CRIP1參與子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞增殖、侵襲、遷移及EMT的作用

淳彩璞，崔曉賓，胡建明，賈 薇，呂新玲，李美峰，吳小雙

843000 新疆 阿克蘇，新疆石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院第四附屬醫(yī)院病理科1；832000 新疆 石河子，新疆石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院病理科2；833200 新疆 奎屯，新疆伊犁州奎屯醫(yī)院病理科3

子宮內(nèi)膜癌(endometrial cancer, EC)為多見于女性生殖系統(tǒng)的惡性腫瘤，處于絕經(jīng)期前后的女性屬于其高危人群[1]。據(jù)報(bào)道，2008-2018年EC死亡率每年上升約1.4%[2]。常見的致病因素包括肥胖、雌激素過(guò)多、高血壓和糖尿病等[3]。目前，臨床常用的主要治療方法仍是手術(shù)[4]。盡管針對(duì)晚期EC患者的治療已取得了重大突破和進(jìn)步，但腫瘤的侵襲性和轉(zhuǎn)移性仍易導(dǎo)致腫瘤復(fù)發(fā)，嚴(yán)重影響患者預(yù)后[5- 6]。因此，探究EC細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)移相關(guān)的分子基礎(chǔ)及調(diào)控機(jī)制可為EC治療提供重要的理論依據(jù)。

半胱氨酸豐富蛋白1(cysteine rich protein 1, CRIP1)屬于LIM/雙鋅指蛋白家族，擁有獨(dú)特的雙鋅指結(jié)構(gòu)，并由此發(fā)揮其在多種疾病中的重要作用[7]。最早發(fā)現(xiàn)CRIP1主要在腸道中分布，除腸道外，CRIP1同樣廣泛存在于結(jié)腸、肺、脾、胸腺和腦等其他器官中[8-9]。深入研究揭示，CRIP1在鋅離子吸收轉(zhuǎn)運(yùn)、維持管腔結(jié)構(gòu)、炎癥免疫應(yīng)答方面發(fā)揮重要作用[10]。近年來(lái)，CRIP1 在幾種癌癥中的異常表達(dá)引起了越來(lái)越多的關(guān)注。研究發(fā)現(xiàn)，CRIP1在多種惡性腫瘤中充當(dāng)促癌基因，如卵巢癌[11]、宮頸癌[12]、甲狀腺癌[13]、乳腺癌[14]、肝細(xì)胞癌[15]、結(jié)直腸癌[16]等。這些結(jié)果表明CRIP1可能是惡性腫瘤的潛在治療靶點(diǎn)，尤其是癌癥的侵襲和轉(zhuǎn)移?，F(xiàn)有研究表明，EC組織中呈現(xiàn)出較高的CRIP1表達(dá)，且與患者的不良預(yù)后有緊密關(guān)聯(lián)[17]。因此，我們猜測(cè)CRIP1的異常表達(dá)可能與EC進(jìn)展有關(guān)并予以探討。

糖酵解是指葡萄糖和糖原分解為丙酮酸并同時(shí)生成三磷酸腺苷(adenosine triphosphate，ATP)的過(guò)程[18]。2020年NIE等[19]研究發(fā)現(xiàn)，糖酵解激酶磷酸甘油酸激酶1(phosphoglycerate kinase 1，PGK1)通過(guò)直接或間接增強(qiáng)糖酵解活性從而推動(dòng)癌細(xì)胞生長(zhǎng)。研究表明，EC組織中呈現(xiàn)出較高的PGK1表達(dá)，且與不良預(yù)后及腫瘤的生長(zhǎng)浸潤(rùn)行為緊密相關(guān)[20-21]。但PGK1在EC中的具體作用尚不清楚。因此，本研究重點(diǎn)探討CRIP1對(duì)EC細(xì)胞惡性行為表型的具體影響并闡明CRIP1與PGK1兩者間的相互關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 臨床樣本

收集2019年2月至2020年12月于新疆石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院第四附屬醫(yī)院(新疆生產(chǎn)建設(shè)兵團(tuán)第一師醫(yī)院)行手術(shù)治療的20例EC患者的腫瘤組織標(biāo)本作為腫瘤組，年齡30～65(50.95±6.98)歲，所有患者手術(shù)前未進(jìn)行放療或化療。腫瘤的分期根據(jù)國(guó)際婦產(chǎn)科聯(lián)合會(huì)(FIGO)分期系統(tǒng)標(biāo)準(zhǔn)確定。另外選取距離腫瘤>5 cm的癌旁組織標(biāo)本作為正常組?；颊呒凹覍倬炇鹬橥鈺狙芯拷?jīng)新疆生產(chǎn)建設(shè)兵團(tuán)第一師醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(2022年5月)。

