姜黃素對膿毒癥模型小鼠肺損傷的作用及作用機制*

王文軍，汪 琳

（1. 電子科技大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬綿陽醫(yī)院·四川省綿陽市中心醫(yī)院，四川 綿陽 621000； 2. 中國海關(guān)科學(xué)技術(shù)研究中心，北京 100004）

膿毒癥是一種由感染引起的全身性炎性反應(yīng)綜合征，病情發(fā)展迅速，治療難度大，致死率高［1］。器官損傷和衰竭是膿毒癥的典型特征，肺是膿毒癥病程中受影響最大的器官［2］，25%～50%的膿毒癥患者會引發(fā)急性肺損傷［3］，死亡率為40%［4］。研究表明，膿毒癥的發(fā)病機制涉及復(fù)雜的全身炎性反應(yīng)，與炎性因子過度表達、凝血功能、氧化反應(yīng)和免疫功能紊亂有關(guān)，但目前尚無治療膿毒癥及其并發(fā)癥的有效方案［5］。氧化應(yīng)激參與膿毒癥病程［6］，姜黃素是從姜黃藥材中提取的活性成分，具有抗炎、抗氧化和免疫調(diào)節(jié)作用，利用酚羥基捕捉自由基，對肝損傷和氧化損傷起保護作用。本研究中探討了具有抗氧化特性的姜黃素治療膿毒癥模型小鼠肺損傷的作用及作用機制?，F(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 儀器、試藥與動物

儀器：Midi40 型二氧化碳恒溫培養(yǎng)箱（美國Thermo Fisher Scientific 公司）；Synergy4 型多功能酶標(biāo)儀，ChemiDocTM 型成像系統(tǒng)，CFX ConnectTM Real - time System 型熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）儀，均購于美國 Bio - Rad 公司；Centrifuge 5424R 型離心機（德國Eppendorf 公司）；ER-180A 型電子天平（日本A&D 公司，精度為0.001 g）。

試藥：姜黃素（批號為C1386，純度>98%），伊文思藍，甲酰胺，二甲基亞砜（DMSO），磷酸鹽緩沖液（PBS，批號為 806544），均購于美國 Sigma 公司；RIPA 裂解液，二喹啉甲酸（BCA）蛋白定量分析試劑盒，十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）凝膠配膠試劑盒，增強型化學(xué)發(fā)光（ECL）試驗試劑盒，腫瘤壞死因子-α（TNF - α）、白細胞介素 1β（IL - 1β）、白細胞介素 6（IL - 6）酶聯(lián)免疫吸附（ELISA）試驗試劑盒，均購于美國Thermo Fisher Scientific 公司；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、Trizol試劑盒（美國Promega 公司）；核因子類胡蘿卜素衍生2 樣因子（Nrf2）抗體（批號為ab137550），血紅素加氧酶1（HO -1）抗體（批號為ab13248），均購于美國Abcam 公司；磷酸脫氫酶（GAPDH，美國CST 公司，批號為5174s）；丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（ALT）、天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（AST）、血漿尿素氮（BUN）肝腎功能指標(biāo)檢測試劑盒（美國BioAssay Systems公司，貨號分別為EALT-100，EASTR-100，DIUR-100）。

動物：清潔級BALB/ c 小鼠48 只，雌雄各半，購于北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司，10～12 周齡，體質(zhì)量22～25 g。術(shù)前12 h禁食。

