天然小分子HEP-14抗黑色素瘤細(xì)胞SK-Mel-103的作用研究

劉 芳，鐘 沁，王 賢，韋睿然，桂黎明

550004 貴陽(yáng)，貴州醫(yī)科大學(xué)：基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院免疫學(xué)教研室1，組織工程與干細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中心2；230031 合肥，安徽醫(yī)科大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)部3

人類惡性黑色素瘤是一種具有高度侵襲性的癌癥。由于腫瘤異質(zhì)性，其中包含致瘤性不斷增強(qiáng)的癌細(xì)胞亞群，使其成為難治的耐藥性腫瘤之一。同時(shí)，伴隨對(duì)黑色素瘤發(fā)展的分子機(jī)制和遺傳分析的深入研究，黑色素瘤也是其他轉(zhuǎn)移性癌癥診治的理想研究模型[1]。早期手術(shù)切除黑色素瘤后的根治率較高，但殘余或晚期黑色素瘤仍具有較高的惡性轉(zhuǎn)移能力和侵襲性，靶向治療(如BRAF抑制劑、MEK抑制劑等)[2]、免疫治療(如單抗PD-1抗體或與抗CTLT-4抗體聯(lián)合使用)的發(fā)展[3]，已使晚期黑色素瘤患者的臨床治療顯著改善，總體生存率提高，但這些藥物治療成果也僅限于某類黑色素瘤患者，而且在治療過程中可能伴隨致癌信號(hào)通路的再激活、脫靶效應(yīng)及耐藥基因的出現(xiàn)，導(dǎo)致治療后復(fù)發(fā)和再次轉(zhuǎn)移[4-5]。因此，需要開發(fā)新的藥物來克服目前治療藥物的局限性。黑色素瘤中不同亞型之間存在特異或差異性基因的表達(dá)(如PENT、NRAS、TP53、CDKN2A、MITF)[6]，基因表達(dá)的差異決定了黑色素瘤的組織病理特征、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移部位和速度、藥物治療效果，也因此區(qū)別不同的黑色素瘤亞型[7-8]?？梢姁盒院谏亓龅乃幬镩_發(fā)，是基于可靠的分子篩查靶點(diǎn)。

CD271是一種低親和力神經(jīng)生長(zhǎng)因子(low-affinity nerve growth factor, NGF)受體或p75神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子受體，是腫瘤壞死因子受體(tumor necrosis factor receptor, TNFR)超家族成員，在多種癌組織中表達(dá)并發(fā)揮重要作用。10個(gè)黑色素瘤中有9個(gè)呈現(xiàn)異質(zhì)性表達(dá)CD271[9]。CD271作為黑色素瘤起始細(xì)胞(MICs,又稱黑色素瘤干細(xì)胞)亞群的重要標(biāo)志物[10-11]，與腫瘤細(xì)胞形成、遷移和復(fù)發(fā)密切相關(guān)[12]。無論CD271是否作為黑色素瘤干細(xì)胞亞群的標(biāo)記物[11]，它在黑色素瘤中的作用已被充分證實(shí)，抑制CD271的表達(dá)能降低腫瘤形成能力和體外細(xì)胞遷移能力[13-15]。STAT3在癌癥中發(fā)揮著重要作用[16-17]，在高表達(dá)CD271的黑色素瘤轉(zhuǎn)移病灶中，同時(shí)檢測(cè)到被高度激活的STAT3[15-16,18]，其依賴的信號(hào)通路在介導(dǎo)黑色素瘤細(xì)胞向肺部、大腦轉(zhuǎn)移的過程中同樣起到關(guān)鍵的調(diào)控作用[19]；提示黑色素瘤中CD271的表達(dá)可能與STAT3依賴的信號(hào)通路調(diào)控相關(guān)。

