恩格列凈通過調(diào)控成纖維細(xì)胞分化改善心臟重構(gòu)的研究*

周桂全，王 穎，潘文旭，胡美玲，晉 軍

(陸軍軍醫(yī)大學(xué)第二附屬醫(yī)院心血管內(nèi)科，重慶 400037)

心力衰竭(簡(jiǎn)稱心衰)是多種心血管疾病的終末階段，患者5年內(nèi)死亡率高達(dá)40%～50%[1]。盡管藥物治療不斷優(yōu)化，但心衰發(fā)病率仍持續(xù)上升，居高不下的住院率給醫(yī)療衛(wèi)生資源帶來(lái)沉重負(fù)擔(dān)[2]。因此，正確認(rèn)識(shí)心衰發(fā)病機(jī)制、尋找新的治療策略對(duì)心衰防治極為重要。病理性心臟重構(gòu)是心衰發(fā)生、發(fā)展的病理基礎(chǔ)，心肌纖維化是其主要表現(xiàn)，決定著心血管疾病患者的預(yù)后。細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)過度沉積和膠原纖維增多是心肌纖維化的基本特征，過度的ECM沉積會(huì)導(dǎo)致心臟僵硬度增加、順應(yīng)性下降，加速心衰發(fā)展[3]。成纖維細(xì)胞(CFs)是非心肌細(xì)胞中的主要成分，能通過更新ECM維持正常心臟的結(jié)構(gòu)和功能[4]，當(dāng)受到機(jī)械拉伸、缺氧、激素等刺激時(shí)心臟中靜止的CFs會(huì)被激活并向肌成纖維細(xì)胞(MFs)分化，大量分泌ECM和α平滑肌肌動(dòng)蛋白，也稱為α-肌動(dòng)蛋白2(Acta2)蛋白，是MFs的關(guān)鍵特征，主要分泌的ECM為膠原蛋白Ⅰ、Ⅲ[5]。早期這種生理反應(yīng)能代償心臟功能，有助于心肌細(xì)胞修復(fù)，當(dāng)刺激因素持續(xù)存在時(shí)會(huì)誘導(dǎo)CFs向MFs過度分化，促進(jìn)ECM大量沉積，導(dǎo)致心臟發(fā)生病理性重構(gòu)，最終發(fā)生心衰[6]。鈉葡萄糖共轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白2(SGLT2)抑制劑是一種新型降糖藥物，能通過促進(jìn)尿糖排泄而降低血糖，多項(xiàng)大型臨床研究均表明，SGLT2抑制劑不僅可降低血糖，還能顯著降低心衰患者住院率及死亡風(fēng)險(xiǎn)，并與血糖狀態(tài)無(wú)關(guān)[7]。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，SGLT2抑制劑中的恩格列凈(EMPA)可顯著抑制糖尿病小鼠心室重構(gòu)，并改善舒張功能障礙[8]。然而在非糖尿病心衰模型中關(guān)于SGLT2抑制劑對(duì)心臟纖維化重構(gòu)的研究較少見，其潛在機(jī)制尚不明確。因此，本研究構(gòu)建了血管緊張素Ⅱ(AngⅡ)和苯腎上腺素(PE)聯(lián)合誘導(dǎo)的小鼠心臟重構(gòu)模型，觀察EMPA對(duì)心臟重構(gòu)的影響并探討其可能的機(jī)制，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

選取8周齡、無(wú)特定病原體(SPF)級(jí)雄性野生型C57BL/6J小鼠，體重22～24 g，由重慶騰鑫生物技術(shù)有限公司提供[許可證號(hào):SCXK(渝)20170002]。予以隨機(jī)化分籠，常規(guī)食水飼養(yǎng)，環(huán)境溫度控制在22 ℃左右，濕度維持為60%～70%，每12小時(shí)進(jìn)行一次晝夜循環(huán)。相關(guān)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)均已獲得中國(guó)人民解放軍陸軍軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物福利倫理審查委員會(huì)批準(zhǔn)(倫理批號(hào):AMUWEC20212174)。

