、雌激素受體1(ESR1)、核受體亞家族3C 組成員1(NR3C1)、環(huán)加氧酶2(PTGS2)、雄激素受體(AR)、DNA 甲基轉(zhuǎn)移酶1(DNMT1)和多藥耐藥蛋白1(ABCB1),詳見(jiàn)圖3B。結(jié)果顯示,這些靶點(diǎn)在網(wǎng)絡(luò)調(diào)控中起著關(guān)鍵作用,推測(cè)可能是寬胸氣霧劑改善CSF 的核心靶點(diǎn)。

圖3 PPI 網(wǎng)絡(luò)圖和核心靶點(diǎn)

2.5 GO 富集分析與KEGG 富集分析 結(jié)果顯示,GO 富集分析共有588 個(gè)條目,其中,生物過(guò)程條目518 個(gè),分子功能條目46 個(gè),細(xì)胞組分條目24 個(gè)。生物過(guò)程主要包括炎癥反應(yīng)調(diào)節(jié)、蛋白磷酸化的正向調(diào)節(jié)、細(xì)胞因子生成正向調(diào)節(jié)、小分子代謝過(guò)程正向調(diào)節(jié)、離子轉(zhuǎn)運(yùn)調(diào)節(jié)等;分子功能主要包括絲氨酸水解酶活性、核受體活性、一氧化氮合酶活性、生長(zhǎng)因子受體結(jié)合等,并且參與了細(xì)胞中膜筏、膜被膜內(nèi)腔、細(xì)胞質(zhì)區(qū)域、囊腔等細(xì)胞組分組成。詳見(jiàn)圖4。KEGG 富集信號(hào)通路主要涉及白細(xì)胞介素17 信號(hào)通路、松弛素信號(hào)通路、環(huán)磷酸鳥(niǎo)苷-蛋白激酶G 信號(hào)通路、環(huán)磷酸腺苷信號(hào)通路和細(xì)胞核因子-κB(NF-κB)信號(hào)通路等。詳見(jiàn)圖5。上述結(jié)果直觀展示了寬胸氣霧劑中的有效成分在改善CSF中具有多干預(yù)途徑和作用機(jī)制的特征。

圖4 寬胸氣霧劑改善CSF 的GO 富集分析

圖5 寬胸氣霧劑改善CSF 的KEGG 富集分析

3 討 論

除外阻塞性病變所導(dǎo)致冠狀動(dòng)脈嚴(yán)重狹窄引起的心肌缺血外,近年來(lái),CSF 在其中的發(fā)生率逐年上升。CSF 病人胸痛頻發(fā),可出現(xiàn)心力衰竭、心肌梗死等情況,甚至并發(fā)猝死等致死性急癥[15]。目前研究認(rèn)為CSF 的發(fā)病機(jī)制復(fù)雜,可能涉及冠狀動(dòng)脈微循環(huán)障礙、內(nèi)皮功能異常、炎癥反應(yīng)等多個(gè)病理生理過(guò)程[4]。由于相關(guān)干預(yù)靶點(diǎn)仍不明確,因此,現(xiàn)階段臨床上尚缺乏有效治療CSF 的西醫(yī)藥物。

CSF 是西醫(yī)學(xué)名稱,中醫(yī)辨證多認(rèn)為此證多系心脈不通、血脈不通,因而屬于胸痹癥范疇,進(jìn)而認(rèn)為芳香溫通類中藥可用于治療CSF[7]。寬胸氣霧劑作為芳香溫通類中成藥的典范,全方具有溫通散寒、開(kāi)竅止痛之功效,近年來(lái)已成功應(yīng)用于心絞痛病人的治療中。相關(guān)研究顯示寬胸氣霧劑緩解心絞痛發(fā)作的臨床療效與國(guó)產(chǎn)硝酸甘油片相似[16],并且其對(duì)CSF 病人有潛在的治療作用[10]。但寬胸氣霧劑治療CSF 的效應(yīng)成分、作用靶點(diǎn)和機(jī)制等仍不明確。因此,本研究運(yùn)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法成功構(gòu)建了藥物-疾病-靶點(diǎn)-機(jī)制的多維網(wǎng)絡(luò),初步闡明了相關(guān)作用途徑,從而為更深層次的探究確切機(jī)制指明了方向。本研究顯示,寬胸氣霧劑的活性成分對(duì)應(yīng)的作用靶點(diǎn)171 個(gè),與CSF 相關(guān)的疾病靶點(diǎn)699 個(gè)。結(jié)果提示,β-蒎烯、欖香素、α紅沒(méi)藥醇、檀香醇、桉油精、石竹烯、龍腦酯等可能為寬胸氣霧劑中發(fā)揮效應(yīng)的重要活性成分。文獻(xiàn)表明,β-蒎烯是單萜類物質(zhì)的代表,具有抗氧化、抗炎和鎮(zhèn)痛等廣泛的藥理學(xué)活性[17]。而α紅沒(méi)藥醇是一種不飽和單環(huán)倍半萜醇,被稱為世界上“使用最多的草藥成分”之一,具有的抗氧化機(jī)制主要與降低活性氧(ROS)/活性氮(RNS)活性和增強(qiáng)超氧化物歧化酶(SOD)和過(guò)氧化氫酶(CAT)等有關(guān);此外還通過(guò)降低TNFα、IL6 和一氧化氮合酶(NOS)的活性,抑制NF-κB 的激活等發(fā)揮抗炎的功效[18]。同時(shí)研究認(rèn)為石竹烯能夠減少IL6 和NF-κB等促炎介質(zhì),從而改善以炎癥損傷和氧化應(yīng)激為特征的血管病變的慢性病理過(guò)程[19]。

