牛病毒性腹瀉病毒（BVDV）的研究進展

姜海宇，薛華平，李家奎*

1.西藏農牧學院，西藏 林芝 860000；2.深圳市綠詩源生物技術有限公司，廣東 深圳 518120

BVDV 屬于黃病毒科瘟病毒屬，與豬瘟病毒和羊邊界病毒同屬。BVDV 是主要感染牛的病原體，也可感染大多數(shù)反芻動物，1946 年，Olafson 等[1]在美國紐約州首次發(fā)現(xiàn)，后在全球陸續(xù)被報道。1980 年，李佑民等[2]在吉林分離出1 株與國外報道相同的BVDV，這是我國首次報道該病毒，并命名為184V株。經此，此病毒正式傳入我國，在我國牛群中廣泛流傳。1990 年，洛桑列措等[3]報道在西藏牦牛體內又一次被分離。該病毒感染牛群后，以免疫抑制效應、呼吸道疾?。ê粑到y(tǒng)疾?。?、胃腸道和繁殖障礙等為主要臨床癥狀，病毒主要通過口鼻傳播，上皮細胞和免疫細胞可幫助該病毒擴散至全身，目前，尚不清楚BVDV 是如何穿過氣道中上皮細胞的屏障[4]。被BVDV 感染的牛可分為感染和持續(xù)感染（PI），持續(xù)感染的牛是輕度并且無癥狀的，進行血清學檢測結果為抗體陰性，但其體內仍然帶毒，與健康牛群接觸時仍可將其傳染給健康牛群，導致無法凈化該病毒。世界衛(wèi)生組織（OIE）與我國均將其歸為法定報告的三類疫病。自1946 年在美國首次報道牛病毒性腹瀉病毒后，其在全球范圍內蔓延，尤其在澳大利亞、阿根延以及非洲和歐洲等養(yǎng)牛發(fā)達的地區(qū)。目前，我國養(yǎng)牛業(yè)迅速發(fā)展，自20 世紀90 年代在吉林首次發(fā)現(xiàn)后，至2005 年就已傳播至少22 個省，至今已是遍布全國[5]。2021 年，杞艷萍[6]對陜西、寧夏、新疆、西藏4 省，共計17 個牛場，采集1 234份血清樣本，利用RT- PCR 進行檢測。1 234 份樣本中，陽性89 份，14 個牛場存在BVDV。以上數(shù)據說明BVDV 在我國已經廣泛流行，但我國養(yǎng)牛業(yè)相關人員對該病的理論知識尚有不足，本文查閱國內外相關資料并進行闡述總結，以期為基層工作者和生物研發(fā)人員防治此病提供參考。

1 BVDV 的生物學特性

BVDV 是球狀的單股正鏈RNA 病毒，屬瘟病毒屬，與同屬病毒具有血清學交叉反應[7]。BVDV 只有1 個血清型，但根據基因組5'UTR 和非結構蛋白Npro 的不同可以分為2 個基因型，BVDV Ⅰ型和BVDV Ⅱ型，BVDV Ⅰ型和BVDV Ⅱ型的基因組較為相似，不易辨別，但在某些基因區(qū)域可以進行基因比較，也有較大的生物學意義。目前，國內外對疫苗、體外診斷等的研發(fā)都廣泛應用BVDV Ⅰ型。此外，在巴西、東南亞等地分離出了1 種新的瘟病毒，目前稱為HoBi 樣（BVDV Ⅲ型），其在基因與抗原性上與上述2 種基因型相關，也可引起與BVD相似的臨床癥狀，但可能無法用傳統(tǒng)方法檢出。且瘟病毒抗原性和遺傳性都存在高度多邊性，目前已經發(fā)現(xiàn)BVDV Ⅰ型至少有22 個亞型，BVDV Ⅱ型也有4 個亞型。目前，我國流行的主要為BVDV Ⅰ型的Im、Ib 2 個亞型。

BVDV 可分為2 種生物型：致細胞病變型（CP），如singer 毒株；非致細胞病變型（NCP），如NY-1 毒株。NCP 型較為常見，雖然其不能使細胞發(fā)生病變，但仍然可以引起亞臨床感染，使感染牛表現(xiàn)臨床癥狀，并且與CP 型相比更容易引起牛流產。