1.2 材料

人子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞系SHT290購(gòu)自北京科瑞思搏生物科技有限公司；人EC細(xì)胞Ishikawa購(gòu)自深圳市豪地華拓生物科技有限公司；KLE、RL95-2、HEC-1-A子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞均由美國(guó)菌種保藏中心(ATCC)提供；RPMI-1640、DMEM、EMEM和McCoy’s 5A培養(yǎng)基均購(gòu)自美國(guó)GIBCO公司；FBS胎牛血清和Trizol提取試劑購(gòu)自美國(guó)生命技術(shù)公司；Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑購(gòu)自日本Takara公司；shRNA-CRIP1-1/2重組慢病毒和陰性對(duì)照shRNA-NC慢病毒由天根生化科技(北京)有限公司構(gòu)建；Ov-PGK1和Ov-NC質(zhì)粒由上海吉瑪公司提供； QuantiTect 逆轉(zhuǎn)錄試劑盒由德國(guó)凱杰生物公司提供；SYBR? Green PCR master mix試劑盒和BCA試劑盒購(gòu)自美國(guó)伯樂公司；實(shí)時(shí)熒光定量PCR系統(tǒng)購(gòu)自美國(guó)MJ Research公司；CCK-8試劑購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)有限公司；EdU和Protein A Agrose購(gòu)自賽默飛世爾科技(中國(guó))有限公司；基質(zhì)膠和transwell小室購(gòu)自美國(guó)BD公司；多聚甲醛、結(jié)晶紫和RIPA裂解液由美國(guó)Sigma公司提供；兔源CRIP1、基質(zhì)金屬蛋白酶2(MMP2)、基質(zhì)金屬蛋白酶9(MMP9)、E-鈣粘素(E-cadherin)、N-鈣粘素(N-cadherin)、波形蛋白(Vimentin)、Snai、Slug、PGK1抗體和山羊抗兔IgG-FITC均購(gòu)自美國(guó)Abcam；ECL發(fā)光試劑盒購(gòu)自南京諾唯贊生物科技股份有限公司；Image J軟件購(gòu)自美國(guó)國(guó)立衛(wèi)生研究院；熒光顯微鏡購(gòu)自德國(guó)歐蒙醫(yī)學(xué)診斷有限公司；倒置顯微鏡購(gòu)自?shī)W林巴斯；激光共聚焦顯微鏡購(gòu)自德國(guó)徠卡公司；SPSS 22.0軟件購(gòu)自美國(guó)IBM公司。

1.3 方法

1.3.1 生物信息學(xué)分析 利用NCBI在線數(shù)據(jù)庫(kù)，選擇GSE63678數(shù)據(jù)集(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc=GSE63678)分析CRIP1在7例EC腫瘤組織和5例正常組織中的表達(dá)；利用Biogrid(https://thebiogrid.org/)預(yù)測(cè)CRIP1和PGK1兩者間的結(jié)合關(guān)系。

1.3.2 細(xì)胞培養(yǎng) 人子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞系SHT290常規(guī)培養(yǎng)于RPMI 1640培養(yǎng)基中；人EC細(xì)胞KLE，RL95-2均用DMEM培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)；Ishikawa細(xì)胞用EMEM培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)；而HEC-1-A細(xì)胞常規(guī)培養(yǎng)于McCoy’s 5A Medium培養(yǎng)基中。所有培養(yǎng)基含有10% FBS，放置在37℃、5%CO2的孵育箱中。

1.3.3 細(xì)胞轉(zhuǎn)染 細(xì)胞于6孔板中(5×104/孔)接種培養(yǎng)，當(dāng)細(xì)胞達(dá)到60%～70%融合度時(shí)，嚴(yán)格按照Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑說(shuō)明將shRNA-CRIP1-1/2、shRNA-NC、Ov-PGK1和Ov-NC瞬時(shí)轉(zhuǎn)染至各組細(xì)胞中，48 h后轉(zhuǎn)染完成。

1.3.4 實(shí)時(shí)熒光定量PCR(RT-qPCR)檢測(cè)CRIP1和PGK1在子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞內(nèi)表達(dá) 首先，加入Trizol試劑對(duì)RNA進(jìn)行分離，并按照QuantiTect 逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行cDNA合成。以cDNA為模板，加入SYBR? Green PCR master mix試劑盒和7500實(shí)時(shí)熒光定量PCR系統(tǒng)進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)。以GAPDH為內(nèi)參，采用2-ΔΔCt法進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

