芪參益氣滴丸治療糖尿病合并冠心病心絞痛的網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究

劉甜甜,劉 鑫,張彥麗,何 婷,曹俊嶺

糖尿病合并冠心病心絞痛屬中醫(yī)消渴并發(fā)胸痹、心痛等范疇[1],其基本病機(jī)主要是本虛標(biāo)實(shí)、氣虛血瘀,故益氣活血化瘀、標(biāo)本同治為其重要治則。芪參益氣滴丸是益氣活血法的代表方藥,常用于氣虛血瘀型冠心病心絞痛的治療,該方由黃芪、丹參、三七、降香4味中藥組成,具有益氣活血、化瘀通脈、寧心止痛之功效。研究證實(shí)芪參益氣滴丸可以治療2 型糖尿病合并冠心病、心肌梗死、冠狀動(dòng)脈微血管病變、慢性心力衰竭等心系疾病[2-5]。而關(guān)于芪參益氣滴丸干預(yù)糖尿病合并冠心病心絞痛的作用機(jī)制報(bào)道較少,本研究借助網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法建立芪參益氣滴丸治療糖尿病合并冠心病心絞痛的“中藥-活性成分-作用靶點(diǎn)-信號(hào)通路”關(guān)系網(wǎng)絡(luò),從中醫(yī)整體角度探討芪參益氣滴丸干預(yù)糖尿病合并冠心病心絞痛的藥理機(jī)制。

1 資料與方法

1.1 搜索芪參益氣滴丸活性成分及靶點(diǎn) 利用中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)分析平臺(tái)(TCMSP)檢索黃芪、丹參、三七、降香的活性成分,設(shè)置篩選參數(shù)為口服生物利用度(OB)≥30%且類藥性(DL)≥0.18,檢索芪參益氣滴丸的活性成分。使用 TCMSP 數(shù)據(jù)庫(kù)和DrugBank 數(shù)據(jù)庫(kù)獲得相應(yīng)活性成分的靶點(diǎn),通過(guò)STRING 數(shù)據(jù)庫(kù)將蛋白名批量轉(zhuǎn)化為基因名,采用UniProt 數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行基因名校準(zhǔn)。

1.2 繪制“活性成分-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)圖 利用Cytoscape 3.7.2軟件繪制芪參益氣滴丸“活性成分-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)圖,進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)拓?fù)鋮?shù)分析,計(jì)算度值(Degree),選出大于平均Degree 值2 倍的主要活性成分。

1.3 檢索糖尿病合并冠心病心絞痛的靶點(diǎn) 在DisGeNET 數(shù)據(jù)庫(kù)中分別檢索“糖尿病”“冠心病”“心絞痛”的相關(guān)靶基因,對(duì)冠心病和心絞痛靶點(diǎn)合并去重后與糖尿病靶點(diǎn)取交集,獲得疾病靶基因。

1.4 構(gòu)建蛋白互作(PPI)網(wǎng)絡(luò)圖 利用FunRich_V3軟件繪制韋恩圖,得到芪參益氣滴丸與糖尿病合并冠心病心絞痛相交的作用靶點(diǎn)。將相交靶基因?qū)隨TRING 數(shù)據(jù)庫(kù),將生物種類設(shè)為“Homo sapiens”,最低相互作用置信度得分設(shè)為“high confidence”(0.7),簡(jiǎn)化顯示設(shè)為“隱藏網(wǎng)絡(luò)中斷開連接的節(jié)點(diǎn)”,其他參數(shù)保持默認(rèn),得到基因/蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù),將數(shù)據(jù)以文本格式導(dǎo)入Cytoscape 3.7.2 軟件,構(gòu)建PPI 網(wǎng)絡(luò),基于網(wǎng)絡(luò)拓?fù)鋮?shù)獲得degree 值較高的核心靶點(diǎn)。

1.5 解析靶點(diǎn)基因本體(GO)生物功能和京都基因和基因組百科全書(KEGG)通路 應(yīng)用DAVID 數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行相交靶基因的生物過(guò)程、分子功能、細(xì)胞組分和KEGG通路富集分析,依據(jù)錯(cuò)誤發(fā)現(xiàn)率Benjamini＜0.05,選出差異顯著的生物過(guò)程、分子功能、細(xì)胞組成和信號(hào)通路。采用Cytoscape 軟件繪制“中藥-活性成分-作用靶點(diǎn)-信號(hào)通路”網(wǎng)絡(luò)圖。