1.2 方法

分組、建模與給藥：48 只小鼠隨機分為假手術(shù)組（7只）、手術(shù)組（17只）、假手術(shù)+姜黃素組（7只）、手術(shù)+姜黃素組（17只）。采用盲腸結(jié)扎穿刺（CLP）法構(gòu)建膿毒癥模型小鼠，小鼠腹腔注射水合氯醛（60 μL/ 10 g）麻醉，剃去腹壁毛發(fā)，用碘消毒，前腹正中切口3 cm，取出盲腸，用6.0 絲線在距離盲端1.5 cm 處結(jié)扎，用22 號針頭在結(jié)扎處遠端穿孔1 次，擠出少許糞便，再將盲腸納入腹腔，逐層關(guān)腹。術(shù)后立即皮下注射0.9%氯化鈉注射液24 mL/kg，防止體液丟失過多。假手術(shù)組除以結(jié)扎及針頭對穿盲腸外，其他步驟與CLP 法一致。假手術(shù)組和手術(shù)組小鼠術(shù)后2 h 腹腔注射0.1%DMSO，假手術(shù)+姜黃素組和手術(shù)+姜黃素組術(shù)后2 h腹腔注射200 mg/kg姜黃素（用0.1%DMSO稀釋）。

生存率觀察：術(shù)后每天統(tǒng)計小鼠生存情況，術(shù)后7 d仍存活為生存，比較各組的生存率。

肝腎功能指標(biāo)及炎性因子水平檢測：術(shù)后24 h，各組小鼠麻醉后開腹，立即于下腔靜脈采全血100～400 μL，轉(zhuǎn)移至含乙二胺四乙酸的試管中，以10 000 r/min的轉(zhuǎn)速分離血漿，-80 ℃保存，備用。采用肝腎功能指標(biāo)檢測試劑盒檢測血漿中ALT，AST，BUN 的水平，采用ELISA試驗試劑盒檢測血漿中 TNF - α，IL - 1β，IL - 6 的水平，按試劑盒說明書操作。

肺濕干重比（W/D）計算：精密稱定未灌洗的新鮮左肺組織的質(zhì)量，即濕重（W）；再置60 ℃恒溫烤箱48 h至恒溫，稱定質(zhì)量，即干重（D）。計算W/D。

肺微血管滲透性檢測：小鼠處死前40 min，經(jīng)尾靜脈注射100 μL 1%伊文思藍溶液50 mg/ kg，處死小鼠后暴露胸腔，用PBS 灌洗肺血管至左心房無血性液體流出，收集肺組織，稱定質(zhì)量并記錄，再加入1 mL 甲酰胺，置60 ℃恒溫烤箱內(nèi)孵育16 h，取出，以2 000 r/min的轉(zhuǎn)速離心10 min，吸取上清液，采用酶標(biāo)儀于620 nm波長處測定吸光度。肺微血管滲透性，以伊文思藍滲漏指數(shù)表示，按公式伊文思藍滲漏指數(shù)= 肺組織伊文思藍含量/肺濕重計算。

肺組織核糖核酸（RNA）的提取和實時熒光定量PCR：用Trizol 試劑提取肺組織中總RNA，參照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書操作。采用實時熒光定量PCR 儀檢測獲得的互補基因（cDNA），總體積為20 μL。循環(huán)PCR 擴增標(biāo)準(zhǔn)程序，95 ℃預(yù)變性2 min，95 ℃變性5 s，60 ℃延伸30 s，共40個循環(huán)，延伸階段收集熒光信號，循環(huán)結(jié)束后分析溶解曲線。每例樣品設(shè)3 個平行復(fù)孔，重復(fù)3 次，取平均值，收集檢測數(shù)據(jù)，測定各樣品的Ct值，計算目的基因的相對表達量為2-ΔΔCt。以持家基因GAPDH 為內(nèi)參，退火溫度均為60 ℃，基因TNF- α，IL-6，IL-1β，GAPDH的相應(yīng)引物由生工生物工程（上海）有限公司合成，引物序列見表1。

表1 實時熒光定量PCR所用引物序列Tab.1 Primer sequences for real-time fluorescence quantitative PCR