1.3.5 CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞活性 質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后，細(xì)胞種植于96孔板中進(jìn)行培養(yǎng)(5×103/孔)，分別于24、48、72 h后，添加體積分?jǐn)?shù)為10%的CCK-8試劑，酶標(biāo)儀于2 h后在490 nm處檢測(cè)光密度值[D(490)]，繪制增殖曲線。

1.3.6 EdU染色檢測(cè)細(xì)胞增殖 細(xì)胞轉(zhuǎn)染處理同1.3.5，每孔加入20 μmol/L EdU 37℃下孵育2 h。隨后，使用4%多聚甲醛和0.5% Triton X-100分別對(duì)細(xì)胞進(jìn)行固定和透化處理。經(jīng)DAPI染色后，于熒光顯微鏡下檢測(cè)EdU陽(yáng)性細(xì)胞。

1.3.7 劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞遷移 在6孔板中加入處于生長(zhǎng)對(duì)數(shù)期的Ishikawa細(xì)胞，細(xì)胞達(dá)到90%融合度時(shí)，使用200 μL無(wú)菌槍頭劃一條線，PBS洗滌3次后加入無(wú)血清培養(yǎng)基。在倒置顯微鏡下測(cè)量0、48 h的傷口寬度，計(jì)算細(xì)胞遷移數(shù)。

1.3.8 Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞侵襲 將轉(zhuǎn)染后的Ishikawa細(xì)胞接種于含有基質(zhì)膠的transwell上室內(nèi)，transwell下室加入500 μL含10% FBS的EMEM培養(yǎng)基。24 h后，表層細(xì)胞被棉簽擦去，細(xì)胞經(jīng)多聚甲醛和結(jié)晶紫分別固定和染色處理后，于顯微鏡下對(duì)細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)。

1.3.9 免疫印跡法(Western blot)檢測(cè) 采用BCA試劑盒對(duì)RIPA裂解液提取的蛋白濃度進(jìn)行檢測(cè)。將行10% SDS-PAGE電泳的等量蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移至PVDF膜并在5%脫脂牛奶中進(jìn)行室溫封閉，加入一抗和HPR標(biāo)記的羊抗兔二抗，分別于4 ℃和室溫下孵育。加入ECL發(fā)光試劑盒對(duì)蛋白條帶進(jìn)行顯影，利用Image J軟件記錄灰度值。

1.3.10 免疫熒光(immunofluorescence, IF)檢測(cè)Vimentin表達(dá) 用4%多聚甲醛和0.2% TritonX-100分別對(duì)轉(zhuǎn)染后的Ishikawa細(xì)胞進(jìn)行固定和透化處理，并用2% BSA進(jìn)行封閉，4 ℃下與稀釋的兔源Vimentin抗體孵育過(guò)夜，并在37 ℃下與山羊抗兔IgG-FITC孵育1 h，50%甘油封片，最后利用激光共聚焦顯微鏡拍照和熒光定量分析。

1.3.11 免疫共沉淀(Co-immunoprecipitation, Co-IP) 常規(guī)收集并裂解細(xì)胞后，加入2 μg兔抗CRIP1和PGK1單克隆抗體，4 ℃下孵育過(guò)夜，加入Protein A Agrose，繼續(xù)混合過(guò)夜，離心后收集沉淀物，經(jīng)SDS-PAGE分離后，Western blot對(duì)免疫沉淀物進(jìn)行分析。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 CRIP1在EC腫瘤組織和細(xì)胞中表達(dá)上調(diào)

RT-qPCR和Western blot印跡結(jié)果表明，CRIP1的表達(dá)在EC腫瘤組織中的表達(dá)較癌旁組織增加(P<0.01，圖1A、B)。同樣，生物信息學(xué)NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)(GSE63678芯片)分析數(shù)據(jù)顯示，與正常組織相較，EC腫瘤組織中表現(xiàn)出較高的CRIP1表達(dá)(P<0.01，圖1C)。此外，與人子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞系SHT-290相比，CRIP1在人EC細(xì)胞(Ishikawa、KLE、RL95-2和HEC-1-A)中的表達(dá)水平明顯增加，且CRIP1在Ishikawa細(xì)胞中呈現(xiàn)最高表達(dá)水平(P<0.01)，同時(shí)CRIP1在RL95-2細(xì)胞中的蛋白水平較SHT-290細(xì)胞相比無(wú)顯著性差異(P>0.05，圖1D、E)，提示CRIP1在EC組織和細(xì)胞中廣泛表達(dá)。因此，選擇CRIP1相對(duì)表達(dá)量最高的Ishikawa細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2.2 敲低CRIP1對(duì)EC細(xì)胞增殖的影響

