大小鼠焦慮行為實(shí)驗(yàn)方法概述

姜寧,姚彩虹,葉帆,孫秀萍,劉新民*

(1.中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院藥用植物研究所,北京 100193;2.北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院比較醫(yī)學(xué)中心,中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所,北京 100021)

焦慮癥是一種常見精神疾病,以急性焦慮反復(fù)發(fā)作為特征,主要表現(xiàn)為發(fā)作性或持續(xù)性的恐懼、擔(dān)心和焦慮、緊張等情緒反應(yīng),并伴有自主神經(jīng)功能失調(diào)、肌肉緊張與運(yùn)動(dòng)不安等癥狀[1]。 臨床上焦慮癥主要分為廣泛性焦慮障礙、驚恐障礙、社交焦慮障礙、強(qiáng)迫障礙、特異性恐懼癥等類型。 在精神障礙中,焦慮癥的終身患病率最高,影響到30%的人口的壽命[2-3],嚴(yán)重影響人們的生活質(zhì)量和水平[4]。 焦慮癥的誘發(fā)因素與心理、社會(huì)、生理等多種因素有關(guān),其發(fā)病機(jī)制復(fù)雜,目前尚未闡明,研究表明可能涉及到神經(jīng)生化、神經(jīng)免疫、神經(jīng)內(nèi)分泌等方面。 近年來(lái),對(duì)焦慮癥發(fā)病機(jī)制的研究和防治藥物的研發(fā)已成為國(guó)內(nèi)外的研究熱點(diǎn)。 基于動(dòng)物整體生理和心理狀態(tài)綜合反應(yīng)的動(dòng)物行為學(xué)實(shí)驗(yàn)可以反映復(fù)雜神經(jīng)系統(tǒng)對(duì)外界刺激后經(jīng)過(guò)一系列的生理、生化加工過(guò)程后產(chǎn)生的綜合性整體效應(yīng),已成為研究焦慮癥等神經(jīng)精神類疾病發(fā)病機(jī)制和藥物研發(fā)的基本實(shí)驗(yàn)手段[5]。

焦慮行為的實(shí)驗(yàn)方法主要是基于嚙齒類動(dòng)物的探索本性與外界環(huán)境的矛盾“沖突”從而引起的焦慮情緒或動(dòng)物在面臨不可避免或即將發(fā)生的厭惡性刺激時(shí)做出的情緒適應(yīng)性反應(yīng),包括抑制性回避、警覺性增高、神經(jīng)內(nèi)分泌改變等建立的。 常用的大小鼠焦慮行為實(shí)驗(yàn)方法可以分為兩大類,非條件反射和條件反射。 非條件反射包括探究行為、社會(huì)行為和防御行為,經(jīng)典的實(shí)驗(yàn)方法包括曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)、高架十字迷宮實(shí)驗(yàn)、明暗箱實(shí)驗(yàn)、孔板實(shí)驗(yàn)、新奇環(huán)境攝食抑制實(shí)驗(yàn)和新奇物體探索實(shí)驗(yàn)等。 條件反射包括飲水沖突、Geller-Seifter 沖突等。 本文以PubMed 和CNKI 等中英文文獻(xiàn)庫(kù)為重點(diǎn)進(jìn)行查閱,分析整理相關(guān)文獻(xiàn),對(duì)常用的大鼠和小鼠焦慮行為實(shí)驗(yàn)技術(shù)和方法進(jìn)行概述,為基于動(dòng)物行為學(xué)的焦慮行為科學(xué)研究提供參考。

1 非條件反射實(shí)驗(yàn)方法

1.1 高架十字迷宮實(shí)驗(yàn)

Pellow 等[6]將1955 年建立的高架十字迷宮實(shí)驗(yàn)(elevated plus-mest)發(fā)展并應(yīng)用于評(píng)價(jià)大鼠焦慮狀態(tài),證明了高架十字迷宮實(shí)驗(yàn)可以有效的評(píng)價(jià)大鼠焦慮樣行為。 1987 年,Lister[7]在此基礎(chǔ)上對(duì)裝置進(jìn)行了改進(jìn),用于評(píng)價(jià)小鼠焦慮樣行為。 高架十字迷宮實(shí)驗(yàn)是利用嚙齒類動(dòng)物對(duì)新異環(huán)境的探究特性和對(duì)高懸敞開臂的恐懼形成的矛盾沖突狀態(tài)設(shè)計(jì)的[8]。 當(dāng)動(dòng)物在中央?yún)^(qū)時(shí),同時(shí)面對(duì)開臂(開臂和外界相通)和閉臂(封閉的通道),由于對(duì)新奇環(huán)境的先天的好奇,動(dòng)物會(huì)更多的去探究開臂的環(huán)境。 但是懸敞的高懸開臂又具有一定的威脅性,從而誘發(fā)矛盾沖突,產(chǎn)生焦慮行為,在實(shí)驗(yàn)中,焦慮水平高的動(dòng)物會(huì)在閉臂(“無(wú)新奇、安全”)中的停留時(shí)間更長(zhǎng)。 抗焦慮藥物則能使動(dòng)物克服恐懼所導(dǎo)致的探究抑制,表現(xiàn)為在開臂停留更多的時(shí)間,對(duì)開臂的探究次數(shù)也增多。 高架十字迷宮具有簡(jiǎn)便快速、敏感性高、重復(fù)性好等優(yōu)點(diǎn),是最經(jīng)典的評(píng)價(jià)嚙齒類動(dòng)物焦慮狀態(tài)的實(shí)驗(yàn)方法。 此外,高架十字迷宮實(shí)驗(yàn)也是國(guó)際上公認(rèn)的狀態(tài)性焦慮模型,廣泛用于抗焦慮藥物的篩選,且對(duì)安定類抗焦慮劑尤其敏感。