免疫印跡（Western blot）法檢測：收集各組小鼠肺組織蛋白，并加入適量蛋白裂解液，剪碎，超聲處理，冷凍，離心（轉(zhuǎn)速為12 000 r/ min）10 min，吸取上清液進行BCA 蛋白定量分析。以12%SDS-PAGE 分離蛋白樣品，低電壓（100 V）轉(zhuǎn)移1.5 h 至硝酸纖維素膜，預(yù)染蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)標(biāo)識蛋白位置。用5%脫脂奶粉室溫封閉 1 h，含 5%BSA 的 TBST 稀釋一抗，4 ℃過夜，TBST 洗膜 3 次，每次 5 min，二抗室溫孵育 1 h，洗膜 3 次，每次5 min，ECL液顯色。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理

采用Image J 1.53a 版軟件計算Western blot 灰度值，采用Graphpad Prism 9.0軟件作圖及分析。計量資料用表示，計數(shù)資料用率（%）表示，多組間比較采用單因素方差分析。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 存活率

術(shù)后7 d，假手術(shù)組和假手術(shù)+姜黃素組小鼠的存活率均為100.00%（7/ 7）；手術(shù)組小鼠存活率為29.41%（5/17），術(shù)后48 h 達到1 d 死亡最高峰；手術(shù) +姜黃素組小鼠存活率為64.71%（11/ 17），顯著高于手術(shù)組的29.41%（P<0.05）。詳見圖1。

圖1 各組小鼠術(shù)后7 d存活率Fig.1 Survival rates within 7 d after the surgery in each group

2.2 相關(guān)器官損傷

由表2 可知，與假手術(shù)組比較，手術(shù)組小鼠的ALT，AST，BUN 水平、肺組織W/D、肺微血管滲透性均顯著升高（P< 0.05）；與手術(shù)組比較，手術(shù)+ 姜黃素組小鼠的ALT，AST，BUN 水平、肺微血管滲透性、肺組織W/D均顯著降低（P<0.05），假手術(shù)組小鼠是否給予姜黃素并不改變肺組織微血管的滲透性。

表2 各組小鼠肝腎功能指標(biāo)、伊文思藍滲漏指數(shù)與肺組織濕干重比比較（）Tab.2 Comparison of liver and kidney function indexes，leakage index by the Evans blue dye assay and W/D of lung issue in each group（）

表2 各組小鼠肝腎功能指標(biāo)、伊文思藍滲漏指數(shù)與肺組織濕干重比比較（）Tab.2 Comparison of liver and kidney function indexes，leakage index by the Evans blue dye assay and W/D of lung issue in each group（）

注：與假手術(shù)組比較，*P < 0.05，**P < 0.01；與手術(shù)組比較，#P < 0.05。表3和圖2同。Note：Compared with those in the sham surgery group，*P < 0.05，**P < 0.01；Compared with those in the surgery group，#P < 0.05（for Tab.2-3 and Fig.2）.

組別W/D 2.83±0.16 5.49±0.38**2.86±0.30 4.01±0.23#假手術(shù)組（n=7）手術(shù)組（n=17）假手術(shù)+姜黃素組（n=7）手術(shù)+姜黃素組（n=17）ALT（U/L）13.65±0.24 44.04±7.25*13.32±0.29 22.51±2.04#AST（U/L）17.69±3.53 57.35±5.19*15.77±1.91 36.40±4.36#BUN（U/L）36.69±0.92 93.01±7.83*33.03±3.09 62.28±5.25#伊文思藍滲漏指數(shù)（ng/mg）13.43±1.57 31.22±3.98*17.51±1.78 20.57±1.89#

2.3 小鼠血漿炎性因子水平

與假手術(shù)組比較，假手術(shù)+ 姜黃素組小鼠血漿中TNF- α，IL-6，IL-1β 水平均無顯著差異（P>0.05），手術(shù)組小鼠血漿中TNF- α，IL-6，IL-1β 的水平均顯著升高（P< 0.05）；與假手術(shù)+ 姜黃素組比較，手術(shù)+姜黃素組小鼠血漿中TNF- α，IL-6，IL-1β 的水平均顯著升高（P< 0.05）；與手術(shù)組比較，手術(shù)+ 姜黃素組小鼠血漿中TNF- α，IL-6，IL-1β 的表達水平均顯著降低（P< 0.05）。詳見表3?？梢?，姜黃素可減輕CLP 導(dǎo)致膿毒癥模型小鼠的早期全身炎性反應(yīng)。