2 結(jié) 果

2.1 整合芪參益氣滴丸的活性成分和靶點(diǎn) 以O(shè)B≥30%且DL≥0.18 為設(shè)置參數(shù),在TCMSP 數(shù)據(jù)庫(kù)檢索到:黃芪活性成分17 個(gè),作用靶點(diǎn)462 個(gè);丹參活性成分59 個(gè),作用靶點(diǎn)932 個(gè);三七活性成分7 個(gè),作用靶點(diǎn)253 個(gè);降香活性成分32 個(gè),作用靶點(diǎn)620 個(gè)。對(duì)4 味中藥的活性成分和作用靶點(diǎn)進(jìn)行合并去重后得到芪參益氣滴丸的活性成分110 個(gè)和作用靶點(diǎn)255 個(gè)。

2.2 芪參益氣滴丸活性成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò) 通過(guò)Cytoscape 軟件構(gòu)建芪參益氣滴丸的“活性成分-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)圖,圖中藍(lán)色正邊形代表方藥,紅色矩形代表中藥,綠色六邊形代表活性成分,黃色圓形代表作用靶點(diǎn),見圖1。由網(wǎng)絡(luò)拓?fù)鋮?shù)分析得到371 個(gè)節(jié)點(diǎn)、2 386條邊,平均Degree 值為12.897,大于平均Degree 值2倍的化合物有31 個(gè),如槲皮素、芒柄花黃素、β-谷甾醇、山奈酚、木犀草素、丹參酮、異鼠李素、二氫丹參內(nèi)酯、異隱丹參酮、豆甾醇等。詳見表1。

圖1 芪參益氣滴丸活性成分及靶點(diǎn)

表1 芪參益氣滴丸31 個(gè)活性成分及其Degree 值

2.3 芪參益氣滴丸治療糖尿病合并冠心病心絞痛的靶點(diǎn) 在DisGeNET 數(shù)據(jù)庫(kù)檢索獲得糖尿病靶點(diǎn)3 134 個(gè)、冠心病靶點(diǎn)1 576 個(gè)、心絞痛靶點(diǎn)139 個(gè),對(duì)冠心病、心絞痛合并去重后得到冠心病心絞痛靶點(diǎn)1 612 個(gè),對(duì)糖尿病和冠心病心絞痛靶點(diǎn)取交集,獲得935 個(gè)疾病靶點(diǎn),見圖2。對(duì)芪參益氣滴丸的255 個(gè)活性成分靶點(diǎn)和935 個(gè)疾病靶點(diǎn)取交集,得到106 個(gè)相交靶點(diǎn),見圖3。

圖2 冠心病心絞痛-糖尿病相交靶點(diǎn)韋恩圖

圖3 芪參益氣滴丸-疾病相交靶點(diǎn)韋恩圖

2.4 藥物-疾病相交靶點(diǎn)PPI 網(wǎng)絡(luò)分析 將106 個(gè)相交靶點(diǎn)導(dǎo)入STRING 數(shù)據(jù)庫(kù),獲取蛋白互作數(shù)據(jù),將數(shù)據(jù)導(dǎo)入Cytoscape 軟件進(jìn)行拓?fù)鋮?shù)分析,得到100個(gè)節(jié)點(diǎn)、711 條邊,平均介數(shù)(betweenness centrality)為0.013,平均接近中心性(closeness centrality)為0.453,平均最短路徑長(zhǎng)度(average shortest path length)為2.278,平均Degree 值為14.22。選擇Degree 值19～48 的靶點(diǎn)進(jìn)行子網(wǎng)絡(luò)提取,獲得30 個(gè)核心靶點(diǎn)的PPI 網(wǎng)絡(luò),紅色越深表示Degree 值越大,說(shuō)明其參與的生物功能越多,在網(wǎng)絡(luò)中心越重要。采用Cytoscape 3.7.2軟件中的MCODE 插件對(duì)核心靶點(diǎn)進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)聚類分析,依據(jù)得分高低選出聚類較好的基因,主要分為3 個(gè)模塊聚類群,模塊1 得分為11.733,參與的生物過(guò)程有炎癥反應(yīng)、免疫應(yīng)答、RNA 聚合酶轉(zhuǎn)錄調(diào)控、T 細(xì)胞增殖調(diào)節(jié)、缺氧反應(yīng)等。模塊2 得分為7.556,參與的生物過(guò)程有凋亡信號(hào)通路調(diào)控、細(xì)胞對(duì)缺氧的反應(yīng)、血管生成、細(xì)胞增殖等。模塊3 得分為4.800,主要參與代謝過(guò)程。詳見圖4。