為進(jìn)一步明確CRIP1在EC發(fā)展過(guò)程中的作用，首先利用shRNA慢病毒對(duì)CRIP1基因進(jìn)行干擾。轉(zhuǎn)染shRNA-CRIP1-1和shRNA-CRIP1-2后，CRIP1表達(dá)水平顯著降低，且CRIP1干擾組-1中呈現(xiàn)較高的干擾效率，因此選擇CRIP1干擾組-1用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)(P<0.01，圖2A、B)。CCK-8法表明，與干擾對(duì)照組比較，CRIP1干擾組-1中細(xì)胞在24、48、72 h時(shí)活性顯著減弱(P<0.01，圖2C)。EdU染色同樣表明，CRIP1干擾組-1較干擾對(duì)照組EdU陽(yáng)性細(xì)胞比例明顯下降(P<0.01，圖2D)。

a: P<0.01，與正常組或SHT290比較

1：空白對(duì)照組；2：干擾對(duì)照組；3：CRIP1干擾組-1；4：CRIP1干擾組-2；a: P<0.01，與干擾對(duì)照組比較

2.3 干擾CRIP1對(duì)EC細(xì)胞遷移、侵襲及EMT的影響

劃痕實(shí)驗(yàn)證實(shí)，CRIP1干擾組-1較干擾對(duì)照組劃痕相對(duì)愈合率明顯降低，遷移細(xì)胞明顯下降(P<0.01，圖3A)。Transwell實(shí)驗(yàn)證明，與干擾對(duì)照組相比，CRIP1干擾組-1中侵襲細(xì)胞數(shù)目顯著降低(P<0.01，圖3B)。Western印跡結(jié)果表明，CRIP1干擾組-1較干擾對(duì)照組MMP2、MMP9、N-cadherin、Vimentin、Snail和Slug蛋白水平明顯下降，而E-cadherin蛋白水平明顯增加(P<0.01，圖3C-E)。IF實(shí)驗(yàn)同樣檢測(cè)到，與干擾對(duì)照組相比，CRIP1干擾組-1中Vimentin表達(dá)降低(P<0.01，圖3F)。

2.4 CRIP1與PGK1蛋白在EC細(xì)胞中相結(jié)合

經(jīng)Biogrid網(wǎng)站進(jìn)行生物信息學(xué)預(yù)測(cè)后發(fā)現(xiàn)，CRIP1可能與PGK1相結(jié)合。與人子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞系SHT-290相比，PGK1在人EC細(xì)胞(Ishikawa、KLE、RL95-2和HEC-1-A)中的表達(dá)水平明顯增加，且在Ishikawa細(xì)胞中呈現(xiàn)最高表達(dá)水平(P<0.01)(圖4A-B)。Co-IP實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在CRIP1相互作用蛋白復(fù)合物中發(fā)現(xiàn)CRIP1和PGK1的存在；同時(shí)在PGK1相互作用蛋白復(fù)合物中也檢測(cè)到PGK1和CRIP1的富集，表明CRIP1與PGK1兩者間存在相互作用(圖4C、D)。此外，CRIP1干擾組-1較干擾對(duì)照組PGK1蛋白水平顯著降低(P<0.01，圖4E)。

1：空白對(duì)照組；2：干擾對(duì)照組；3：CRIP1干擾組-1；a: P<0.01，與干擾對(duì)照組比較

(圖3E、F續(xù)下頁(yè))

1：空白對(duì)照組；2：干擾對(duì)照組；3：CRIP1干擾組-1；a: P<0.01，與干擾對(duì)照組比較

a: P<0.01，與SHT290或干擾對(duì)照組比較

2.5 過(guò)表達(dá)PGK1對(duì)CRIP1敲低的EC細(xì)胞增殖能力的影響

為了進(jìn)一步驗(yàn)證CRIP1是否通過(guò)與PGK1蛋白結(jié)合從而調(diào)控EC發(fā)展，我們首先利用Ov-PGK1質(zhì)粒對(duì)Ishikawa細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)染。PGK1過(guò)表達(dá)組中PGK1表達(dá)水平顯著升高(P<0.01，圖5A、B)。CCK-8和EdU實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與空白對(duì)照組相比，CRIP1沉默導(dǎo)致Ishikawa細(xì)胞增殖能力明顯減弱；而與CRIP1干擾組+過(guò)表達(dá)對(duì)照組相比，CRIP1干擾組+PGK1過(guò)表達(dá)組中細(xì)胞增殖能力再次增強(qiáng)(P<0.01，圖5C、D)。

