PCSK9 基因E670G 位點(diǎn)多態(tài)性與冠心病及血脂水平的相關(guān)性研究

曾圓圓,趙 靜,沈曉旭

冠狀動(dòng)脈粥樣硬化性心臟病是指冠狀動(dòng)脈發(fā)生粥樣硬化引起管腔狹窄或閉塞,導(dǎo)致心肌缺血缺氧或壞死而引起的心臟病,簡(jiǎn)稱(chēng)冠心病(coronary heart disease,CHD)。冠心病的發(fā)病機(jī)制復(fù)雜,目前尚未完全研究清楚。流行病學(xué)調(diào)查結(jié)果顯示,在冠心病眾多危險(xiǎn)因素中,脂質(zhì)代謝紊亂是冠心病發(fā)生和發(fā)展的重要一環(huán)[1]。人枯草溶菌素轉(zhuǎn)化酶(PCSK)9 基因功能獲得性突變會(huì)導(dǎo)致機(jī)體血脂代謝紊亂,血清低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)水平升高,增加冠心病風(fēng)險(xiǎn)[2]。本研究探討PCSK9 最常見(jiàn)的功能獲得性突變位點(diǎn)E670G 位點(diǎn)的多態(tài)性與冠心病和血脂水平的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 本研究以北京中醫(yī)藥大學(xué)東直門(mén)醫(yī)院心血管一區(qū)和冠心病監(jiān)護(hù)病房(CCU)為病例來(lái)源地。選取2021 年1 月—2022 年2 月住院病人99 例,其中,經(jīng)冠狀動(dòng)脈造影或既往病史可明確診斷為冠心病者作為病例組,選取同期住院病人,經(jīng)冠狀動(dòng)脈造影或既往病史明確不符合冠心病診斷標(biāo)準(zhǔn)者作為對(duì)照組。冠心病診斷參考《冠心病合理用藥指南(第二版)》中對(duì)于冠心病的診斷標(biāo)準(zhǔn)[3]。并根據(jù)《冠心病痰瘀互結(jié)證宏觀診斷標(biāo)準(zhǔn)研究》[4]對(duì)病例組病人進(jìn)行辨證,分為痰瘀互結(jié)證和非痰瘀互結(jié)證。排除標(biāo)準(zhǔn):有惡性腫瘤、血液系統(tǒng)疾病或者有免疫功能缺陷者;合并能夠引起體內(nèi)激素變化的疾病,如垂體瘤、甲狀腺功能障礙、腎上腺素瘤、庫(kù)欣綜合征等;肝腎功能?chē)?yán)重異常者;妊娠或哺乳期婦女。最終納入病例組71 例(男47 例,女24 例)、對(duì)照組28 例(男20 例,女8 例)。病人具體納入流程見(jiàn)圖1。本研究向所有入選病人告知參與本研究所需要承擔(dān)的風(fēng)險(xiǎn)及獲益情況,并通過(guò)北京中醫(yī)藥大學(xué)東直門(mén)醫(yī)院倫理審查委員會(huì)審查批準(zhǔn)。

圖1 技術(shù)路線圖

1.2 臨床資料收集及血清采集 所有病人利用病例記錄表(Case Record Form,CRF)記錄病人的基本信息以備后續(xù)分析使用。在病人空腹8 h 后晨起抽取靜脈血5 mL 置于EDTA 抗凝管中,混勻后置于-80 ℃冰箱保存以備后續(xù)提取DNA。

1.3 外周血PCSK9基因E670G位點(diǎn)基因型檢測(cè) 首先利用組織DNA 提取試劑盒(D Neasy Blood & Tissue Kit)提取DNA。再利用大連寶生物技術(shù)有限公司合成PCSK9基因E670G 位點(diǎn)引物(E670G-F GAGATACACGGTTGTGTCCCAA;E670G-RT GAGAGAGGGACAAGTCGGAA)進(jìn)行基因組PCR 擴(kuò)增。具體PCR 反應(yīng)條件為:94 ℃預(yù)變性5 min,然后進(jìn)行35 個(gè)循環(huán)(94 ℃變性30 s、60 ℃退火30 s、72 ℃延伸30 s),然后再進(jìn)行72 ℃延伸7 min。反應(yīng)完成后的PCR 產(chǎn)物用AxyPrep DNA 凝膠回收試劑盒回收。最后取純化后的 PCR 產(chǎn)物,使用測(cè)序儀ABI3730-XL 進(jìn)行DNA 測(cè)序。

