中國內(nèi)地首例猴痘病毒樣本的核酸PCR正交試驗(yàn)比對分析

宗 華，孫 巧，李彩云，殷 靜，羅青梅，王夢佳

400067 重慶，重慶市南岸區(qū)疾病預(yù)防控制中心微生物檢驗(yàn)科1； 400016 重慶，重慶醫(yī)科大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院2

猴痘是由猴痘病毒感染所致的一種病毒性人獸共患病，病毒經(jīng)黏膜和破損皮膚侵入人體，臨床表現(xiàn)主要為發(fā)熱、皮疹、淋巴結(jié)腫大，部分患者可出現(xiàn)并發(fā)癥，包括皮損部位繼發(fā)細(xì)菌感染、腦炎等[1-3]。猴痘被稱為一種發(fā)疹綜合征，與天花幾乎沒有區(qū)別，天花是一種在 1970 年代后期通過疫苗接種根除的疾病，猴痘則是由另一種正痘病毒引起[4-5]。猴痘最近被世界衛(wèi)生組織列為國際關(guān)注的突發(fā)公共衛(wèi)生事件，雖然目前大多數(shù)病例是與男男性行為者[6]，但疾病蔓延到一般人群的威脅更大。2022年1月1日至2022年7月20日期間，在世衛(wèi)組織所有6個(gè)區(qū)域，共有72個(gè)國家向世衛(wèi)組織報(bào)告了14 533例可能病例和實(shí)驗(yàn)室確診病例(包括尼日利亞的3例死亡和中非共和國的2例死亡)[7-8]。作為一種DNA病毒，MPX病毒的遺傳結(jié)構(gòu)不太可能發(fā)生重大和頻繁的變化[9]。PCR技術(shù)由于特異性高、靈敏度強(qiáng)等諸多優(yōu)點(diǎn)，已經(jīng)成為分子生物學(xué)中的常規(guī)技術(shù)，RT-qPCR技術(shù)是通過熒光信號對PCR進(jìn)程進(jìn)行實(shí)時(shí)監(jiān)測，并對未知模板進(jìn)行定量分析的一種方法，如今RT-qPCR檢測越來越多地運(yùn)用到食品工業(yè)、醫(yī)學(xué)診斷、病毒檢測、病原學(xué)追蹤等方面，并取得顯著效果[10-13]。2022年9月14日重慶市檢出中國大陸第一例猴痘病毒，本文旨在從試驗(yàn)室檢測技術(shù)角度出發(fā)，利用現(xiàn)有的提取試劑、擴(kuò)增試劑以及使用的RT-qPCR儀使用正交試驗(yàn)方案開展檢測，目的在于對新發(fā)傳染病的檢測效率做一次比對分析。為實(shí)驗(yàn)室檢測猴痘病毒時(shí)選擇試劑儀器提供參考意見，為后續(xù)國內(nèi)的猴痘的流行病學(xué)調(diào)查與處置提供數(shù)據(jù)支撐。

1 資料與方法

1.1 患者流行病學(xué)史

2022年8月24～31日，患者在國內(nèi)活動。9月1～13日，在歐洲旅居。9月3日在歐洲某國發(fā)生一次高風(fēng)險(xiǎn)暴露行為，潛伏期約為6 d。9月13日乘飛機(jī)回國，9月14日到達(dá)重慶后轉(zhuǎn)入某區(qū)集中隔離點(diǎn)，當(dāng)日出現(xiàn)咽喉干癢、皮疹(圖1)等身體不適。隔離點(diǎn)醫(yī)療組核實(shí)后立即向該區(qū)疾病預(yù)防控制中心報(bào)告，經(jīng)重慶市疾病預(yù)防控制中心復(fù)核猴痘病毒核酸檢測結(jié)果后立即轉(zhuǎn)入重慶市公衛(wèi)中心進(jìn)行診療。