天然小分子作為治療藥物具有較高的組織和腫瘤滲透率，可以相對(duì)容易地穿過細(xì)胞膜和其他生物屏障，進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)靶點(diǎn)[20-21]。HEP-14(5β-O-angelate-20-deoxyingenol)是從天然植物南歐大戟中提取的天然小分子，是一種類似于吲哚或吲哚甲丁酸酯的化合物。研究顯示HEP-14 家族化合物能調(diào)控子宮頸癌HeLa細(xì)胞、神經(jīng)母細(xì)胞瘤和肝癌細(xì)胞的溶酶體生物發(fā)生，且HEP-14可顯著減少阿爾茨海默疾病模型小鼠腦部淀粉樣蛋白沉積斑塊的累積，是溶酶體相關(guān)疾病的可行治療選擇[22]。本課題組在前期用黑色素瘤細(xì)胞對(duì)HEP-14做活性篩查時(shí)發(fā)現(xiàn)天然小分子HEP-14對(duì)黑色素瘤細(xì)胞的表型和生長(zhǎng)有較強(qiáng)抑制作用，但其在黑色素瘤中的抗腫瘤機(jī)制尚不清除。因此本研究旨在運(yùn)用天然小分子HEP-14作用于黑色素瘤細(xì)胞SK-MEL-103，觀察其對(duì)黑色素瘤的影響及初步探討其可能的機(jī)制，為后期深入研究提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 藥物與試劑

天然小分子HEP-14由中國(guó)科學(xué)院昆明植物所郝小江院士組提取和贈(zèng)送[22]。用DMSO配制成10 mmol/L儲(chǔ)存液，保存在-20℃冰箱備用。DMEM細(xì)胞培養(yǎng)基(貨號(hào)C1995500BT)、0.25% 胰酶(貨號(hào)25200-056)、雙抗(貨號(hào) 15140122)購(gòu)自美國(guó)Gibco公司；胎牛血清(貨號(hào) SE100-B)購(gòu)自北京宏嶺隆成科技有限公司；二甲基亞砜(DMSO，貨號(hào)D8371)、ANNEXIN V-Alexa Fluor 647/PI Kit凋亡檢測(cè)試劑盒(貨號(hào) CA1050)、高效RIPA組織/細(xì)胞裂解液(貨號(hào) R0010)、細(xì)胞周期試劑盒(貨號(hào) CA1510)購(gòu)自Solarbio公司；細(xì)胞增殖與毒性檢測(cè)試劑(CCK8，貨號(hào)GK10001)購(gòu)自GLPBIO公司；BCA蛋白定量/濃度測(cè)定試劑盒(貨號(hào) ES6002)、RNA-Quick purification Kit (貨號(hào)RN001)、2X Super SYBR qPCR Master MIX(貨號(hào) QP002)、快速逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(貨號(hào)RT001)購(gòu)自上海奕杉生物科技有限公司；5×蛋白加樣緩沖液(貨號(hào) GF1811)購(gòu)自Genefist公司；Goat Anti-Rabbit IgG (H+L) HRP(貨號(hào) S0001)、β-actin(貨號(hào)AF7018)、CD271(貨號(hào)AF0360)、STAT3(貨號(hào)AF6294)、p-STAT3(Tyr705，貨號(hào)AF3293)購(gòu)自Affinity公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 人黑色素瘤SK-Mel-103、SK-Mel-147、SK-Mel-28細(xì)胞株由María S. Soengas博士(西班牙國(guó)家癌癥研究中心)贈(zèng)送。SK-Mel-103細(xì)胞復(fù)蘇后，接種于含10%的胎牛血清及1%雙抗的DMEM高糖培養(yǎng)基，置于5%CO2、37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。2～3 d傳代1次，取對(duì)數(shù)期細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，分別用不同濃度HEP-14處理細(xì)胞，每個(gè)濃度組至少3個(gè)重復(fù)。