1.4 血脂指標(biāo)檢測(cè) 血脂指標(biāo)為病人入院常規(guī)檢查項(xiàng)目,檢測(cè)由東直門(mén)醫(yī)院檢驗(yàn)科生化室完成,利用CRF 表記錄病人的血脂信息。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

1.5.1 一般資料分析 采用SPSS 26.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理,符合正態(tài)分布的定量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示,兩組間比較方差齊者采用t檢驗(yàn),方差不齊者采用校正t檢驗(yàn)。不符合正態(tài)分布的定量資料則以中位數(shù)和四分位數(shù)[M(P25,P75)]表示,兩組間比較采用非參數(shù)檢驗(yàn)(Mann-WhitneyU檢驗(yàn))。定性資料以百分比(%)表示,兩組間比較采用χ2檢驗(yàn)。以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

1.5.2 Hardy-Weinberg 平衡檢驗(yàn) 應(yīng)用Pearsonχ2檢驗(yàn)分析PCSK9 E670G 基因型以及等位基因頻率的分布是否滿足Hardy-Weinberg 平衡定律,以P＞0.05表示樣本具備群體代表性。

2 結(jié) 果

2.1 病例組與對(duì)照組臨床資料比較 病例組與對(duì)照組性別分布差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05);兩組年齡比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.001);兩組吸煙史、飲酒史、糖尿病比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05),但病例組高血壓比例高于對(duì)照組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);病例組冠心病家族史比例高于對(duì)照組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。詳見(jiàn)表1。

表1 病例組與對(duì)照組臨床資料比較

2.2 病例組與對(duì)照組PCSK9 基因E670G 位點(diǎn)基因型與等位基因頻率分布

2.2.1 兩組PCSK9 基因E670G 位點(diǎn)多態(tài)性及測(cè)序結(jié)果 E670G 位點(diǎn)A 等位基因?yàn)橐吧?G 等位基因?yàn)橥蛔冃?。?jīng)過(guò)基因測(cè)序發(fā)現(xiàn),本研究中的99 例血樣本中PCSK9 基因E670G 位點(diǎn)有AA、AG 兩種基因類(lèi)型。其序列峰圖見(jiàn)圖2、圖3。

圖2 PCSK9 基因E670G 位點(diǎn)AG 型多態(tài)性序列

圖3 PCSK9 基因E670G 位點(diǎn)AA 型多態(tài)性序列

2.2.2 Hardy-Weinberg 平衡檢驗(yàn) 經(jīng)過(guò)Hardy-Weinberg遺傳平衡檢驗(yàn),兩組PCSK9 基因E670G 位點(diǎn)基因型的分布均符合Hardy-Weinberg 遺傳平衡(P＞0.05),表明所有參與研究人員來(lái)自同一孟德?tīng)柸巳?群體代表性良好。詳見(jiàn)表2。

表2 PCSK9 基因E670G Hardy-Weinberg遺傳規(guī)律檢驗(yàn)結(jié)果 單位:例(%)

2.2.3 兩組PCSK9 基因E670G 位點(diǎn)基因型與等位基因頻率分布 基因測(cè)序發(fā)現(xiàn)PCSK9 基因E670G 位點(diǎn)有AA、AG 兩種基因類(lèi)型,兩種基因型及等位基因在病例組與對(duì)照組的分布情況見(jiàn)表3。病例組基因型AA、AG 的例數(shù)依次為60 例(84.5%)、11 例(15.5%);對(duì)照組基因型AA、AG 的例數(shù)依次為22 例(78.6%)、6例(21.4%)。經(jīng)檢驗(yàn)病例組和對(duì)照組PCSK9 基因E670G 位點(diǎn)的AA、AG 基因型頻率分布差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。病例組等位基因A、G 的例數(shù)依次為131 例(92.3%)、11 例(7.7%);對(duì)照組等位基因A、G的例數(shù)依次為50 例(89.3%)、6 例(10.7%)。經(jīng)檢驗(yàn)兩組A、G等位基因頻率分布差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。