1.1.2試劑及材料

AngⅡ購(gòu)自美國(guó)MCE公司，PE購(gòu)自美國(guó)MCE公司，EMPA購(gòu)自美國(guó)MCE公司，2004 model膠囊滲透泵購(gòu)自美國(guó)Alzet公司，杜氏改良Eagle培養(yǎng)基(DMEM)培養(yǎng)基購(gòu)自美國(guó)Gibco公司，胎牛血清購(gòu)自美國(guó)Hyclone公司，二甲基亞砜(DMSO)購(gòu)自美國(guó)Sigma-Aldrich公司，麥胚凝集素(WGA)購(gòu)自美國(guó)Sigma-Aldrich公司，青霉素、鏈霉素均購(gòu)自美國(guó)Sigma-Aldrich公司，RNA Extraction Kit購(gòu)自日本Takara公司，PrimeScriptTMRT reagent Kit購(gòu)自日本Takara公司，TB Green?Premix Ex TaqTMⅡ購(gòu)自日本Takara公司，天狼星紅染色試劑盒購(gòu)自中國(guó)Saimike公司，乙二胺四乙酸抗原修復(fù)液購(gòu)自中國(guó)Beyotime公司，聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)引物由上海生工合成。

1.1.3儀器

Vevo 2100小動(dòng)物超聲成像系統(tǒng)購(gòu)自美國(guó)VisualSonics公司,氣體麻醉裝置購(gòu)自英國(guó)ASA公司,激光掃描共聚焦顯微鏡購(gòu)自德國(guó)Zeiss公司,7500實(shí)時(shí)熒光定量PCR系統(tǒng)購(gòu)自美國(guó)ABI公司,VS200全玻片掃描系統(tǒng)購(gòu)自日本Olympus公司，Nanodrop 2000超微量分光光度計(jì)購(gòu)自美國(guó)Life公司，BP-98無(wú)創(chuàng)尾套血壓計(jì)購(gòu)自中國(guó)Softron公司。

1.2 方法

1.2.1建立AngⅡ/PE心臟重構(gòu)模型

在麻醉箱中用5%異氟烷快速麻醉小鼠,取俯臥位固定小鼠,用2%異氟烷連接嘴部并維持麻醉,消毒小鼠背部皮膚并用組織剪剪開,組織鑷鈍性擴(kuò)開皮下筋膜，持無(wú)菌鑷將經(jīng)37 ℃孵箱孵育后的AngⅡ/PE滲透泵植入皮下,用皮膚縫合釘快速閉合切口。撤去麻醉裝置,等待小鼠蘇醒后放回籠位繼續(xù)飼養(yǎng)。AngⅡ泵入量為2 mg·kg-1·d-1,PE泵入量為25 mg·kg-1·d-1。對(duì)照小鼠予以同樣的泵植入操作，但為等體積的生理鹽水(NS)，持續(xù)灌注4周。4周后取心臟組織進(jìn)行石蠟包埋及切片。

1.2.2藥物干預(yù)及分組

EMPA給藥劑量為10 μg·g-1·d-1，DMSO作為儲(chǔ)存溶液，用NS稀釋。術(shù)前3 d開始以口服灌胃方式給予EMPA藥物混懸液，對(duì)照小鼠予以等量DMSO，每天1次，持續(xù)4周。分為NS+DMSO組、NS+EMPA組、AngⅡ/PE+DMSO組和AngⅡ/PE+EMPA組，每組6～7只。

1.2.3細(xì)胞培養(yǎng)及處理

原代心臟CFs取自野生型C57BL/6J小鼠左心室組織，在DMEM培養(yǎng)基(含10%胎牛血清和1%青霉素/鏈霉素)中于37 ℃孵箱(含5%二氧化碳)培養(yǎng)1周。隨機(jī)分組，實(shí)驗(yàn)組予以轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β(TGF-β,10 ng/mL)刺激96 h，并予以EMPA(100 μm)或DMSO共處理，空白對(duì)照組僅予以EMPA或賦形劑處理而不添加TGF-β，分為DMSO組、EMPA組、TGF-β+DMSO組和TGF-β+EMPA組，每組4只。

1.2.4心臟功能監(jiān)測(cè)

在泵植入前使用超聲評(píng)估心臟功能，術(shù)后每周監(jiān)測(cè)。用1%異氟烷吸入麻醉，采集并記錄左心室超聲圖像及參數(shù)，包括左心室短軸收縮率(LVFS)、舒張末期左心室后壁厚度(LVPWd)等。

1.2.5血壓測(cè)量

灌胃3周后使用尾壓法測(cè)量小鼠血壓。小鼠尾部預(yù)加熱5 min(37 ℃)，將傳感器置于小鼠尾部前1/3處，心率維持在500次左右時(shí)記錄血壓(收縮壓、舒張壓和平均動(dòng)脈壓)，重復(fù)3～5次，計(jì)算平均值。