2 BVDV 基因結構及特征

BVDV 全長約12.5 kb，1 個開放閱讀框，12 個編碼蛋白，從5'UTR 段開始，經過開放閱讀框，到3'-UTR 結束，順序為：Npro-Core-Erns-E1-E2-P7-NS2-3-NS4A-NS4B-NS5A-NSAB。兩端甲基化修飾，其中Core、Erns、E1、E2 為結構蛋白，其余均為非結構蛋白。其病毒粒子為球形的二十面體，直徑20～60 nm，病毒粒子從外到內依次為囊膜、衣殼、基因組RNA。Erns、E1、E2 組成囊膜蛋白，Core組成衣殼。病毒粒子對酸性環(huán)境較為敏感，不耐高溫，56 ℃即可滅活。

3 BVDV 編碼蛋白的主要功能

3.1 Npro 蛋白

Npro蛋白又稱為P20 蛋白或前導蛋白酶，屬于非結構蛋白，是BVDV 的第1 個蛋白，由164～168個氨基酸殘基組成，分子質量20 ku[8]。Npro蛋白是高度保守的蛋白，目前BVDV 的種、型等的分類是根據Npro蛋白的差異進行區(qū)分[9]。2009 年，Henningson 等[10]采用對比試驗將Npro蛋白保留和刪除后感染犢牛，結果顯示感染刪除Npro的BVDV 的犢牛出現(xiàn)白細胞減少和淋巴細胞減少，而沒有出現(xiàn)直腸溫度升高或靶淋巴器官的淋巴細胞衰竭，淋巴組織中的抗原沉積極少；感染帶有Npro的BVDV 的犢牛出現(xiàn)直腸溫度升高、白細胞減少、淋巴細胞減少和淋巴組織中有明顯的BVDV 抗原沉積的淋巴缺失。也表明了Npro蛋白與病毒毒力有關，缺失Npro蛋白的BVDV 突變體可能成為安全開發(fā)疫苗的候選。

3.2 Core 蛋白

Core蛋白又稱p14 蛋白或C 蛋白，屬非糖基化蛋白，與Erns、E1、E2 構成結構蛋白，由102 個氨基酸殘基組成，與基因組RNA 構成病毒核心[11-12]，分子質量約14 ku，在許多不同的瘟病毒中高度保守。1999 年，Elahi 等[13]建立了一種新的重組腺病毒，它在四環(huán)素可調節(jié)啟動子的控制下表達了BVDV 的核衣殼（C 蛋白或p14）。接種小鼠后，誘導小鼠產生了強烈的特異性免疫反應，證明c 蛋白（p14 蛋白）具有高免疫原性。Gong 等[14]研究表明，它與病毒的成熟和復制密切相關。

3.3 Erns 蛋白

Erns蛋白又稱E0 蛋白或gp48 蛋白，由227 個氨基酸殘基組成，為瘟病毒特有蛋白，Erns、E1、E2 三者均為包膜糖蛋白，展示在病毒顆粒的外部。E1 和E2 蛋白通過疏水氨基酸殘基的延伸插入膜中。Erns在雙鏈底物中充當“切口內切核糖核酸酶”降解ss－RNA。這有效防止了干擾素（IFN）的激活，并有助于在持續(xù)感染的動物中維持先天免疫耐受狀態(tài)[15]。Erns蛋白具有高度保守區(qū)域，當BVDV 感染細胞后，Erns蛋白可被大量表達，這說明可以利用Erns蛋白開發(fā)疫苗或檢測試劑盒、檢測卡等，Erns蛋白也可調節(jié)細胞凋亡因子控制細胞凋亡[16-17]。

3.4 E1 蛋白

E1 蛋白又稱gp25 蛋白，是囊膜蛋白，由195 個氨基酸殘基組成，有3 個糖基化點位，分子質量約24 ku。目前，尚未在感染BVDV 的病牛血清中發(fā)現(xiàn)E1 蛋白抗體，據推測E1、E2 可能以二聚體形式出現(xiàn)[18]。

3.5 E2 蛋白

E2 蛋白又稱gp53 蛋白，是囊膜蛋白，分子質量53 ku，是最主要的結構蛋白，E2 糖蛋白是與細胞表面受體結合所必需的，它還包含主要的抗原決定簇[19]。它是病毒誘導產生中和抗體的主要靶點，許多基于E2 的中和抗體可有效抑制病毒感染，但E2病毒保守性低，容易變異，正因如此也可將其作為基因型分類的依據，也是目前國內外學者的主要研究對象。吳桐忠等[20]建立E2 抗原蛋白的重組乳酸乳球菌，將其接種健康牛后，檢測抗體水平。結果顯示，可檢測到特異性E2 抗體，具有良好的免疫原性并為開發(fā)疫苗奠定了基礎。