圖4 芪參益氣滴丸治療糖尿病合并冠心病心絞痛靶點(diǎn)的PPI 網(wǎng)絡(luò)

2.5 藥物-疾病相交靶點(diǎn)生物功能和通路富集分析將106 個(gè)相交靶點(diǎn)導(dǎo)入DAVID 數(shù)據(jù)庫(kù),根據(jù)錯(cuò)誤發(fā)現(xiàn)率Benjamini＜0.05,得到生物過(guò)程(BP)205 個(gè)、分子功能(MF)38 個(gè)、細(xì)胞組分(CC)19 個(gè)。生物過(guò)程主要涉及RNA 聚合酶Ⅱ啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄正調(diào)控、凋亡過(guò)程負(fù)調(diào)控、細(xì)胞增殖的正調(diào)控、炎癥反應(yīng)、缺氧反應(yīng)、血管生成等。分子功能主要包括蛋白質(zhì)結(jié)合、酶結(jié)合、轉(zhuǎn)錄因子活性、轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合、細(xì)胞因子活性等。細(xì)胞組分主要分布于質(zhì)膜、細(xì)胞外間隙、胞漿、胞外體、線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜等。選出基因條目數(shù)排名前10 位的生物過(guò)程、分子功能、細(xì)胞組分繪制柱形圖。詳見圖5。

圖5 芪參益氣滴丸治療糖尿病合并冠心病心絞痛靶點(diǎn)的GO 功能分析

采用DAVID 數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)106 個(gè)相交靶點(diǎn)進(jìn)行KEGG 通路富集分析,依據(jù)Benjamini＜0.05 得到84個(gè)條目,排除共性通路后,得到差異顯著的20 條通路,詳見圖6。KEGG 通路富集結(jié)果顯示,靶基因主要富集在磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)-蛋白激酶B(Akt)、低氧誘導(dǎo)因子-1(HIF-1)、腺苷酸活化蛋白激酶(MAPK)、核轉(zhuǎn)錄因子-κB(NF-κB)、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)、細(xì)胞凋亡、p53、過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體(PPAR)等通路上。采用Cytoscape 軟件繪制“藥物-活性成分-核心靶點(diǎn)-信號(hào)通路”網(wǎng)絡(luò)(見圖7),紅色正方形代表方劑,藍(lán)色六邊形代表單味中藥,綠色菱形代表活性成分,黃色圓形代表核心靶點(diǎn),深黃色三角形代表信號(hào)通路,結(jié)果表明,芪參益氣滴丸主要通過(guò)102 個(gè)活性成分作用于106 個(gè)靶點(diǎn)的20 條信號(hào)通路治療糖尿病合并冠心病心絞痛。

圖6 芪參益氣滴丸治療糖尿病合并冠心病心絞痛的靶點(diǎn)通路

圖7 芪參益氣滴丸治療糖尿病合并冠心病心絞痛的活性成分-靶點(diǎn)-信號(hào)通路網(wǎng)絡(luò)

3 討 論

本研究基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和生物信息學(xué)方法初步證實(shí)了芪參益氣滴丸中的槲皮素、山奈酚、木犀草素、丹參酮ⅡA、丹參酮、異鼠李素、異隱丹參酮、豆甾醇、隱丹參酮、異丹參酮Ⅱ、丹參新酮等成分是發(fā)揮療效的關(guān)鍵物質(zhì)基礎(chǔ)。這些活性物質(zhì)作用于106 個(gè)靶點(diǎn)上的PI3K-Akt、HIF-1、腫瘤壞死因子(TNF)、叉頭框轉(zhuǎn)錄因子O(FoxO)、Toll 樣受體、MAPK、NF-κB、NOD 樣受體、Janus 激酶(JAK)-信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活因子(STAT)、趨化因子、VEGF、細(xì)胞凋亡、p53、PPAR 等信號(hào)通路發(fā)揮抑制細(xì)胞凋亡、促進(jìn)血管新生、降低氧化損傷的作用。