2.6 過(guò)表達(dá)PGK1對(duì)CRIP1敲低的EC細(xì)胞遷移、侵襲及EMT能力的影響

與空白對(duì)照組相比，CRIP1干擾組中遷移細(xì)胞數(shù)和侵襲細(xì)胞數(shù)明顯下降；而CRIP1干擾組+PGK1過(guò)表達(dá)組較CRIP1干擾組+過(guò)表達(dá)對(duì)照組轉(zhuǎn)移和侵襲細(xì)胞數(shù)再次上升(P<0.05，P<0.01，圖6A、B)。此外，與空白對(duì)照組相比，CRIP1干擾組中MMP2、MMP9、N-cadherin、Vimentin、Snail和Slug蛋白水平明顯下降，而E-cadherin蛋白水平明顯增加；而與CRIP1干擾組+過(guò)表達(dá)對(duì)照組相比，CRIP1干擾組+PGK1過(guò)表達(dá)組中MMP2、MMP9、N-cadherin、Vimentin、Snail和Slug蛋白水平升高，而E-cadherin蛋白水平下降(P<0.01，圖6C-E)。IF實(shí)驗(yàn)也表明，CRIP1不足導(dǎo)致Vimentin表達(dá)下降；而轉(zhuǎn)染Ov-PGK1過(guò)表達(dá)質(zhì)粒后，Vimentin水平再次上升(圖6F)。

a: P<0.01，與過(guò)表達(dá)對(duì)照組或空白對(duì)照組比較；b: P<0.01，與CRIP1干擾組+過(guò)表達(dá)對(duì)照組比較

1：空白對(duì)照組；2：過(guò)表達(dá)對(duì)照組；3：GRIP1干擾組+過(guò)表達(dá)對(duì)照組；4：GRIP1干擾組+PGK1過(guò)表達(dá)組；a: P<0.01，與空白對(duì)照組比較；b: P<0.05，與CRIP1干擾組+過(guò)表達(dá)對(duì)照組比較

(圖6E、F續(xù)下頁(yè))

1：空白對(duì)照組；2：過(guò)表達(dá)對(duì)照組；3：GRIP1干擾組+過(guò)表達(dá)對(duì)照組；4：GRIP1干擾組+PGK1過(guò)表達(dá)組；a: P<0.01，與空白對(duì)照組比較；b: P<0.05，與CRIP1干擾組+過(guò)表達(dá)對(duì)照組比較

3 討論

EC是常見的婦科惡性腫瘤，是導(dǎo)致全世界女性癌癥死亡的常見因素[22]。盡管隨著治療手段的不斷進(jìn)步已有效提高了EC患者的治療效果，但由于EC細(xì)胞增殖、遷移和侵襲能力較強(qiáng)，易發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，患者目前的生存率仍令人擔(dān)憂[5-6]。當(dāng)前證據(jù)表明，腫瘤侵襲及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移與EMT事件密切相關(guān)[23-24]。此外，多種證據(jù)表明，EC的發(fā)生與發(fā)展是多種基因與通路相互調(diào)控的結(jié)果[25]。因此，本研究重點(diǎn)探討EC細(xì)胞的增殖、遷移、侵襲及EMT能力，從而深入揭露EC的發(fā)病機(jī)制，并尋找潛在的干預(yù)分子靶標(biāo)。