表3 PCSK9 基因E670G 基因型及等位基因頻率分布情況 單位:例(%)

2.3 病例組E670G 位點(diǎn)不同基因型血脂水平比較AA 型和AG 型病人總膽固醇(TC)、三酰甘油(TG)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)、LDL-C 水平方面差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。其中,AA 型病人HDL-C 中位數(shù)為1.15 mmol/L,高于AG 型病人(0.98 mmol/L),但AG 型 病 人TC、TG、LDL-C水 平均高于AA 型 病 人,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。詳見(jiàn)表4。

表4 病例組PCSK9 E670G 位點(diǎn)不同基因型血脂水平比較 單位:mmol/L

2.4 對(duì)照組E670G 位點(diǎn)不同基因型血脂水平比較對(duì)照組AA 型和AG 型之間TC、TG、HDL-C、LDL-C 水平比較,差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。詳見(jiàn)表5。

表5 對(duì)照組PCSK9 E670G 位點(diǎn)不同基因型血脂水平比較 單位:mmol/L

2.5 病例組痰瘀互結(jié)證與非痰瘀互結(jié)證血脂水平比較 痰瘀互結(jié)證組與非痰瘀互結(jié)證組TC、TG、LDL-C水平比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。但兩組HDL-C 水平比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。其中,痰瘀互結(jié)證病人HDL-C 水平中位數(shù)為0.98 mmol/L,低于非痰瘀互結(jié)證病人(1.18 mmol/L)。詳見(jiàn)表6。

表6 病例組不同證型血脂水平比較 單位:mmol/L

2.6 病例組不同證型PCSK9 基因E670G 位點(diǎn)基因型比較 基于以上結(jié)果可知,痰瘀互結(jié)證和非痰瘀互結(jié)證病人HDL-C 水平差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,而病例組HDL-C 水平在PCSK9 基因E670G 位點(diǎn)AA 型和AG型之間差異也有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,為了進(jìn)一步探索冠心病證型與E670G 位點(diǎn)基因型之間的關(guān)系,經(jīng)χ2檢驗(yàn),兩種證型基因型分布差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。詳見(jiàn)表7。

表7 病例組不同證型PCSK9 基因E670G 位點(diǎn)基因型比較 單位:例(%)