1.1.1 實(shí)驗(yàn)方法

將大(小)鼠置于高架十字迷宮中央,動(dòng)物頭朝(面向)開臂,立即開始實(shí)驗(yàn),沒(méi)有適應(yīng)期,為了減少干擾,觀察者應(yīng)距離迷宮中心至少1 m。 實(shí)驗(yàn)時(shí)間應(yīng)為5 min。 為了提高大小鼠入臂總次數(shù),避免大小鼠總是躲在閉臂中,通常在測(cè)試前先將大小鼠放在開闊場(chǎng)地中適應(yīng)5 min 后再放入迷宮中進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。研究發(fā)現(xiàn)低強(qiáng)度光線可以明顯增加實(shí)驗(yàn)動(dòng)物進(jìn)入開臂的時(shí)間和次數(shù)且不影響其自發(fā)活動(dòng)[9],建議在低強(qiáng)度光線下進(jìn)行此實(shí)驗(yàn)。

1.1.2 評(píng)價(jià)指標(biāo)

目前在高架十字迷宮實(shí)驗(yàn)中最常使用的評(píng)價(jià)指標(biāo)為動(dòng)物進(jìn)入開臂次數(shù)比例以及開臂時(shí)間比例,其他參考指標(biāo)包括動(dòng)物進(jìn)入開臂時(shí)間和次數(shù),進(jìn)入閉臂的時(shí)間和次數(shù)等,也作為焦慮行為評(píng)價(jià)的參考指標(biāo)。 以動(dòng)物四肢全部入開(閉)臂作為進(jìn)出開(閉)臂的標(biāo)準(zhǔn),具體指標(biāo)包括[10-11]:

(1)開臂次數(shù):實(shí)驗(yàn)時(shí)間內(nèi)進(jìn)入開臂的總次數(shù)。如果一個(gè)藥物增加動(dòng)進(jìn)入開臂的次數(shù)和,而不改變?nèi)氡劭偞螖?shù),則認(rèn)為該藥有抗焦慮作用。 正常組動(dòng)物開臂次數(shù)大于10 次。

(2)開臂次數(shù)百分比:實(shí)驗(yàn)時(shí)間內(nèi)動(dòng)物進(jìn)入開臂的次數(shù)/進(jìn)入開臂和閉臂總次數(shù)之和×100%。 與焦慮程度成反比。 正常組動(dòng)物開臂次數(shù)百分比范圍為10% ～ 45%。

(3)開臂時(shí)間百分比:實(shí)驗(yàn)時(shí)間內(nèi),動(dòng)物進(jìn)入開臂的時(shí)間/進(jìn)入開臂和閉臂的總時(shí)間之和×100%。正常組動(dòng)物開臂時(shí)間百分比范圍為10% ～ 40%。

(4)總次數(shù):實(shí)驗(yàn)時(shí)間內(nèi)進(jìn)入開臂和閉臂的總次數(shù)之和。

(5)閉臂次數(shù):實(shí)驗(yàn)時(shí)間內(nèi)進(jìn)入閉臂的總次數(shù)?？偞螖?shù)不變時(shí),動(dòng)物進(jìn)入閉臂的次數(shù)越多,表明動(dòng)物焦慮程度越重。

(6)閉臂次數(shù)百分比:進(jìn)入閉臂的總次數(shù)/開臂和閉臂總次數(shù)之和。

1.2 明暗箱實(shí)驗(yàn)

明暗箱實(shí)驗(yàn)(light/dark box test)是由Crawley等[12]于1980 年所建立。 其原理是利用嚙齒類的嗜暗習(xí)性設(shè)計(jì)的,動(dòng)物對(duì)新奇環(huán)境更有興趣、更好奇,會(huì)去探究,但又對(duì)明室中的亮光先天的厭惡,由此形成矛盾沖突狀態(tài)表現(xiàn)出焦慮行為,實(shí)驗(yàn)中體現(xiàn)為動(dòng)物的穿箱次數(shù)的減少。 抗焦慮藥物可顯著增加鼠的穿箱次數(shù)以及在明室時(shí)間。 明暗箱實(shí)驗(yàn)操作簡(jiǎn)單快速且不需要事先訓(xùn)練動(dòng)物,廣泛應(yīng)用于嚙齒類動(dòng)物焦慮行為的評(píng)價(jià)和抗焦慮藥物研發(fā)。 此外,明暗箱實(shí)驗(yàn)也是公認(rèn)的狀態(tài)性焦慮模型可以用來(lái)篩選潛在的抗焦慮藥物。 但由于明暗箱實(shí)驗(yàn)是基于動(dòng)物的一般性探索行為,需要對(duì)其運(yùn)動(dòng)功能進(jìn)行評(píng)價(jià)以排除由于自發(fā)活動(dòng)影響實(shí)驗(yàn)的準(zhǔn)確性。