表3 各組小鼠血漿中炎性因子水平比較（，pg/mL）Tab.3 Comparison of inflammatory factor levels in plasma in each group（，pg/mL）

表3 各組小鼠血漿中炎性因子水平比較（，pg/mL）Tab.3 Comparison of inflammatory factor levels in plasma in each group（，pg/mL）

注：與假手術(shù) + 姜黃素組比較，△P < 0.05，△△P < 0.01。圖2同。Note：Compared with those in the sham surgery + curcumin group，△P < 0.05，△△P < 0.01（for Tab.3 and Fig.2）.

IL-1β 15.60±2.09 34.62±1.76*14.19±0.83 22.46±1.42#△組別假手術(shù)組（n=7）手術(shù)組（n=17）假手術(shù)+姜黃素組（n=7）手術(shù)+姜黃素組（n=17）TNF-α 12.14±1.46 70.30±10.55*11.81±0.55 40.30±4.94#△IL-6 14.25±4.91 43.64±11.35*13.99±5.63 17.00±3.28#△

2.4 肺組織損傷

提取肺組織RNA，采用實時熒光定量PCR 儀檢測TNF - α，IL - 6，IL - 1β 在 mRNA 中的表達水平，結(jié)果見圖2 A。與假手術(shù)組比較，手術(shù)組小鼠肺組織中TNF-α，IL - 6，IL - 1β 在 mRNA 中的表達水平分別上升了3.6 倍、3.6倍、5.4倍，差異顯著（P<0.05）；與手術(shù)組比較，手術(shù)+姜黃素組小鼠肺組織中TNF-α，IL-6，IL-1β在mRNA中的表達水平分別降低了1.4倍、1.7倍、2.0倍，差異顯著（P< 0.05）?？梢?，姜黃素可減輕肺組織中的炎性反應(yīng)。采用Western blot 法檢測小鼠肺組織中Nrf2和HO-1的蛋白表達水平，結(jié)果見圖2 B至圖2 D。與假手術(shù)組比較，假手術(shù)+ 姜黃素組小鼠肺組織中Nrf2和HO-1的表達水平均無顯著差異（P>0.05），手術(shù)組小鼠肺組織中Nrf2 和HO - 1 的表達水平均顯著升高（P< 0.05）；與手術(shù)組比較，手術(shù)+ 姜黃素組小鼠肺組織中Nrf2和HO-1的表達水平均顯著升高（P<0.05）；與假手術(shù)+ 姜黃素組比較，手術(shù)+ 姜黃素組小鼠肺組織中Nrf2和HO-1表達水平均顯著升高（P<0.01）。

圖2 姜黃素對小鼠肺組織中炎性因子和Nrf2/HO-1表達水平的影響Fig.2 Effect of curcumin on the expression levels of inflammatory factors and Nrf2/HO-1 in lung tissue of mice