1.2.6WGA染色

將4 μm厚的心臟石蠟切片梯度乙醇脫蠟，于100 ℃裝有枸櫞酸緩沖液高壓鍋中進(jìn)行抗原修復(fù)，用磷酸鹽緩沖液(PBS)清洗后使用Alexa Fluor Cy3-WGA進(jìn)行染色，室溫避光孵育30 min，抗熒光淬滅劑封片,激光共聚焦顯微鏡(200×)收集WGA染色圖像，每個(gè)視野內(nèi)隨機(jī)選擇10～20個(gè)類圓形心肌細(xì)胞，于對(duì)應(yīng)ZEN分析軟件(版本3.3.89.0000)計(jì)算心肌細(xì)胞橫截面積(CSA)及纖維化面積。

1.2.7天狼星紅染色

將6 μm厚的心臟組織切片梯度乙醇脫蠟，PBS清洗后于新鮮制備的染色緩沖液(含1.2%/w 苦味酸水溶液、0.1%/w Fast Green FCF 和 0.1%/w Direct Red 80 溶于PBS)中浸泡1 h(室溫)，流水沖洗并干燥。中性樹脂密封后使用全自動(dòng)玻片掃描儀采集天狼星紅染色圖像，隨機(jī)選擇5個(gè)100倍放大視野，通過Image J軟件分析纖維化面積。

1.2.8實(shí)時(shí)熒光定量PCR

吸去上清液并用預(yù)冷PBS中止反應(yīng)，按RNA Extraction Kit使用說(shuō)明書提取總RNA，并測(cè)定濃度及純度，1 μg的mRNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA。以cDNA為模板，引物為起始位點(diǎn)，在 TB Green?Premix Ex TaqTMⅡ作用下使用 ABI 7500 快速實(shí)時(shí)熒光PCR 系統(tǒng)進(jìn)行PCR擴(kuò)增。反應(yīng)條件為95 ℃預(yù)變性30 s；95 ℃變性5 s，60 ℃退火，延伸34 s，40個(gè)循環(huán)。以36b4為內(nèi)參基因，讀取循環(huán)數(shù)值，使用2-ΔΔCt方法計(jì)算目的基因表達(dá)水平。引物序列見表1。

表1 引物列表

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 心臟功能

與NS+DMSO組比較，AngⅡ/PE+DMSO組小鼠術(shù)后4周LVFS顯著降低，LVPWD明顯增加，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與AngⅡ/PE+DMSO組比較，AngⅡ/PE+EMPA組術(shù)后4周LVFS顯著增加，LVPWd顯著減少，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表2。

表2 各組小鼠術(shù)后4周心臟功能比較

2.2 血壓

與NS+DMSO組比較，AngⅡ/PE+DMSO組小鼠收縮壓、舒張壓、平均動(dòng)脈壓均明顯增加，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；AngⅡ/PE+EMPA組小鼠收縮壓、舒張壓、平均動(dòng)脈壓與AngⅡ/PE+DMSO組小鼠比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見表3。

表3 各組小鼠血壓比較

2.3 CSA

與NS+DMSO組比較，AngⅡ/PE+DMSO小鼠CSA明顯增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與AngⅡ/PE+DMSO組比較，AngⅡ/PE+EMPA組小鼠CSA明顯減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表4、圖2。

表4 各組小鼠CSA比較

圖2 各組小鼠CSA比較(WGA染色，200×)

2.4 纖維化面積

與NS+DMSO組比較，AngⅡ/PE+DMSO組小鼠纖維化面積明顯增多，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；AngⅡ/PE+EMPA組小鼠纖維化面積較AngⅡ/PE+DMSO組明顯降低，差異統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表5、圖3。

表5 各組小鼠纖維化面積比較

圖3 各組小鼠纖維化面積比較(WGA染色，100×)

2.5 CFs中Postn、Acta2、Ctgf mRNA水平

與DMSO組比較，TGF-β+DMSO組CFs中Postn、Acta2、Ctgf mRNA表達(dá)水平均明顯增高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與TGF-β+DMSO組比較，TGF-β+EMPA組CFs中Postn、Acta2、Ctgf mRNA表達(dá)水平均明顯降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表6。