1.2.2 CCK8實(shí)驗(yàn)測(cè)定細(xì)胞活力與增殖 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞按每孔5×103個(gè)接種于96孔板，細(xì)胞貼壁后，用HEP-14(2.5，5，10，20，40 μmol/L)處理后繼續(xù)培養(yǎng)24～72 h，每個(gè)濃度組設(shè)置4個(gè)復(fù)孔。培養(yǎng)結(jié)束時(shí)，每孔加入10 μL CCK-8試劑，避光培養(yǎng)2 h，酶標(biāo)儀測(cè)定450 nm處的光密度值，計(jì)算細(xì)胞存活率，公式為細(xì)胞存活率=[D(450)實(shí)驗(yàn)孔-D(450)空白孔)]/[D(450)對(duì)照孔-D(450)空白孔]×100%。用Graphpad Prism 6.0 軟件計(jì)算藥物半數(shù)抑制濃度(IC50)。

1.2.3 平板克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞增殖能力 藥物處理72 h后，每個(gè)濃度組取2 mL細(xì)胞懸液(約5×102個(gè)細(xì)胞) 接種到12孔板中，置于培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)2周，每3天更換培養(yǎng)基，當(dāng)有肉眼可見的克隆出現(xiàn)時(shí)終止培養(yǎng)，棄去培養(yǎng)基，甲醇固定后結(jié)晶紫染色，計(jì)數(shù)細(xì)胞克隆數(shù)，大于50個(gè)細(xì)胞的集落記為有效克隆，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.4 細(xì)胞形態(tài)觀察 將細(xì)胞以2×105/孔接種于6孔板，待細(xì)胞貼壁后更換含HEP-14(5, 10, 20 μmol/L)的培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24～72 h。待培養(yǎng)結(jié)束時(shí)，用倒置顯微鏡觀察并拍攝每個(gè)濃度組細(xì)胞形態(tài)變化。

1.2.5 Transwell遷移實(shí)驗(yàn)檢測(cè)各濃度組細(xì)胞縱向遷移情況 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞接種于12 孔板內(nèi)，分別為空白組和HEP-14組，每組3個(gè)復(fù)孔。孵育24 h， HEP-14作用48 h后的細(xì)胞用含0.1% BSA的DMEM培養(yǎng)基分別配成2.5×105/mL 細(xì)胞懸液，將小室放入24 孔板內(nèi)，下室加入含20% FBS的培養(yǎng)基750 μL，上室加入細(xì)胞懸液 200 μL，孵育箱內(nèi)培養(yǎng) 24 h。移去培養(yǎng)基，PBS 潤(rùn)洗2次，去除上室未遷移細(xì)胞，4%多聚甲醛固定5 min，移去甲醛，PBS 潤(rùn)洗2次，1%結(jié)晶紫染液避光染色30 min，PBS潤(rùn)洗2次，棉簽擦干上室內(nèi)未遷移細(xì)胞，倒置顯微鏡下拍照。

1.2.6 細(xì)胞周期 胰酶消化各組細(xì)胞后，用預(yù)冷的70%乙醇固定細(xì)胞，4 ℃ 過夜，第2天用PBS洗滌細(xì)胞2次，收集沉淀。將RNase A∶PI 按1∶9體積配制成染色工作液，500 μL PI/RNase A 染色工作液重懸細(xì)胞，避光孵育30 min 后，流式細(xì)胞儀記錄在488 nm 激發(fā)波長(zhǎng)處紅色熒光，檢測(cè)細(xì)胞周期。

1.2.7 細(xì)胞凋亡檢測(cè) 用HEP-14(5，10，20 μmol/L)處理細(xì)胞72 h，待培養(yǎng)結(jié)束時(shí)，用不含 EDTA 的胰蛋白酶消化細(xì)胞，PBS 洗滌，1×結(jié)合緩沖液重懸細(xì)胞，調(diào)節(jié)細(xì)胞濃度為(1～6)×106/mL，取100 μL細(xì)胞懸液于流式管中，加入5 μL Annexin V-Alexa Fluor 647混勻后室溫避光5min，加入10 μL 20 μg/mL的溴化丙啶溶液(PI)，加400 μL PBS，利用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況。