通過(guò)構(gòu)建芪參益氣滴丸治療糖尿病合并冠心病心絞痛的“中藥-活性成分-作用靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò),發(fā)現(xiàn)芪參益氣滴丸的4 味中藥共有110 個(gè)活性化合物,其中,Degree 值較大的31 個(gè)活性成分是主要藥效基質(zhì)。研究發(fā)現(xiàn),槲皮素能顯著抑制NOD 樣受體蛋白 3(NLRP3)炎癥小體激活,降低炎癥反應(yīng),從而減輕糖尿病大鼠心肌損傷,具有防治冠心病、抑制血栓形成作用[6-8]。木犀草素可以保護(hù)小鼠急性心肌梗死后心肌細(xì)胞缺血損傷[9],也能降低糖尿病小鼠心肌凋亡,減輕糖尿病心肌損傷[10],還能降低炎癥、抗氧化應(yīng)激、改善脂代謝紊亂[11-12]。丹參酮類物質(zhì)可以改善心肌缺血再灌注損傷,抑制血管內(nèi)皮功能障礙,抗血小板聚集,減少平滑肌細(xì)胞增殖遷移,可用于糖尿病血管并發(fā)癥治療[13-16]。本研究證實(shí)芪參益氣滴丸中的槲皮素、木犀草素、丹參活性物質(zhì)是治療糖尿病合并冠心病心絞痛的活性成分。

PI3K-Akt 是細(xì)胞內(nèi)重要信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路,其下游效應(yīng)分子有促進(jìn)血管新生、抑制心肌凋亡作用[17]。最新研究發(fā)現(xiàn)芪參益氣滴丸能通過(guò)激活PI3K/Akt 信號(hào)通路,減輕小型豬心肌缺血再灌注損傷[4]。由于持續(xù)高血糖可引起心臟血管內(nèi)皮和心肌細(xì)胞氧化應(yīng)激、炎性損傷致使心臟結(jié)構(gòu)和功能改變。高糖及糖尿病時(shí)發(fā)生胰島素抵抗,蛋白激酶C(PKC)被激活,進(jìn)而降低PI3K、Akt、內(nèi)皮型一氧化氮合酶(eNOS)活性,使eNOS 脫偶聯(lián)增加,一氧化氮(NO)生成減少,引起內(nèi)皮細(xì)胞損傷。體內(nèi)過(guò)多的活性氧(ROS)激活NF-κB信號(hào)通路促使炎性因子表達(dá)上調(diào),導(dǎo)致單核細(xì)胞黏附、聚集,在亞內(nèi)皮層形成泡沫細(xì)胞滲出,導(dǎo)致平滑肌細(xì)胞增殖,加速心臟血管損傷[18]。當(dāng)組織缺血缺氧時(shí),HIF-1 表達(dá)增多,引起VEGF 上調(diào)。VEGF 激活后招募內(nèi)皮細(xì)胞到缺氧區(qū)域,刺激局部形成新的毛細(xì)血管,從而在一定程度上緩解組織缺血缺氧損傷。另外,HIF-1也能使骨髓來(lái)源的內(nèi)皮細(xì)胞血管新生作用明顯受損[19]。心肌缺血再灌注損傷和心肌梗死治療主要是通過(guò)增加NO 合成促進(jìn)血管再生[20],而細(xì)胞內(nèi)的環(huán)磷酸鳥苷酸(cGMP)-環(huán)磷酸鳥苷酸依賴的蛋白激酶(PKG)、MAPK、HIF-1 信號(hào)都能影響NO 產(chǎn)生[21-22]。此外,MAPK 信號(hào)通路與糖尿病心肌病的氧化應(yīng)激損傷、炎癥反應(yīng)、心肌凋亡密切相關(guān)[1],多數(shù)益氣活血中藥可通過(guò)下調(diào)MAPK 磷酸化活性和蛋白表達(dá),抑制MAPK 信號(hào)通路,降低過(guò)氧化物和炎性因子水平,減輕心肌凋亡,從而改善心功能[23]。綜合文獻(xiàn)分析和KEGG 通路富集結(jié)果表明,芪參益氣滴丸可能通過(guò)激活PI3K-Akt 和VEGF,同時(shí)抑制TNF、MAPK、NF-κB、p53 等信號(hào)通路增加NO 合成,促進(jìn)血管再生,抑制心臟炎癥和氧化應(yīng)激,降低心肌凋亡,從而達(dá)到治療糖尿病合并冠心病心絞痛的目的。

本研究初步探討芪參益氣滴丸治療糖尿病合并冠心病心絞痛的藥理機(jī)制,構(gòu)建了藥物-活性成分-作用靶點(diǎn)-信號(hào)通路交互網(wǎng)絡(luò),篩選出110 個(gè)潛在活性成分和106 個(gè)作用靶點(diǎn),其中,20 個(gè)信號(hào)通路可能與藥物治療糖尿病合并冠心病心絞痛相關(guān),為后續(xù)深入研究芪參益氣滴丸的療效機(jī)制提供了一定的理論基礎(chǔ)。