3 討 論

冠心病的發(fā)病機(jī)制復(fù)雜,現(xiàn)有研究認(rèn)為,冠心病是個(gè)人遺傳因素、生活行為方式和環(huán)境因素相互作用而引起的復(fù)雜性遺傳性疾病。本研究中,冠心病病人冠心病家族史比例高于對(duì)照組,這也證實(shí)了遺傳因素與冠心病的發(fā)病密切相關(guān)。PCSK9 由Seidah 等[5]于2003 年首次在小腦和端腦腦細(xì)胞中發(fā)現(xiàn),為前蛋白轉(zhuǎn)化酶(proprotein convertase,PC)家族的第9 個(gè)成員。PCSK9 基因突變可以導(dǎo)致其編碼蛋白的功能發(fā)生改變,不同的突變類(lèi)型導(dǎo)致血液中的膽固醇水平呈現(xiàn)完全相反的變化,與冠心病的發(fā)生密切相關(guān)。其中,E670G 是目前已知的功能獲得性突變位點(diǎn)之一,也是目前在PCSK9 基因多態(tài)性與血脂水平相關(guān)性中研究最多的位點(diǎn),諸多研究也證實(shí)了PCSK9 基因E670G與冠心病不同程度相關(guān)[2,6-9]。本研究證實(shí),病例組AA基因型病人HDL-C 水平高于AG 基因型病人,但AG基因型病人TC、TG、LDL-C 水平高于AA 基因型病人。王梅等[10]也認(rèn)為PCSK9 與LDL-C、載脂蛋白B(ApoB)水平呈正相關(guān)。單雪峰等[11]針對(duì)新疆維吾爾族人的研究表明,冠心病病人PCSK9 基因E670G 多態(tài)性與TC、LDL-C 水平升高相關(guān)。深入到機(jī)制層面,可能與E670G 位點(diǎn)的突變能夠增加PCSK9 的功能,血清PCSK9 水平異常增高相關(guān)。PCSK9 基因編碼一種酶,該酶已經(jīng)被證明參與降解細(xì)胞溶酶體中的低密度脂蛋白膽固醇受體(LDL-R),并阻止其循環(huán)到肝細(xì)胞表面。因此,PCSK9 的功能獲得性突變會(huì)導(dǎo)致LDL-R降解增加,細(xì)胞表面受體數(shù)量減少,進(jìn)而導(dǎo)致機(jī)體血脂代謝紊亂,血清LDL-C 水平升高,而高水平的LDL-C和冠心病風(fēng)險(xiǎn)增加有關(guān)。另有研究表明PCSK9 也可以不通過(guò)血脂直接作用于血管內(nèi)皮,促進(jìn)動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生[12]。其機(jī)制可能與泡沫細(xì)胞形成[13]、誘發(fā)血管炎癥[14]、誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞和巨噬細(xì)胞凋亡[15]、促進(jìn)血管平滑肌細(xì)胞分化[16]等相關(guān)。這些新機(jī)制的發(fā)現(xiàn)為PCSK9抑制劑防治動(dòng)脈粥樣硬化性心血管疾病(ASCVD)提供了理論依據(jù),也是目前降脂治療的新方向。

關(guān)于PCSK9 基因多態(tài)性與心血管疾病的相關(guān)性研究也有很多,本研究中病例組和對(duì)照組基因型及等位基因分布差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,這與其他相關(guān)研究的結(jié)果[11]并不一致,張楠等[17]采用Logistic 回歸分析校正了性別、年齡、體質(zhì)指數(shù)等危險(xiǎn)因素后發(fā)現(xiàn)G 等位基因的個(gè)體發(fā)生冠心病的風(fēng)險(xiǎn)高于A 等位基因個(gè)體。楊文艷等[2]也證實(shí)老年冠心病病人PCSK9 基因E670G 位點(diǎn)存在A 向G 的基因突變,AG 和GG 突變基因型是冠心病的危險(xiǎn)基因型。但也有與本研究相似結(jié)論認(rèn)為PCSK9 基因E670G 多態(tài)性與冠心病發(fā)病無(wú)關(guān)[8]。或許一項(xiàng)綜合多個(gè)研究、樣本量較大的Meta 分析[18]結(jié)果更能說(shuō)明問(wèn)題:無(wú)論是在亞洲人群還是高加索人群中,PCSK9 基因E670G 多態(tài)性均與冠心病相關(guān),漏斗圖未發(fā)現(xiàn)明顯的發(fā)表性偏倚。不同的研究呈現(xiàn)完全相反的結(jié)果,考慮可能與PCSK9 基因的遺傳規(guī)律相關(guān),有研究表明PCSK9 基因的突變受到性別[19]、種族[20-21]甚至地區(qū)[22]等因素的影響。因此,PCSK9 基因多態(tài)性與冠心病關(guān)系仍需要大樣本的臨床研究來(lái)驗(yàn)證。

PCSK9 基因多態(tài)性與冠心病中醫(yī)證型之間的相關(guān)性鮮見(jiàn)報(bào)道。本研究結(jié)果顯示,AA、AG 基因型在冠心病痰瘀互結(jié)證和非痰瘀互結(jié)證之間的分布差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,但兩證型之間HDL-C 水平存在差異,也許能夠?yàn)樘叼龌ソY(jié)證的識(shí)別提供微觀依據(jù),具體機(jī)制仍有待進(jìn)一步探討。