1.2.1 實(shí)驗(yàn)方法

實(shí)驗(yàn)開始時(shí)從明室或暗室放入動(dòng)物,無(wú)適應(yīng)期,觀察動(dòng)物進(jìn)出明暗室的行為。 測(cè)試時(shí)間有5 ～30 min,一般為10 min[13]。

1.2.2 評(píng)價(jià)指標(biāo)

避暗實(shí)驗(yàn)中明室穿箱次數(shù)以及明室滯時(shí)間是評(píng)價(jià)焦慮的經(jīng)典指標(biāo),其他指標(biāo)如明室和暗室內(nèi)指標(biāo)均包括潛伏期、次數(shù)、路程、速度以及運(yùn)動(dòng)總時(shí)間和運(yùn)動(dòng)總路程等指標(biāo),可作為焦慮行為評(píng)價(jià)的參考指標(biāo)[14-15]。

(1)(暗室)時(shí)間:動(dòng)物在明室(暗室)停留的時(shí)間;動(dòng)物在暗室中停留時(shí)間應(yīng)大于總時(shí)間的60%,5 min 不進(jìn)入暗室的動(dòng)物可剔除。

(2)穿箱次數(shù):動(dòng)物進(jìn)入暗室次數(shù)與進(jìn)入明室次數(shù)之和。 檢測(cè)時(shí)間5 min,正常組動(dòng)物穿箱次數(shù)多大于5 次。 次數(shù)越少,表示焦慮程度越輕。

(3)潛伏期:動(dòng)物第一次從明室(暗室)完全進(jìn)入暗室(明室)的時(shí)間。

(4)其余可作為焦慮行為評(píng)價(jià)的參考指標(biāo):如明室(暗室)運(yùn)動(dòng)時(shí)間,明室(暗室)路程等。

1.3 新奇環(huán)境攝食抑制實(shí)驗(yàn)

新奇環(huán)境抑制攝食實(shí)驗(yàn)(novelty-suppressed feeding test)是由Britton 等[16]于1981 年建立,最早用于抗焦慮藥物的評(píng)價(jià),其原理是禁食后的動(dòng)物在處于一個(gè)新奇的環(huán)境中會(huì)產(chǎn)生攝食欲望和對(duì)環(huán)境恐懼的矛盾沖突,給予抗焦慮藥物可使動(dòng)物的這種矛盾沖突反應(yīng)降低,表現(xiàn)為首次攝食潛伏期縮短[17]。 1988 年,Bodnoff 等[18]首次證實(shí)該實(shí)驗(yàn)可用于檢測(cè)抗抑郁藥物是否具有抗焦慮作用。 由于焦慮是抑郁癥患者常見的癥狀,因此新奇抑制攝食實(shí)驗(yàn)常用于評(píng)價(jià)抑郁動(dòng)物模型出現(xiàn)的焦慮樣行為。

1.3.1 實(shí)驗(yàn)方法

實(shí)驗(yàn)總共需要2 ～ 3 d:實(shí)驗(yàn)動(dòng)物禁食(不禁水)24 ～ 48 h 后進(jìn)入檢測(cè)期。 檢測(cè)開始前在測(cè)試箱中央提前放入事先準(zhǔn)備好的大小相同的食丸(小鼠:1 ～ 2 粒,大鼠5 ～ 8 粒),然后將在所有動(dòng)物面朝箱壁放入測(cè)試箱的一角,開始檢測(cè),計(jì)算大鼠開始攝食的的潛伏期。 檢測(cè)時(shí)間:小鼠一般為5 ～ 10 min,大鼠為10 ～ 15 min[19-22]。

1.3.2 評(píng)價(jià)指標(biāo)

攝食潛伏期:動(dòng)物自放入測(cè)試箱到首次攝取食物的時(shí)間(攝食的判定標(biāo)準(zhǔn)是動(dòng)物開始咀嚼食物,而不是僅僅嗅聞或擺弄食物攝食潛伏期)。 如在檢測(cè)期內(nèi)動(dòng)物仍未攝食,則攝食潛伏期記為檢測(cè)總時(shí)長(zhǎng)。 檢測(cè)時(shí)間為5 min,多數(shù)正常組小鼠的攝食潛伏期小于4 min。 檢測(cè)時(shí)間為15 min,多數(shù)正常組大鼠的攝食潛伏期小于13 min。 攝食潛伏期越長(zhǎng),表示焦慮程度越重。 攝食潛伏期在統(tǒng)計(jì)學(xué)上有顯著性差異(P＜ 0.05),則視為新奇環(huán)境攝食抑制實(shí)驗(yàn)評(píng)價(jià)焦慮行為有改變。

1.4 曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)

曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)(open field test)是評(píng)價(jià)嚙齒類實(shí)驗(yàn)動(dòng)物狀態(tài)焦慮行為的經(jīng)典方法,當(dāng)動(dòng)物被放入陌生的開放場(chǎng)(陌生環(huán)境)后,由于對(duì)陌生環(huán)境的恐懼會(huì)主要在周邊區(qū)域活動(dòng),但對(duì)陌生環(huán)境的新奇感又會(huì)促使其對(duì)中央?yún)^(qū)域進(jìn)行探究,從而產(chǎn)生沖突“矛盾”[23]。 曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)最早由Hall[24]于1934 年提出,早期是通過(guò)記錄動(dòng)物在箱子里的排泄物數(shù)來(lái)反映動(dòng)物的焦慮情緒,現(xiàn)如今主要通過(guò)記錄動(dòng)物的運(yùn)動(dòng)情況來(lái)評(píng)價(jià)動(dòng)物焦慮行為。 曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)設(shè)備簡(jiǎn)單,操作簡(jiǎn)便,被廣泛用于神經(jīng)精神藥理學(xué)的基礎(chǔ)研究,是一種測(cè)試經(jīng)典苯二氮卓類和5-HT1A 激動(dòng)劑類抗焦慮藥的行為效應(yīng)的模型和檢測(cè)方式,而對(duì)三唑侖苯二氮磷類及選擇性五羥色胺重吸收抑制劑無(wú)效[25]。

1.4.1 實(shí)驗(yàn)方法

實(shí)驗(yàn)開始前,調(diào)整曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)環(huán)境燈光,一般在空?qǐng)錾戏秸彰?或在透明地板下方照明,有時(shí)使用紅外燈。 有文獻(xiàn)選用中央?yún)^(qū)的燈光強(qiáng)度為100 ～150 LX,也有照明區(qū)域燈光強(qiáng)度為8 ～ 13 LX。 實(shí)驗(yàn)開始時(shí),將大小鼠放入曠場(chǎng)測(cè)試箱的中央?yún)^(qū)即開始檢測(cè)。 檢測(cè)無(wú)適應(yīng)期,實(shí)驗(yàn)檢測(cè)時(shí)間為5 ～ 10 min,也有文獻(xiàn)報(bào)道15 ～ 30 min[26]。

1.4.2 評(píng)價(jià)指標(biāo)

(1)運(yùn)動(dòng)總時(shí)間:動(dòng)物在實(shí)驗(yàn)記錄時(shí)間內(nèi)的運(yùn)動(dòng)狀態(tài)的時(shí)間累積。

(2)總路程:在檢測(cè)時(shí)間內(nèi)動(dòng)物的的運(yùn)動(dòng)總路程。

(3)中央?yún)^(qū)/周邊區(qū)時(shí)間比值:動(dòng)物在中央?yún)^(qū)/周邊區(qū)停留總時(shí)間的比值。 為焦慮行為評(píng)價(jià)的主要指標(biāo)。 中心區(qū)宜劃分測(cè)試箱總面積的30%～ 50%。

(4)中央?yún)^(qū)/周邊區(qū)運(yùn)動(dòng)路程比值:動(dòng)物在中央?yún)^(qū)/周邊區(qū)運(yùn)動(dòng)的路程。

與空白組相比,不改變總的運(yùn)動(dòng)狀態(tài)的情況下,中央?yún)^(qū)時(shí)間顯著減少,表明動(dòng)物的焦慮狀態(tài)。其它指標(biāo)如糞便顆粒數(shù)、理毛次數(shù)可作為焦慮行為評(píng)價(jià)的參考指標(biāo)。

1.5 孔板實(shí)驗(yàn)

1962 年, Boissier 等[27]建 立 了 孔 板 實(shí) 驗(yàn)(holeboard test),用于評(píng)價(jià)動(dòng)物對(duì)不熟悉環(huán)境的反應(yīng),廣泛用于評(píng)估動(dòng)物情緒、焦慮和壓力和藥效研究[28]。 孔板實(shí)驗(yàn)是利用動(dòng)物在孔板箱中產(chǎn)生新奇和恐懼的矛盾沖突,誘導(dǎo)焦慮反應(yīng),探頭次數(shù)和時(shí)間減少。 動(dòng)物反復(fù)探頭反應(yīng)其對(duì)新環(huán)境的新奇感和逃避的渴望,抗焦慮藥物可增加動(dòng)物的探頭次數(shù)和時(shí)間。

1.5.1 實(shí)驗(yàn)方法

檢測(cè)時(shí),將小鼠背對(duì)實(shí)驗(yàn)者置于孔板中央,孔板實(shí)驗(yàn)檢測(cè)時(shí)間多為5 min[29]。

1.5.2 評(píng)價(jià)指標(biāo)

(1)探頭次數(shù):動(dòng)物在檢測(cè)時(shí)間內(nèi)動(dòng)物探頭的總次數(shù)(動(dòng)物兩眼消失在洞中為1 次探頭)。

(2)探頭時(shí)間:動(dòng)物在檢測(cè)時(shí)間內(nèi)動(dòng)物探頭的總時(shí)間。 不改變動(dòng)物自主活動(dòng)狀態(tài)的情況下,探頭次數(shù)和時(shí)間減少,表明動(dòng)物的焦慮狀態(tài)。 其它指標(biāo)如探頭潛伏期和自主活動(dòng)數(shù)可作為焦慮行為評(píng)價(jià)的參考指標(biāo)。