表6 各組CFs中Postn、Acta2、Ctgf mRNA表達(dá)水平比較

3 討 論

心臟重構(gòu)被認(rèn)為是一個(gè)動(dòng)態(tài)的病理生理過程，涉及多種復(fù)雜因素的協(xié)同作用，CFs向MFs過度分化會(huì)加劇ECM沉積，導(dǎo)致病理性心臟重構(gòu)[9]。EMPA是一種高選擇性SGLT2抑制劑。PACKER等[10]近期進(jìn)行的EMPERO-REDUCED隨機(jī)對(duì)照研究結(jié)果顯示，與安慰劑組比較，接受EMPA治療患者心血管死亡風(fēng)險(xiǎn)和心衰住院率降低了25%，且與血糖狀態(tài)無(wú)關(guān)。然而由于SGLT2在心肌中幾乎不表達(dá)，多種機(jī)制學(xué)說(shuō)尚不能完全解釋其心血管保護(hù)作用，其潛在機(jī)制有待于進(jìn)一步研究[11]。因此，本研究分析了EMPA對(duì)AngⅡ/PE模型小鼠心臟重構(gòu)的影響，并探索了其可能的潛在機(jī)制。

AngⅡ/PE長(zhǎng)期慢性輸注能模擬神經(jīng)體液激活后的慢性高血壓，引起心臟后負(fù)荷增加，刺激心肌肥大和心肌纖維化，是一種常用的心臟重構(gòu)模型[12]。本研究結(jié)果顯示，與AngⅡ/PE+DMSO組比較，經(jīng)EMPA連續(xù)干預(yù)4周后AngⅡ/PE小鼠LVFS顯著增加，心肌纖維化水平、CSA、LVPWd顯著降低，而血壓無(wú)顯著變化，與先前的研究結(jié)果一致，提示EMPA可改善AngⅡ/PE誘導(dǎo)的心臟重構(gòu)，可能與TGF-β/Smad信號(hào)通路有關(guān)[13]。

TGF-β是一種多功能細(xì)胞因子，具有多種亞型，心臟組織中主要為TGF-β1，TGF-β1及其調(diào)控的下游smad信號(hào)傳導(dǎo)對(duì)促進(jìn)CFs分化和ECM生成具有重要作用[14]。當(dāng)壓力負(fù)荷過重時(shí)TGF-β級(jí)聯(lián)反應(yīng)可被激活，早期有助于形成保護(hù)型ECM，阻止有害的促ECM片段產(chǎn)生。然而持續(xù)過度活躍的TGF-β信號(hào)傳導(dǎo)可誘導(dǎo)CFs激活，發(fā)生病理性增生，并向以表達(dá)Acta2為特征的MFs分化[15]。MFs因產(chǎn)生ECM的能力遠(yuǎn)大于CFs，是導(dǎo)致心肌纖維化過程中ECM過量沉積的重要細(xì)胞[16]。并且MFs具備較強(qiáng)的遷移和增殖能力，有助于ECM間交聯(lián)，促進(jìn)膠原過度沉積，導(dǎo)致心肌纖維化和心功能障礙，甚至心臟傳導(dǎo)異常[17]。在體外使用TGF-β刺激CFs，EMPA共處理可顯著降低Postn、ACTA2、Ctgf mRNA表達(dá)，尤其是Acta2，ACTA2蛋白是區(qū)別CFs和MFs的關(guān)鍵因素，也是MFs收縮力的主要來(lái)源[18]。此外，Postn基因調(diào)控、CTGF皆是ECM重要的組成成分，Postn可直接與膠原蛋白Ⅰ相互作用并調(diào)節(jié)原纖維直徑；CTGF能精細(xì)調(diào)節(jié)ECM微環(huán)境，過量表達(dá)可誘導(dǎo)膠原蛋白合成增加，加劇ECM沉積[19-20]。提示EMPA能抑制TGF-β誘導(dǎo)的CFs向MFs分化，減少ECM沉積。

綜上所述，EMPA可能通過調(diào)控TGF-β誘導(dǎo)的心臟CFs向MFs過度分化，減少ECM沉積和心肌纖維化，進(jìn)而改善AngⅡ/PE誘導(dǎo)的心臟重構(gòu)，為SGLT2抑制劑改善心衰預(yù)后提供理論依據(jù)，對(duì)心衰防治具有積極影響；但EMPA對(duì)CFs分化的具體調(diào)控機(jī)制尚不清楚，有待于進(jìn)一步研究。