目前LIM蛋白家族成員CRIP1在腫瘤方面的作用日益成為人們關(guān)注的焦點(diǎn)。有研究發(fā)現(xiàn)，宮頸癌組織和細(xì)胞中CRIP1表達(dá)增加，且在細(xì)胞遷移、侵襲和EMT中起推動(dòng)作用[12]；LIU等[26]研究證實(shí)，敲低CRIP1可有效抑制卵巢上皮癌細(xì)胞遷移、侵襲及EMT。CRIP1表達(dá)上調(diào)是EC患者不良預(yù)后的獨(dú)立風(fēng)險(xiǎn)因素[17]。本研究通過(guò)RT-qPCR、Western blot及NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)分析發(fā)現(xiàn)，與正常組織和細(xì)胞比較，EC組織和細(xì)胞中CRIP1表達(dá)升高。功能喪失實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，CRIP1丟失可明顯減弱Ishikawa細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲能力。先前研究發(fā)現(xiàn)，蛋白水解酶家族成員MMP2和MMP9在EC發(fā)展過(guò)程中表達(dá)增加[27]。同樣，敲低CRIP1可導(dǎo)致MMP2和MMP9蛋白表達(dá)降低。EMT過(guò)程中，E-cadherin蛋白表達(dá)缺失，而N-cadherin、Vimentin、Snail和Slug蛋白表達(dá)增多[28]。本研究結(jié)果表明，CRIP1表達(dá)下調(diào)后，E-cadherin表達(dá)增加，而N-cadherin、Vimentin、Snail和Slug蛋白表達(dá)減少。

對(duì)于腫瘤細(xì)胞而言，有氧糖酵解是腫瘤細(xì)胞為自身提供能量、實(shí)現(xiàn)快速遷移和侵襲的主要方式[18, 29]。因此，糖代謝與腫瘤的發(fā)生與發(fā)展有緊密關(guān)聯(lián)，是惡性腫瘤的重要特征。甲基化、乙?；确g后修飾行為都可以激活糖酵解相關(guān)酶PGK1，促使腫瘤細(xì)胞糖代謝的異常，從而影響癌細(xì)胞的惡性表型[30]。近年關(guān)于PGK1的研究強(qiáng)調(diào)了其在EC中的作用：EC組織和細(xì)胞中PGK1呈高表達(dá)，PGK1與EC進(jìn)展和EC患者不良預(yù)后相關(guān)[20-21, 31-32]。此外，有研究報(bào)道HOXA9與CRIP家族成員CRIP2互相作用抑制HIF-1α介導(dǎo)的糖酵解從而抑制皮膚鱗癌發(fā)生發(fā)展[33]。更重要的是，CRIP1可通過(guò)與GAL-3蛋白相互作用從而在EC進(jìn)展中發(fā)揮重要作用[17]。然而，CRIP1對(duì)糖酵解的作用以及與糖酵解相關(guān)酶PGK1間的相互關(guān)系仍未可知。本研究通過(guò)Biogrid數(shù)據(jù)庫(kù)和Co-IP實(shí)驗(yàn)分別預(yù)測(cè)并驗(yàn)證了CRIP1與PGK1在EC細(xì)胞中的結(jié)合關(guān)系。此外，EC細(xì)胞中PGK1水平增加，且CRIP1沉默可抑制PGK1蛋白表達(dá)，揭示了CRIP1對(duì)PGK1的正向調(diào)控關(guān)系，表明CRIP1可通過(guò)與PGK1蛋白結(jié)合從而參與EC進(jìn)展。共轉(zhuǎn)染CRIP1干擾序列和PGK1過(guò)表達(dá)質(zhì)粒至Ishikawa細(xì)胞后，拯救實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)一步表明，沉默CRIP1對(duì)EC細(xì)胞增殖、遷移、侵襲和EMT能力的抑制作用均被PGK1所拯救。以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，PGK1過(guò)表達(dá)可實(shí)現(xiàn)對(duì)CRIP1干擾抑制EC發(fā)展的拮抗作用。

綜上所述，EC組織和細(xì)胞中CRIP1表達(dá)升高，且與EC的發(fā)生發(fā)展有緊密關(guān)聯(lián)。敲低CRIP1可減弱EC細(xì)胞的增殖、遷移、侵襲及EMT能力，其機(jī)制可能通過(guò)與PGK1蛋白結(jié)合有關(guān)。本研究初步明確了CRIP1在EC中的促癌作用，為深入探究CRIP1的作用以及挖掘EC的潛在治療靶點(diǎn)提供了寶貴的實(shí)驗(yàn)依據(jù)和理論支持。但本研究仍具有一些缺陷：首先，未涉及CRIP1表達(dá)與EC患者生存率、預(yù)后等相關(guān)性分析；其次，缺乏體內(nèi)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)以進(jìn)一步驗(yàn)證CRIP1在EC發(fā)展過(guò)程中的作用；最后，近期研究表明CRIP1與Ras、Wnt/β-catenin信號(hào)通路的異常激活有關(guān)[12, 15]，然而本研究未探討CRIP1相關(guān)的信號(hào)通路對(duì)EC發(fā)展的影響。