2 條件反射實(shí)驗(yàn)方法

2.1 飲水沖突實(shí)驗(yàn)

飲水沖突實(shí)驗(yàn)(water-drinking conflict test/Vogel test)是根據(jù)禁水大鼠飲水動(dòng)機(jī)與電擊懲罰形成矛盾沖突狀態(tài)的經(jīng)典的焦慮行為評(píng)價(jià)實(shí)驗(yàn),可用于動(dòng)物焦慮狀態(tài)的評(píng)價(jià)和抗焦慮藥物的研發(fā)。 該方法由Vogel 等[30]首先建立,由Lippa 等[31]進(jìn)行了改進(jìn)。同時(shí),飲水沖突實(shí)驗(yàn)可作為基于飲水—電擊沖突的焦慮癥動(dòng)物模型,研究發(fā)現(xiàn)苯二氮卓類、戊巴比妥類可以增加大鼠的點(diǎn)擊次數(shù),而嗎啡、美匹莫林、氫溴酸東莨菪堿則無(wú)此效應(yīng)[32]。

2.1.1 實(shí)驗(yàn)方法

實(shí)驗(yàn)前將動(dòng)物禁食48 h、禁水24 h。 分兩階段進(jìn)行[33-34]:

(1)非懲罰飲水訓(xùn)練:動(dòng)物禁水24 h 后,應(yīng)單只放入測(cè)試箱內(nèi),讓其充分探究,直到發(fā)現(xiàn)瓶嘴并開始舔水,測(cè)試時(shí)間應(yīng)為3 min,淘汰舔水少于300 次的大鼠。

(2)懲罰實(shí)驗(yàn):將動(dòng)物禁水24 h 后置于測(cè)試箱開始實(shí)驗(yàn)。 自動(dòng)物第一次找到瓶嘴并開始舔水后自動(dòng)開始計(jì)數(shù)和計(jì)時(shí),動(dòng)物舔水次數(shù)到20 次時(shí)立即給予1 次電擊,如此重復(fù)循環(huán)。 測(cè)試時(shí)間應(yīng)為

3 min。

2.1.2 評(píng)價(jià)指標(biāo)

舔水次數(shù):懲罰期內(nèi)大鼠舔吸水管的次數(shù)。 焦慮模型動(dòng)物的舔水次數(shù)明顯減少,抗焦慮藥則可增多動(dòng)物的舔水次數(shù)。 檢測(cè)期內(nèi),正常動(dòng)物懲罰期舔水次數(shù)為200 ～ 400 次左右。

2.2 Geller-Seifter 沖突實(shí)驗(yàn)

1960 年,Geller 等[35]根據(jù)Estes 在40 年代有關(guān)懲罰的研究工作,設(shè)計(jì)了基于對(duì)動(dòng)物對(duì)獎(jiǎng)賞物質(zhì)渴望和懲罰刺激的害怕從而產(chǎn)生的矛盾沖突的焦慮行為評(píng)價(jià)方法(Geller-Seifter conflict test),實(shí)驗(yàn)中,通過(guò)在給予饑餓大鼠(提前禁食)食物獎(jiǎng)賞的同時(shí)給予一定的電擊懲罰,抑制這種獎(jiǎng)賞的獲得,從而使大鼠產(chǎn)生矛盾沖突狀態(tài),給與抗焦慮藥物可相應(yīng)改變這種矛盾沖突狀態(tài)。 后期不少學(xué)者紛紛對(duì)Geller-Seifter 程序進(jìn)行改進(jìn)后,形成了Geller-Seifter沖突實(shí)驗(yàn),用于條件反射焦慮行為檢測(cè),同時(shí)也作為基于飲食-點(diǎn)擊沖突的焦慮癥動(dòng)物模型用于抗焦慮工具藥物的研究[36]。 由于Geller-Seifter 沖突實(shí)驗(yàn)操作復(fù)雜,周期長(zhǎng),且對(duì)動(dòng)物造成一定的傷害,目前已較少使用。

2.2.1 實(shí)驗(yàn)方法

經(jīng)典Geller-Seifter 程序由變動(dòng)間期(variable interval,VI)和固定比率(fixed ratio,FR)兩部分組成[37-38]。

(1)訓(xùn)練期:FR1:大鼠禁食24 h 后進(jìn)行壓桿訓(xùn)練,訓(xùn)練期為3 d,以食丸(45 mg)作為獎(jiǎng)賞(強(qiáng)化)訓(xùn)練其學(xué)會(huì)壓桿操作,每次壓桿都有一次強(qiáng)化(FRI),每天訓(xùn)練30 min,連續(xù)3 d。 檢測(cè)期間限制飲食飲水,使之維持在正常飼養(yǎng)體重的80%,通過(guò)限制飲食飲水使動(dòng)物產(chǎn)生饑渴感,以保持對(duì)獎(jiǎng)賞物質(zhì)的驅(qū)動(dòng)力,整個(gè)獎(jiǎng)賞操作階段要維持飲食飲水限制。 VI-2 min:平均每2 min 的間隔給予大鼠一次獎(jiǎng)勵(lì)物質(zhì),每天訓(xùn)練5 個(gè)周期,每次15 min,每天訓(xùn)練總時(shí)間為75 min。