1.2.8 RT-qPCR分析mRNA表達(dá) HEP-14(5，10，20 μmol/L)處理SK-Mel-103細(xì)胞72 h，收集各組細(xì)胞，提取總RNA，逆轉(zhuǎn)錄為 cDNA，進(jìn)行定量PCR擴(kuò)增反應(yīng)，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔，重復(fù)至少3次。擴(kuò)增條件為: 95 ℃預(yù)變性5 min，95 ℃變性10 s，60 ℃退火30 s，共進(jìn)行40個(gè)循環(huán)。以 2-ΔΔCt法計(jì)算mRNA的相對(duì)表達(dá)量，所使用基因及引物序列如下：β-actin上游引物5′-GTGCTATCCCTGTACGCCTC-3′，下游引物5′-CGGACTCGTCATACTCCTGC-3′；STAT3上游引物5′-CAGCAGCTTGACACACGGTA-3′，下游引物5′-AAACACCAAAGTGGCATGTGA-3′；CD271上游引物5′-CCGTTGGATTACACGGTCCAC-3′，下游引物5′-TGAAGGCTATGTAGGCCACAA-3′。

1.2.9 Western blot檢測(cè)蛋白表達(dá) 將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞，以2.5×105/mL 接種于6孔板，待細(xì)胞貼壁后，分別將終濃度為5，10，20 μmol/L 的HEP-14處理72 h。用RIPA(含PMSF 蛋白酶抑制劑)裂解液提取蛋白，BCA 法測(cè)定蛋白濃度，蛋白變性。蛋白樣品每孔20 μg 經(jīng) PAGE 凝膠電泳后轉(zhuǎn)至 PVDF 膜，5% 脫脂牛奶封閉2 h，4 ℃ 孵育一抗過夜(1∶1 000)，1×TBST洗滌3次，二抗(1∶3 000)室溫孵育1.5 h，采用ECL顯影液顯色，凝膠成像系統(tǒng)拍照，Image J軟件分析。

1.2.10 細(xì)胞免疫熒光染色分析 不同濃度HEP-14處理后的細(xì)胞接種于蓋玻片上，4%多聚甲醛固定 30 min，0.1% Triton X-100 通透 15 min，室溫下5% 牛血清白蛋白中封閉30 min，4 ℃ 濕盒孵育一抗過夜，PBS 洗滌細(xì)胞，室溫下羊抗兔IgG(H+L)-Fluor 594孵育1 h，用 4′,6- 二脒基 -2- 苯基吲哚 (DAPI)核染15 min，PBS 洗滌3次，防淬滅劑封片后熒光顯微鏡下觀察。

1.2.11 生物信息學(xué)分析黑色素瘤STAT3和CD271相關(guān)性 使用GEPIA(http://gepia.caner-pku.cn/)在線網(wǎng)站進(jìn)行生物信息學(xué)分析。登錄GEPIA網(wǎng)站，點(diǎn)擊“Correlation”基因相關(guān)性分析模塊，Gene A與Gene B分別輸入STAT3與CD271的基因名稱，即STAT3與NGFR，相關(guān)系數(shù)選擇默認(rèn)的Pearson相關(guān)系數(shù)，數(shù)據(jù)集選擇TCGA Tumor數(shù)據(jù)庫(kù)中SKCM Tumor數(shù)據(jù)集，點(diǎn)擊“Plot”，生成相關(guān)性分析圖表[23]。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 HEP-14有效抑制SK-Mel-103細(xì)胞生長(zhǎng)