本研究經(jīng)重慶市南岸區(qū)疾病預(yù)防控制中心倫理委員會審查批準(zhǔn)[2022年倫審(009)號]。

1.2 樣本來源

隔離點(diǎn)對該病例進(jìn)行采樣，送區(qū)疾病預(yù)防控制中心開展猴痘病毒檢測，口咽拭子和鼻咽拭子混合樣(Ct值：31.37，卓誠惠生)、皰疹液(Ct值：31.64，卓誠惠生)的核酸結(jié)果均為猴痘病毒陽性，當(dāng)天再次采集樣本送重慶市疾病預(yù)防控制中心檢測為陽性，陽性樣本送至中國疾病預(yù)防控制中心復(fù)核為猴痘病毒陽性，重慶市疾病預(yù)防控制中心經(jīng)基因測序，確認(rèn)該猴痘病毒屬于西非系B.1分支。由于首例樣本，標(biāo)本量有限，本次試驗(yàn)選擇采集的口咽拭子和鼻咽拭子混合樣本作為研究對象，按照設(shè)計(jì)的正交試驗(yàn)方案，開展樣品核酸檢測。

1.3 儀器與試劑

兩種提取試劑分別是重慶中元和江蘇碩世DNA提取試劑盒(后續(xù)表格中分別用A、B表示)、4種擴(kuò)增試劑分別是北京卓誠、江蘇碩世、廣州達(dá)安和深圳生科原猴痘病毒核酸擴(kuò)增試劑盒(后續(xù)表格中分別用A、B、C、D表示)，兩種RT-qPCR儀分別是美國伯樂(型號：CTX96TM)和杭州博日(型號：FQD-96A)(后續(xù)表格中分別用A、B表示)。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

根據(jù)中國疾控中心下發(fā)的猴痘防控技術(shù)指南(2022版)附件3猴痘病毒試驗(yàn)室檢測技術(shù)指南[14]的要求，按照《人間傳染的病原微生物名錄》[15]中的有關(guān)規(guī)定，滅活的猴痘病毒樣本在生物安全二級試驗(yàn)室進(jìn)行核酸提取和擴(kuò)增。試驗(yàn)室設(shè)計(jì)了本次試驗(yàn)的方案(見表1)，按照此方案進(jìn)行重復(fù)3次檢測。

圖1 猴痘病例的皮疹(A)和膿皰(B)(患者成年男性，于2022年9月14日在重慶市公共衛(wèi)生中心診療)

表1 猴痘病毒樣本的核酸PCR正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案

1.5 結(jié)果判斷

按照4種擴(kuò)增試劑盒說明書對結(jié)果進(jìn)行判讀。具體如下：卓誠擴(kuò)增試劑Ct值≤36，陽性，最低檢出限：1 000 copies/mL。碩世擴(kuò)增試劑Ct值≤37，陽性，最低檢出限：1 000 copies/mL。達(dá)安擴(kuò)增試劑Ct值≤40，陽性，最低檢出限：200 copies/mL。生科原擴(kuò)增試劑Ct值≤35.5，陽性，最低檢出限：500 copies/mL。

1.6 統(tǒng)計(jì)分析

猴痘病毒樣本的核酸PCR檢測結(jié)果Ct值，使用SPSS 26.0版本對正交試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行多因素極差分析和多因素方差分析，對驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行t檢驗(yàn)。

1.7 實(shí)驗(yàn)的質(zhì)量控制

核酸檢測試驗(yàn)室質(zhì)控是一系列措施的集合[16]。RT-qPCR技術(shù)具有靈敏度高、重復(fù)性好等特點(diǎn)，整個(gè)檢測過程受樣本采集、人員操作、試劑、環(huán)境等因素影響。本次試驗(yàn)用試劑盒自帶的陰陽對照以及內(nèi)標(biāo)進(jìn)行樣本質(zhì)控，檢測人員具備核酸檢測培訓(xùn)及崗位授權(quán)，同時(shí)按照《醫(yī)學(xué)試驗(yàn)室質(zhì)量和能力認(rèn)可準(zhǔn)則》的要求，每年至少參加了1次國家級或省級的能力驗(yàn)證考核，試劑耗材、儀器設(shè)備經(jīng)過了試劑驗(yàn)收、性能驗(yàn)證等措施后用于本次檢測。