(2)檢測(cè)期:非懲罰(VI)期:壓桿率較穩(wěn)定后,則在間期內(nèi)的每個(gè)15 min 的周期內(nèi)加入聲刺激(3 min)。 在聲刺激期間,食物強(qiáng)化由VI-2 min 變?yōu)镕R1。 懲罰(FR)期:約7 個(gè)訓(xùn)練期后,在聲刺激間期中加入電擊刺激(0.6 ～ 0.85 mA),聲音信號(hào)期間:壓桿,獲得食物同時(shí)給予電擊。

2.2.2 評(píng)價(jià)指標(biāo)

壓桿率:動(dòng)物在規(guī)定時(shí)間壓桿的比率。 主要的評(píng)價(jià)指標(biāo)是非懲罰期和懲罰期的壓桿率,前者用來(lái)檢測(cè)藥物非特異性效應(yīng),如鎮(zhèn)靜或興奮效應(yīng),后者反映動(dòng)物焦慮情緒的變化。 抗焦慮劑選擇性增加懲罰期反應(yīng),呈陽(yáng)性結(jié)果,而非抗焦慮劑如抗精神病藥、興奮劑等均呈陰性反應(yīng)。

3 總結(jié)與展望

大小鼠焦慮行為實(shí)驗(yàn)方法主要是基于嚙齒類動(dòng)物的探索本性與外界環(huán)境的矛盾“沖突”從而引起焦慮情緒或動(dòng)物面臨不可避免或即將發(fā)生的厭惡性刺激時(shí)做出的情緒適應(yīng)性反應(yīng)建立的。 對(duì)于研究焦慮的發(fā)生發(fā)展機(jī)制、抗焦慮藥物研發(fā)具有廣泛的應(yīng)用價(jià)值,在尋找有效的防護(hù)措施方面有著重大意義,如極地、高原、深海和太空等不同于地球生活的極限環(huán)境,導(dǎo)致的焦慮癥狀,重大新發(fā)突發(fā)傳染性疾病、地震和戰(zhàn)爭(zhēng)等誘導(dǎo)的創(chuàng)傷后應(yīng)激綜合癥,焦慮是其主要的表現(xiàn)。 由于動(dòng)物的焦慮樣行為是并不是單一的的情緒表現(xiàn),而是一種復(fù)合的情緒,建議研究者們?cè)谘芯恐兄辽俨扇∩鲜鰧?shí)驗(yàn)方法中的2 ～ 3 種去評(píng)價(jià)動(dòng)物的焦慮行為。 目前,在焦慮的科學(xué)研究中,最為常用的行為學(xué)實(shí)驗(yàn)方法為高架十字迷宮實(shí)驗(yàn)、曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)、明暗箱實(shí)驗(yàn)、新奇環(huán)境攝食抑制實(shí)驗(yàn)等非條件反射實(shí)驗(yàn)方法,非條件反射實(shí)驗(yàn)方法操作簡(jiǎn)單,無(wú)訓(xùn)練期,無(wú)適應(yīng)期或熟悉期,不用施加懲罰或獎(jiǎng)賞刺激,幾乎對(duì)動(dòng)物不產(chǎn)生正向或者反向應(yīng)激,但值得注意的是,該類方法的準(zhǔn)確性與動(dòng)物運(yùn)動(dòng)機(jī)能狀態(tài)密切相關(guān),凡能影響動(dòng)物運(yùn)動(dòng)機(jī)能的藥物和動(dòng)物本身狀態(tài)均可能影響該實(shí)驗(yàn)的正常結(jié)果。 此外,焦慮行為學(xué)實(shí)驗(yàn)受檢測(cè)裝置(尺寸、形狀、顏色等)和環(huán)境(燈光與位置,聲音與氣味,觀察者等)不同因素的影響,進(jìn)行實(shí)驗(yàn)時(shí),應(yīng)盡量保證安靜、穩(wěn)定的實(shí)驗(yàn)環(huán)境,減少干擾因素。條件反射實(shí)驗(yàn)方法如飲水沖突、Geller-Seifter 沖突等焦慮行為學(xué)實(shí)驗(yàn)方法往往結(jié)合懲罰性刺激(電擊)的策略,動(dòng)物在飲水或者獲得獎(jiǎng)賞和避免電擊之間的矛盾心理沖突引起焦慮,此類方法對(duì)動(dòng)物會(huì)造成傷害性刺激,目前已較少使用。 目前焦慮行為學(xué)實(shí)驗(yàn)的主要評(píng)價(jià)指標(biāo)大多數(shù)是評(píng)價(jià)動(dòng)物水平運(yùn)動(dòng)情況,例如在某個(gè)水平區(qū)域的活動(dòng)的路程、時(shí)間和速度等或進(jìn)入某個(gè)水平區(qū)域的次數(shù),然而對(duì)于垂直運(yùn)動(dòng)的相關(guān)參數(shù)和情緒性維度的指標(biāo)像理毛次數(shù),排便次數(shù)提取較少,且這些指標(biāo)的提取主要依靠人工觀察計(jì)數(shù)。 隨著云計(jì)算、大數(shù)據(jù)、人工智能、數(shù)字分析引擎等各種新技術(shù)向動(dòng)物行為實(shí)驗(yàn)領(lǐng)域的交叉滲透融合,給提取動(dòng)物的三維運(yùn)動(dòng)情況,情緒性指標(biāo)提供了技術(shù)基礎(chǔ),為多維度精細(xì)活動(dòng)信息全方位采集提供了可能。 可以預(yù)測(cè)將各種的技術(shù)融合于動(dòng)物行為實(shí)驗(yàn)研究中,提取更精細(xì)敏感的行為學(xué)指標(biāo),構(gòu)建更系統(tǒng)的行為學(xué)評(píng)價(jià)方法,是動(dòng)物行為實(shí)驗(yàn)方法的發(fā)展方向。