檢測(cè)天然小分子HEP-14對(duì)高惡性黑色素瘤細(xì)胞SK-Mel-103的細(xì)胞毒作用，用不同濃度的HEP-14分別與SK-Mel-103 細(xì)胞作用24、48、72 h，CCK-8 結(jié)果顯示與未處理組細(xì)胞相比，HEP-14降低了SK-Mel-103的細(xì)胞活性(P<0.05，P<0.01)，24、48、72h IC50值分別為37.81、21.9、11.06，且HEP-14作用的細(xì)胞毒性呈時(shí)間、劑量依賴性(圖1A)。顯微鏡下形態(tài)學(xué)觀察顯示，隨著HEP-14作用濃度和時(shí)間的增加，細(xì)胞數(shù)量和大小也明顯減少，10 μmol/L HEP-14作用時(shí)間72 h，出現(xiàn)明顯細(xì)胞碎片、不定形細(xì)胞(圖1B)，說明天然小分子HEP-14能有效抑制黑色素瘤SK-Mel-103細(xì)胞的生長(zhǎng)。

2.2 HEP-14抑制SK-Mel-103細(xì)胞增殖，促進(jìn)細(xì)胞凋亡

通過克隆形成實(shí)驗(yàn)探討HEP-14對(duì)SK-Mel-103細(xì)胞克隆集落形成的影響，如圖2A所示，與空白對(duì)照組相比，5、10、20 μmol/L HEP-14組SK-Mel-103細(xì)胞的克隆數(shù)減少(P<0.05)，提示HEP-14對(duì)SK-Mel-103細(xì)胞具有抑制作用，且抑制具有顯著的濃度依賴性。流式細(xì)胞術(shù)分析天然小分子HEP-14對(duì)細(xì)胞周期的影響(圖2B、C)，與0 μmol/L HEP-14組相比，5、10、20 μmol/L HEP-14組細(xì)胞以濃度依賴的方式出現(xiàn)G2/M 期阻滯(P<0.05，P<0.01)，表明天然小分子HEP-14可能通過誘導(dǎo)SK-Mel-103細(xì)胞G2/M 的周期阻滯，抑制細(xì)胞增殖。為了進(jìn)一步研究HEP-14對(duì)SK-Mel-103 細(xì)胞的誘導(dǎo)凋亡作用，采用Annexin V/PI 染色進(jìn)行流式細(xì)胞術(shù)分析 (圖2D、E)，結(jié)果表明HEP-14作用細(xì)胞72 h，與0 μmol/L HEP-14組相比，隨著HEP-14作用濃度的增加，細(xì)胞早期凋亡、晚期凋亡比例隨之增加(P<0.05，P<0.01)，說明HEP-14能誘導(dǎo)黑色素瘤細(xì)胞SK-Mel-103的凋亡。

A：CCK8檢測(cè)不同濃度HEP-14對(duì)黑色素瘤細(xì)胞SK-MEL-103生長(zhǎng)的影響；B：不同濃度HEP-14處理黑色素瘤細(xì)胞SK-MEL-103形態(tài)觀察 a: P<0.05，b:P<0.01，與空白對(duì)照組(0 μmol /L)比較

A：不同濃度 HEP-14對(duì)SK-MEL-103細(xì)胞克隆形成的影響；B：不同濃度HEP-14對(duì)黑色素瘤細(xì)胞SK-MEL-103周期的影響；C：不同濃度HEP-14處理后黑色素瘤細(xì)胞SK-MEL-103各周期比例；D：流式細(xì)胞儀檢測(cè)不同濃度 HEP-14對(duì)黑色素瘤細(xì)胞SK-MEL-103凋亡的影響；E：不同濃度HEP-14處理后黑色素瘤細(xì)胞SK-MEL-103凋亡細(xì)胞比例 a: P<0.05，b:P<0.01，與空白對(duì)照組(0 μmol/L)比較

2.3 生物信息學(xué)分析黑色素瘤組織中STAT3 mRNA與標(biāo)記物 CD271 mRNA的表達(dá)水平

利用GEPIA數(shù)據(jù)庫(kù)分析黑色素瘤組織STAT3 mRNA與標(biāo)志物CD271 mRNA表達(dá)的相關(guān)性，結(jié)果顯示CD271 mRNA與STAT3 mRNA的表達(dá)呈正相關(guān)(r=0.14，P<0.01，圖3)，提示CD271的表達(dá)可能與STAT3有關(guān)。