3 討論

膿毒癥是重癥監(jiān)護室患者最常見的死亡原因［7］。姜黃素是從姜科植物根莖中提取的天然多酚類化合物，具有抗菌、抗氧化、抗腫瘤、抗炎等作用［8］。LIN［9］采用內(nèi)毒素或細菌注射構(gòu)建膿毒癥動物模型，發(fā)現(xiàn)姜黃素治療膿毒癥有效。本研究中首先觀察姜黃素對CLP誘導(dǎo)膿毒癥模型小鼠生存率的影響，結(jié)果顯示，姜黃素可改善膿毒癥模型小鼠術(shù)后7 d的存活率（尤其是在術(shù)后48 h），手術(shù)組小鼠的死亡率顯著高于手術(shù)+姜黃素組，提示用姜黃素及早干預(yù)治療膿毒癥對提高生存率有重要作用。而膿毒癥患者肺損傷和腎損傷的早期發(fā)現(xiàn)對后續(xù)治療和預(yù)后尤其重要，ALT，AST，BUN等指標(biāo)可提示肝、腎功能損傷［10］。本研究結(jié)果顯示，手術(shù)+姜黃素組小鼠術(shù)后24 h血漿中肝、腎功能的損傷減輕，肺W/D 顯著降低，尤其是肺微血管滲透性顯著降低，表明姜黃素可減輕早期膿毒癥肺及肝、腎功能的損傷，從而降低死亡率。

膿毒癥主要發(fā)生于嚴重感染或術(shù)后并發(fā)癥［1］，引起的肝功能損傷與炎性因子的過度產(chǎn)生、氧自由基損傷、氧供需失衡等因素有關(guān)［2］，故調(diào)控以上因素可減輕膿毒癥的肝功能損傷。IL-6 是繼TNF- α 和IL-1β 后在膿毒癥早期發(fā)病過程中起關(guān)鍵作用的炎性因子，可直接激活血管內(nèi)皮細胞及炎性細胞，并誘導(dǎo)上皮細胞及其他細胞，從而增強炎性反應(yīng)。本研究結(jié)果顯示，CLP手術(shù)誘導(dǎo)的早期膿毒癥模型小鼠血漿中TNF - α，IL - 6，IL - 1β 等炎性因子水平均顯著升高，表明早期抑制膿毒癥的肝細胞炎性反應(yīng)可減輕膿毒癥的肝功能損傷。姜黃素抗炎作用顯著，可抑制炎性因子表達，減輕重癥急性胰腺炎模型大鼠的腎功能損傷［11］。研究發(fā)現(xiàn)，在香煙提取物處理的RAW246.7 細胞中，姜黃素可抑制核因子 - κB（NF - κB）信號通路，減少促炎因子的釋放［12］。本研究結(jié)果顯示，CLP 手術(shù)誘導(dǎo)的膿毒癥模型小鼠術(shù)后用姜黃素治療，血漿中TNF - α，IL - 6，IL - 1β的表達水平均顯著降低，肺組織中相關(guān)炎性因子的分泌也顯著減少，改善CLP 手術(shù)誘導(dǎo)的小鼠肺損傷的效果顯著。氧化應(yīng)激是導(dǎo)致膿毒癥肺損傷發(fā)展的主要因素，抑制氧化應(yīng)激可減輕膿毒癥的肺損傷［13］，故認為增強抗氧化能力可減少氧化應(yīng)激，是對抗膿毒癥肺損傷的有效治療方法。Nrf2是一種具有強效抗氧化特性的蛋白質(zhì)［14］，通過直接注射Nrf2 腺病毒或間接干預(yù)（如缺血后處理）激活Nrf2，可減少多種疾病模型老鼠中的肺損傷［15-16］?？梢姡琋rf2的激活在減緩肺損傷過程中起關(guān)鍵作用。本研究結(jié)果顯示，與假手術(shù)組比較，手術(shù)組小鼠肺組織中Nrf2和HO-1的蛋白表達水平均顯著升高，而用姜黃素治療可進一步增加肺組織中Nrf2和HO-1的蛋白表達水平。故認為姜黃素是通過激活Nrf2/HO-1信號通路來增強抗氧化能力而減輕膿毒癥肺損傷的。

綜上所述，在膿毒癥的早期治療中，姜黃素可通過Nrf2/ HO - 1 信號通路抑制炎性反應(yīng)和增強抗氧化能力，從而減輕膿毒癥模型小鼠的肺損傷，其可能是治療膿毒癥的潛在有效藥物。