參 考 文 獻(xiàn)(References)

[ 1] Rouillon F. Anxiety with depression: a treatment need [J]. Eur Neuropsychopharm, 1999, 9(3): S87-S92.

[ 2] Demyttenaere K, Bruffaerts R, Posada-Villa J, et al.Prevalence, severity, and unmet need for treatment of mental disorders in the world health organization world mental health surveys [J]. JAMA, 2004, 291(21): 2581-2590.

[ 3] Kessler RC, Berglund P, Demler O, et al. Lifetime prevalence and age-of-onset distributions of dsm-iv disorders in the national comorbidity survey replication. [J]. Arch Gen Psychiatry,2005, 62(6): 593-602.

[ 4] 劉潔. 基于HPA 軸及BDNF-ERK-ECS 信號(hào)通路探討酸棗仁—五味子藥對(duì)的抗焦慮作用及其機(jī)制 [D]. 北京: 北京中醫(yī)藥大學(xué); 2018.Liu J. Based on HPA axis and BDNF-ERK-ECS signaling pathway to investigate the anti-anxiety effect and mechanism of suanzaoren-schisandra herbal pair [ D ]. Beijing: Beijing University of Chinese Medicine; 2018.

[ 5] 姜寧, 張亦文, 姚彩虹, 等. 大小鼠抑郁行為實(shí)驗(yàn)方法概述[J]. 中國(guó)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物學(xué)報(bào), 2021, 29(6): 830-838.Jiang N, Zhang YW, Yao CH, et al. Overview of animal behavioral tests of depression [J]. Acta Lab Anim Sci Sin,2021, 29(6): 830-838.

[ 6] Pellow S, File SE. Anxiolytic and anxiogenic drug effects on exploratory activity in an elevated plus-maze: a novel test of anxiety in the rat [J]. Pharmacol Biochem Behav, 1986, 24(3): 525-529.

[ 7] Lister RG. The use of a plus-maze to measure anxiety in the mouse [J]. Psychopharmacology(Berl), 1987, 92(2): 180-185.

[ 8] Rodgers RJ, Dalvi A. Anxiety, defence and the elevated plusmaze [J]. Neurosci Biobehav Rev, 1997, 21(6): 801-810.

[ 9] Garcia AM, Cardenas FP, Morato S. Effect of different illumination levels on rat behavior in the elevated plus-maze [J].Physiol Behav, 2005, 85(3): 265-270.

[10] Yao JQ, Liu C, Jin ZL, et al. Serotonergic transmission is required for the anxiolytic-like behavioral effects of YL-IPA08, a selective ligand targeting TSPO [J]. Neuropharmacology, 2020,178(5): 108230.

[11] Gomes KS, Nunes-De-Souza RL. Implication of the 5-HT2A and 5-HT2C ( but not 5HT1A) receptors located within the periaqueductal gray in the elevated plus-maze test-retest paradigm in mice [J]. Prog Neuropsychopharmacol Biol Psychiatry,2009, 33(7): 1261-1269.

[12] Crawley J, Goodwin FK. Preliminary report of a simple animal behavior model for the anxiolytic effects of benzodiazepines [J].Pharmacol Biochem Behav, 1980, 13(2): 167-170.

[13] Hasco?t M, Bourin M. A new approach to the light/dark test procedure in mice [J]. Pharmacol Biochem Behav, 1998, 60(3): 645-653.

[14] 張宏霞, 呂靜薇, 張北月, 等. 一種大小鼠明暗箱圖像分析處理系統(tǒng)的研制 [J]. 中國(guó)比較醫(yī)學(xué)雜志, 2018, 28(4): 43-49, 72.Zhang HX, LV JW, Zhang BY, et al. Development of a computer-aided-controlling and image analysis system for light/dark box test in mice and rats [J]. Chin J Comp Med, 2018, 28(4): 43-49, 72.

[15] Cheng CH, Costall B, Kelly ME, et al. Actions of 5-hydroxytryptophan to inhibit and disinhibit mouse behaviour in the light/dark test [J]. Eur J Pharmacol, 1994, 255(1-3): 39-49.