圖3 GEPIA 數(shù)據(jù)庫(kù)分析黑色素瘤組織中STAT3 mRNA 與 NGFR mRNA 表達(dá)的相關(guān)性

2.4 HEP-14抑制STAT3磷酸化，下調(diào)CD271表達(dá)和阻止SK-Mel-103細(xì)胞遷移

采用Transwell 遷移實(shí)驗(yàn)研究HEP-14對(duì)SK-Mel-103細(xì)胞遷移能力的影響(圖4A)，結(jié)果表明HEP-14顯著抑制了細(xì)胞遷移(P<0.05)。為了探討HEP-14對(duì)黑色素瘤細(xì)胞SK-Mel-103的遷移抑制作用是否與下調(diào) CD271表達(dá)相關(guān)，通過RT-qPCR、Western blot驗(yàn)證后(圖4B～E)發(fā)現(xiàn) HEP-14處理SK-Mel-103細(xì)胞 72h能顯著抑制CD271的表達(dá)，同時(shí)，用細(xì)胞免疫熒光染色分析HEP-14處理后CD271在SK-Mel-103細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)(圖5)，結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，10 μmol/L HEP-14組CD271的熒光信號(hào)明顯減弱(P<0.05)；為進(jìn)一步探討HEP-14對(duì)CD271的抑制作用是否依賴STAT3信號(hào)通路的調(diào)控，RT-qPCR、Western blot結(jié)果顯示，HEP-14能顯著抑制STAT3磷酸化，并且成一定的濃度依賴性(P<0.05，P<0.01)；這一結(jié)果在其他黑色素瘤細(xì)胞株SK-MEL-147和SK-MEL-28也得到了驗(yàn)證(圖6)。上述結(jié)果表明，天然小分子HEP-14可能通過STAT3依賴的信號(hào)通路調(diào)控黑色素瘤細(xì)胞的CD271表達(dá)，抑制黑色素瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移。

A：Transwell檢測(cè)10 μmol/L HEP-14對(duì)黑色素瘤細(xì)胞SK-MEL-103遷移的影響；B、C：CD271和STAT3的mRNA相對(duì)表達(dá)；D、E：CD271、p-STAT3、STAT3的蛋白相對(duì)表達(dá) a: P<0.05，b:P<0.01，與空白對(duì)照組(0 μmol /L)組比較

圖5 免疫熒光檢測(cè)10 μmol/L HEP-14對(duì)黑色素瘤中CD271表達(dá)的影響

A、B：分別為HEP-14處理后SK-MEL-147、SK-MEL-28中STAT3和CD271的mRNA相對(duì)表達(dá)量；C、D：HEP-14處理后SK-Mel-147細(xì)胞CD271、p-STAT3、STAT3蛋白的相對(duì)表達(dá)；E、F：HEP-14處理后SK-Mel-28細(xì)胞CD271、p-STAT3、STAT3蛋白的相對(duì)表達(dá) a: P<0.05，b:P<0.01，與空白對(duì)照組(0 μmol /L) 組比較

3 討論

黑色素瘤是由正常黑色素細(xì)胞異常轉(zhuǎn)化引起的惡性腫瘤，具有高度侵襲性和轉(zhuǎn)移性，其發(fā)病率在全球范圍內(nèi)逐年攀升。黑色素瘤細(xì)胞的異質(zhì)性及治療過程中癌基因和信號(hào)通路再次激活，已成為阻礙惡性黑色素瘤藥物治療的主要障礙，也使黑色素瘤的藥物研發(fā)面臨新的挑戰(zhàn)。天然小分子已成為多種癌癥治療的手段之一，本研究探討了天然小分子HEP-14對(duì)高惡性黑色素瘤SK-Mel-103細(xì)胞的抑制作用。本研究發(fā)現(xiàn)，HEP-14能顯著降低黑色素瘤SK-Mel-103細(xì)胞活力、集落形成能力，增加細(xì)胞凋亡率，且表現(xiàn)出明顯的濃度依賴性，表明HEP-14對(duì)黑色素瘤SK-Mel-103細(xì)胞的生長(zhǎng)有明顯的抑制作用。