在藥物-疾病共有靶點(diǎn)中,IL6、TNF、HSP90AA1、ESR1、NR3C1 和PTGS2 等被認(rèn)為是寬胸氣霧劑改善CSF 的核心靶點(diǎn)。研究表明TNF 和IL6 等炎癥介質(zhì)可導(dǎo)致血管穩(wěn)態(tài)失衡和內(nèi)皮功能障礙,從而促進(jìn)CSF的發(fā)生和發(fā)展[20-21]。HSP90AA1 是近來(lái)發(fā)現(xiàn)的可導(dǎo)致心肌缺血的致病靶點(diǎn),而且與已知的其他冠心病致病基因共享生物學(xué)功能和病理途徑等[22]。PTGS2 則被證明和冠狀動(dòng)脈血流和內(nèi)皮功能等息息相關(guān)[23]。因此推測(cè)寬胸氣霧劑中的有效成分可能主要是通過(guò)作用于上述多個(gè)核心靶點(diǎn)起到改善CSF 的效應(yīng)。

進(jìn)一步的富集分析提示寬胸氣霧劑改善CSF 的作用主要與炎癥反應(yīng)調(diào)節(jié)、蛋白磷酸化調(diào)節(jié)、細(xì)胞因子生成調(diào)節(jié)和小分子代謝調(diào)節(jié)等生物學(xué)過(guò)程相關(guān)。在KEGG 富集分析中,可以發(fā)現(xiàn)核心靶點(diǎn)高度富集在松弛素信號(hào)通路、環(huán)磷酸鳥(niǎo)苷-蛋白激酶G 信號(hào)通路、NF-κB 信號(hào)通路等通路中。目前研究證實(shí)松弛素信號(hào)通路對(duì)心血管系統(tǒng)可產(chǎn)生多效性作用,其中,以引起血管的舒張效應(yīng)最為直接,同時(shí)還可抑制氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)誘發(fā)的損傷,對(duì)心肌細(xì)胞提供保護(hù)作用[24]。cGMP-PKG 信號(hào)通路則可調(diào)節(jié)血管內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)異常酸堿度的恢復(fù)速度,加快Ca2+內(nèi)流和恢復(fù)線粒體的通透性,從而對(duì)心肌細(xì)胞的活性起到改善作用[25]。同時(shí)NF-κB 信號(hào)通路與氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)等因素密切相關(guān),而這些因素已被認(rèn)為和CSF 的發(fā)病密切相關(guān),已有研究表明CSF 病人外周血中NF-κB 的表達(dá)水平明顯高于正常人群,因此,調(diào)控NF-κB 信號(hào)通路已被認(rèn)為是CSF 的未來(lái)治療方向之一[26]。結(jié)合CSF 的可能發(fā)病機(jī)制,富集分析結(jié)果充分表明了運(yùn)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法對(duì)初步預(yù)測(cè)寬胸氣霧劑改善CSF 作用機(jī)制的可靠性。

在前期工作的基礎(chǔ)上[27],通過(guò)對(duì)上述作用靶點(diǎn)和信號(hào)通路方面的分析發(fā)現(xiàn),寬胸氣霧劑改善CSF 過(guò)程中存在著復(fù)雜的交互作用,藥物中各有效成分相互配伍,通過(guò)TNF、IL6、HSP90AA1、PTGS2 等蛋白作用,共同干預(yù)炎癥反應(yīng)調(diào)節(jié)、蛋白磷酸化調(diào)節(jié)、細(xì)胞因子生成調(diào)節(jié)等生物學(xué)過(guò)程,并通過(guò)調(diào)控血管舒張、炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激、血管內(nèi)皮功能等信號(hào)通路,發(fā)揮舒張血管、抗炎、抗氧化應(yīng)激、舒張血管和恢復(fù)血管內(nèi)皮細(xì)胞穩(wěn)態(tài)等作用。本研究為寬胸氣霧劑治療CSF 的進(jìn)一步研究提供了有益的參考,也為下一步的藥理機(jī)制的深入研究指明了方向。但應(yīng)該認(rèn)識(shí)到,這僅僅是一種理論預(yù)測(cè),是聚焦于分子靶點(diǎn)和信號(hào)通路層面進(jìn)行的初步探討。根據(jù)研究結(jié)果提示,并結(jié)合其他研究,展開(kāi)相關(guān)驗(yàn)證工作才能更為詳實(shí)地闡明寬胸氣霧劑改善CSF的確切機(jī)制。

4 小 結(jié)

通過(guò)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析發(fā)現(xiàn)寬胸氣霧劑改善CSF具有多靶點(diǎn)和多途徑的特點(diǎn)。并預(yù)測(cè)了相關(guān)的可能機(jī)制,為今后進(jìn)一步的基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)提供了參考和理論依據(jù)。