2 結(jié)果

2.1 正交試驗(yàn)檢測結(jié)果

正交試驗(yàn)檢測結(jié)果取樣本按正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案開展試驗(yàn)，3次試驗(yàn)陰性、陽性質(zhì)控均正常，核酸檢測結(jié)果見表2，可見從提取到擴(kuò)增均能準(zhǔn)確檢出核酸樣本，但不同試劑和儀器間的組合的確存在差異。

表2 猴痘病毒樣本的核酸PCR正交試驗(yàn)3次檢測(Ct值)結(jié)果

2.2 不同稀釋濃度檢測結(jié)果

不同稀釋濃度檢測結(jié)果按正交試驗(yàn)方案，對其中一次提取的核酸進(jìn)行10倍和100倍稀釋，核酸檢測結(jié)果見表3，可見低拷貝濃度下，用于本次擴(kuò)增的4種核酸檢測試劑盒均能檢出不同濃度的核酸樣本。

表3 猴痘病毒樣本的核酸PCR不同稀釋濃度核酸檢測(Ct值)結(jié)果

2.3 正交試驗(yàn)結(jié)果分析

統(tǒng)計(jì)分析顯示，RT-qPCR儀檢測中循環(huán)數(shù)(即Ct值)與擴(kuò)增效率成負(fù)相關(guān)。多因素極差分析結(jié)果顯示3種試驗(yàn)因子中RT-qPCR儀對試驗(yàn)結(jié)果的影響最大，提取試劑對比A

表4 猴痘病毒樣本的核酸PCR多因素極差分析結(jié)果

K值：某因素某水平時(shí)試驗(yàn)數(shù)據(jù)求和；Kavg值：對應(yīng)的平均值；最佳水平：某因子時(shí)最佳Kavg值對應(yīng)的水平編號；R：因素的極差值，該值=某因素時(shí)，Kavg最大值減去Kavg最小值，可結(jié)合因素極差值對比各因素的優(yōu)劣；水平數(shù)量：某因素的水平數(shù)；每水平重復(fù)數(shù)r：水平的平均試驗(yàn)重復(fù)次數(shù)；混合型正交表則提供折算系數(shù)d(結(jié)合水平數(shù)量在折算系數(shù)表中找到)和R’值

多因素方差分析顯示，因子1 (提取試劑)并不會對結(jié)果(Ct值)產(chǎn)生差異關(guān)系(P>0.05)，因子2 (PCR儀器)、因子3 (擴(kuò)增試劑)會對結(jié)果(Ct值)產(chǎn)生顯著性差異關(guān)系(P<0.05，表5)。

表5 猴痘病毒樣本的核酸PCR多因素方差分析結(jié)果

各因素對應(yīng)水平

2.4 驗(yàn)證試驗(yàn)比對結(jié)果

將上述統(tǒng)計(jì)學(xué)處理的結(jié)果進(jìn)行組合，選取提取試劑A、RT-qPCR儀B、擴(kuò)增試劑C作為最優(yōu)組合，與比對組(提取試劑A、RT-qPCR儀B、擴(kuò)增試劑B)的組合進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，由于提取試劑無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，試驗(yàn)編號3的組合是8次正交試驗(yàn)中Ct值最低的組合之一，所以選擇該組合作為比對組來開展檢測，每次檢測均帶入水痘-帶狀皰疹病毒陽性樣本的核酸進(jìn)行試驗(yàn)，作為試驗(yàn)避免假陽性的質(zhì)控方式。