STAT3是一種重要的轉(zhuǎn)錄因子，主要通過Tyr-705 位點(diǎn)的磷酸化而被激活，具有促進(jìn)腫瘤的特性。在大多數(shù)人類癌癥組織中存在持續(xù)的STAT3過度表達(dá)和/或STAT3的過度活化[24-25]。本研究結(jié)果表明，HEP-14可以抑制黑色素瘤細(xì)胞株包括SK-Mel-103、SK-MEL-147和SK-MEL-28的STAT3總蛋白的表達(dá)和磷酸化STAT3(Tyr-705)蛋白水平，說明HEP-14可能通過抑制STAT3信號(hào)發(fā)揮抗黑色素瘤作用。

CD271是黑色素瘤起始細(xì)胞標(biāo)記物和重要的神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子，調(diào)控黑色素瘤的成瘤性和遷移能力，是黑色素瘤發(fā)展進(jìn)程中的重要調(diào)控因子。本研究通過GEPIA數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)STAT3基因與CD271基因(NGFR)進(jìn)行相關(guān)性分析，發(fā)現(xiàn)在黑色素瘤組織中CD271與STAT3在轉(zhuǎn)錄組水平上的表達(dá)呈正相關(guān)。有研究報(bào)道在高表達(dá)CD271的黑色素瘤轉(zhuǎn)移病灶中，同時(shí)檢測(cè)到被高度激活的STAT3[15-16,18]，其依賴的信號(hào)通路在介導(dǎo)黑色素瘤細(xì)胞向肺部、大腦轉(zhuǎn)移的過程中同樣起到關(guān)鍵的調(diào)控作用[19]；提示黑色素瘤中CD271的表達(dá)可能與STAT3依賴的信號(hào)通路調(diào)控相關(guān)。在進(jìn)一步研究中發(fā)現(xiàn)HEP-14在抑制STAT3磷酸化的同時(shí)也抑制CD271的表達(dá)，提示HEP-14可能是通過調(diào)控STAT3通路活化抑制CD271的表達(dá)，從而抑制SK-Mel-103細(xì)胞的遷移。無論HEP-14是否直接抑制黑色素瘤起始細(xì)胞亞群，本研究結(jié)果提示HEP-14可能成為STAT3抑制劑或作為CD271上下游基因的調(diào)控劑。天然小分子HEP-14對(duì)黑色素瘤的抑制作用具有潛在的研究意義，將為惡性黑色素瘤尋找新的治療途徑提供思路。

綜上所述，天然小分子HEP-14能有效抑制黑色素瘤細(xì)胞生長(zhǎng)和誘導(dǎo)其凋亡；可能通過抑制STAT3的激活下調(diào)CD271的表達(dá)，從而抑制黑色素瘤細(xì)胞的遷移。但誘導(dǎo)細(xì)胞死亡存在多種途徑，也可能同時(shí)受到多條信號(hào)通路的調(diào)控，HEP-14抑制黑色素瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的明確機(jī)制還需要進(jìn)一步的研究。CD271作為重要的神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子參與了細(xì)胞的增殖、遷移、細(xì)胞粘附等多種細(xì)胞生物學(xué)行為，因此也受到多種信號(hào)通路的調(diào)控。CD271是受到STAT3通路的直接調(diào)控，還是通過多條信號(hào)通路的交叉調(diào)控而發(fā)揮作用，仍需要進(jìn)一步研究。