[16] Britton DR, Britton KT. A sensitive open field measure of anxiolytic drug activity [J]. Pharmacol Biochem Behav ,1981,15(4): 577-582.

[17] 張晶. 幼年注射氟西汀誘導(dǎo)的小鼠成年抑郁模型的研究[D]. 北京: 中國(guó)人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院; 2009.Zhang J. Study on adult mouse depression model induced by childhood injection of fluoxetine [D]. Beijing: Academy of Military Medical Sciences; 2009.

[18] Bodnoff SR, Suranyi-Cadotte B, Aitken DH, et al. The effects of chronic antidepressant treatment in an animal model of anxiety[J]. Psychopharmacology(Berl), 1988, 95(3): 298-302.

[19] Gregorio DD, McLaughlin RJ, Posa L, et al. Cannabidiol modulates serotonergic transmission and reverses both allodynia and anxiety-like behavior in a model of neuropathic pain [J].Pain, 2019, 160(1): 136-150.

[20] Abela AR, Browne CJ, Sargin D, et al. Median raphe serotonin neurons promote anxiety-like behavior via inputs to the dorsal hippocampus[ J ].Neuropharmacology,2020,168(18):107985.

[21] Steimer T. Animal models of anxiety disorders in rats and mice:some conceptual issues [J]. Dialogues Clin Neurosci, 2011, 13(4): 495-506.

[22] 蘭嘉琦, 趙春陽(yáng), 吳鐳, 等. 抗焦慮障礙藥物非臨床藥效學(xué)評(píng)價(jià)體系探索 [J]. 藥學(xué)學(xué)報(bào), 2021,56(4): 949-965.Lan JQ, Zhao CY, Wu L, et al. Exploration on non-clinical anxiety disorder models [J]. Acta Pharma Sin, 2021, 56(4):949-965.

[23] Seibenhener ML, Wooten MC. Use of the open field maze to measure locomotor and anxiety-like behavior in mice [J]. J Vis Exp, 2015, 6(96): e52434.

[24] Hall CS. Emotional behavior in the rat. I. defecation and urination as measures of individual differences in emotionality[J]. J comp physiol, 1934, 18(3): 385-403.

[25] Prut L, Belzung C. The open field as a paradigm to measure the effects of drugs on anxiety-like behaviors: a review [J]. Eur J Pharmacol, 2003, 463(1-3): 3-33.

[26] Hale MW, Hay-Schmidt A, Mikkelsen JD, et al. Exposure to an open-field arena increases c-fos expression in a distributed anxiety-related system projecting to the basolateral amygdaloid complex [J]. Neuroscience, 2008, 155(3): 659-672.

[27] Boissier JR, Simon P. The exploration reaction in the mouse.Preliminary note [J]. Therapie, 1962, 17: 1225-1232.

[28] Takeda H, Tsuji M, Matsumiya T. Changes in head-dipping behavior in the hole-board test reflect the anxiogenic and/or anxiolytic state in mice [J]. Eur J Pharmacol, 1998, 350(1):21-29.

[29] Wang X, Li G, Li P, et al. Anxiolytic effects of orcinol glucoside and orcinol monohydrate in mice [J]. Pharm Biol,2015, 53(6): 876-881.

[30] Vogel JR, Beer B, Clody DE. A simple and reliable conflict procedurefortestinganti-anxietyagents[ J ].Psychopharmacologia, 1971, 21(1): 1-7.

[31] Lippa A, Czobor P, Stark J, et al. Selective anxiolysis produced by ocinaplon, a GABA(A) receptor modulator [J]. Proc Natl Acad Sci U S A, 2005, 102(20): 7380-7385.

[32] Millan MJ, Brocco M. The vogel conflict test: procedural aspects, gamma-aminobutyric acid, glutamate and monoamines[J]. Eur J Pharmacol, 2003, 463(1-3): 67-96.

[33] Kennett GA, Trail B, Bright F. Anxiolytic-like actions of bw 723c86 in the rat vogel conflict test are 5-ht2b receptor mediated[J]. Neuropharmacology, 1998, 37(12): 1603-1610.

[34] Stachowicz K, Go?embiowska K, Sowa M, et al. Anxiolytic-like action of mtep expressed in the conflict drinking vogel test in rats is serotonin dependent [J]. Neuropharmacology, 2007, 53(6):741-748.

[35] Geller I, Seifter J. The effects of meprobamate, barbiturates, Damphetamine and promazine on experimentally induced conflict in the rat [J]. Psychopharmacology, 1960, 1(6): 482-492.

[36] Pollard GT, Howard JL. The geller-seifter conflict paradigm with incremental shock [J]. Psychopharmacology(Berl), 1979, 62(2): 117-121.

[37] Babbini M, Gaiardi M, Bartoletti M. Benzodiazepine effects upon geller-seifter conflict test in rats: analysis of individual variability [J]. Pharmacol Biochem Behav, 1982, 17(1): 43-48.

[38] Kennett GA, Bright F, Trail B, et al. Anxiolytic-like actions of the selective 5-HT4 receptor antagonists sb 204070a and sb 207266a in rats [J]. Neuropharmacology, 1997, 36(4-5):707-712.