驗(yàn)證試驗(yàn)利用t檢驗(yàn)分析，最優(yōu)組和比對組對于Ct值全部均呈現(xiàn)出顯著性差異關(guān)系(P<0.05)。圖3A中曲線1Ct值(19.70，最優(yōu)組)小于曲線2(21.09，比對組)；圖3B中曲線3Ct值(19.93，最優(yōu)組)小于曲線4(21.18，比對組)；圖3C中曲線5Ct值(19.83，最優(yōu)組)小于曲線6(21.11，比對組)，可見最優(yōu)組的檢測效率高于比對組。本次試驗(yàn)帶入水痘-帶狀皰疹病毒陽性樣本，用猴痘試劑盒檢測結(jié)果全為陰性，說明質(zhì)控手段和數(shù)據(jù)結(jié)果真實(shí)有效。

3 討論

疾病預(yù)防控制中心在處理流感、諾如病毒引起的聚集性疫情以及應(yīng)對新冠、猴痘病毒等新發(fā)傳染病時(shí)首選RT-qPCR技術(shù)，其發(fā)揮了重要作用。本次試驗(yàn)對提取的核酸進(jìn)行10倍和100倍稀釋，循環(huán)數(shù)增加3.3個(gè)循環(huán)左右[17-18]，運(yùn)用RT-qPCR技術(shù)進(jìn)行檢測，試驗(yàn)結(jié)果較為吻合。同時(shí)在稀釋到低拷貝濃度的情況下，檢測試劑對猴痘病毒的核酸檢出效率較為穩(wěn)定，質(zhì)控對照均正常，目前國內(nèi)上述的DNA提取試劑和猴痘擴(kuò)增試劑的質(zhì)量準(zhǔn)確可靠。

鑒于該猴痘病例為中國內(nèi)地首例發(fā)現(xiàn)，可能對新發(fā)傳染病認(rèn)識還不足，對病原體檢測還存在不確定性，我們設(shè)計(jì)了正交試驗(yàn)方案開展試驗(yàn)。正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)是研究多因素多水平的重要數(shù)理方法，也是對試驗(yàn)因素作合理的、有效的安排，最大限度地減少試驗(yàn)誤差，是一種高效率、快速、經(jīng)濟(jì)的試驗(yàn)設(shè)計(jì)方法[19-21]。從本次試驗(yàn)結(jié)果看，提取試劑提取效率存在差異，但比對結(jié)果無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。擴(kuò)增試劑盒檢測循環(huán)數(shù)、 PCR儀器

A：第1次驗(yàn)證試驗(yàn)；B：第2次驗(yàn)證試驗(yàn)；第3次驗(yàn)證試驗(yàn)

在對熒光信號的捕捉上差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示我們在新發(fā)傳染病的檢測中需要對檢測試劑和儀器進(jìn)行驗(yàn)證，是提高檢測效率很重要的手段。根據(jù)極差分析結(jié)果，PCR儀器的熒光捕捉信號的差異在本次試驗(yàn)的多因素中最為關(guān)鍵，不同品牌PCR 儀在熒光捕捉方式，使用者對儀器的定期維護(hù)保養(yǎng)，使用過程中對儀器的熟練程度等都直接關(guān)系到檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性和有效性，提升儀器的使用管理水平也是檢測過程的重要環(huán)節(jié)。

檢測閾值是探針設(shè)計(jì)過程中對該試劑相對穩(wěn)定的檢測臨界值體現(xiàn)，各品牌試劑的檢測Ct值和最低檢出限存在差異，對高濃度核酸標(biāo)的物進(jìn)行檢測并無太大影響。檢測時(shí)需注意弱陽性樣本的檢測質(zhì)量。此次病例標(biāo)本量較少，對提取試劑、擴(kuò)增試劑以及RT-qPCR儀的比對結(jié)果還缺少一定的數(shù)據(jù)支撐，下一步工作我們收集到一定數(shù)量的樣本可運(yùn)用ROC曲線深入分析各試劑盒的靈敏度和特異性。

在應(yīng)對新發(fā)傳染病檢測中，RT-qPCR技術(shù)快速靈敏，應(yīng)注意試劑和儀器的選擇及檢測流程的質(zhì)量把控，力求試驗(yàn)結(jié)果精準(zhǔn)有效。