3.6 P7 蛋白

P7 蛋白屬于較小的非結構蛋白，分子質量為7 ku，位于結構蛋白與NS2 蛋白之間，大多數(shù)以二聚體（E2-P7）結構形式出現(xiàn)[21]。對RNA 的復制有著重要意義，是產生感染性病毒所必須的[18]。2014 年，Atoom 等[22]研究表明，P7 蛋白可以在脂質雙分子膜上形成通道蛋白且具有離子通道活性。

3.7 NS2-3 蛋白

NS2-3 蛋白又稱p125，是最大的非結構蛋白，分子質量約為125 ku，在瘟病毒屬中屬于高度保守的非結構蛋白，當其在非致細胞病變毒株中只以NS2-3（p125）蛋白一種形式存在。在致細胞病變型毒株中會發(fā)生突變，裂解為NS2（P45）和NS3（P80）蛋白。NS2 作為NS2-3 的一部分具有蛋白酶活性，可以促進NS2-3 蛋白裂解。其他NS2 蛋白的相關功能尚有待進一步研究。但NS3（P80）蛋白廣泛受到國內外學者的關注，因其具有高度的免疫原性，疫苗毒感染主要針對NS3（P80）產生抗體，而自然感染的則針對結構蛋白產生抗體，因此可以根據NS3（P80）區(qū)分是疫苗毒還是野毒感染，對牛場牛病毒性腹瀉的凈化提供幫助[16]?？衫肗S3（P80）蛋白作為包被抗原，建立ELISA 檢測方法，用于流行病學檢測，具有較高經濟價值[23]。

3.8 NS4A、NS4B、NS5A、NSAB 蛋白

NS4A、NS4B、NS5A、NSAB 蛋白構成P175 蛋白，分別由64、347、496、718 個氨基酸殘基組成。P175 蛋白是四者的前體，其占據整個多聚蛋白的1/3，其可以不斷切割為成熟的NS4A（p10）蛋白、NS4B（p42）蛋白和p133 蛋白，p133 蛋白又不斷加工為NS5A（p58）和NS5B（p75）蛋白。NS4A（p10）蛋白可參與非結構蛋白的裂解，可輔助NS3（P80）蛋白發(fā)揮蛋白酶活性。Suda 等[24]表明NS4B 可以誘導自噬體，在病毒復制過程中有重要作用。Bashir 等[25]研究表明，NS4B 具有一定免疫原性，并證實該蛋白具有診斷、疫苗接種和治療等研究價值。NS5A（p58）蛋白具有親水性，有RNA 聚合酶功能，參與病毒復制。NS5A 蛋白位于內質網，能和病毒IRES 元件結合，并且調控IRES 所介導的病毒基因翻譯的整個過程[26]。NS5B（p75）在RNA 合成過程中發(fā)揮著重要作用。

4 診斷方法

4.1 血清學診斷

1）酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）。此方法是OIE推薦檢測BVDV 的方法，可快速對大量樣本進行檢查。通過將已知的抗原抗體包被在聚苯乙烯等固相載體上，利用抗原抗體特異性結合的原理進行檢測，該方法既可定性又可定量，既可檢測抗原也可檢測抗體。操作簡單，要求低，結果準確清晰，是臨床上檢測BVDV 的首選方法。與血清中和試驗相比，符合率可達到95%以上[27]，可用于病毒的動態(tài)檢測和群體檢測，目前也是最常用的檢測方法之一。韓美婧[28]建立了捕獲ELISA 檢測方法，結果表明特異性好、靈敏度高，穩(wěn)定性強。2019 年，Tian 等[29]使用該方法對中國四川養(yǎng)殖場出現(xiàn)腹瀉病例進行鑒定。

2）病毒中和試驗（VNT）。該方法是在體外適當條件下孵育病毒與特異性抗體的混合物，使病毒與抗體相互反應，再將混合物接種到敏感的宿主體內，然后測定殘存的病毒感染力的一種方法。童欽等[30]利用中和試驗調查了內蒙古地區(qū)6 個奶牛場509 份血清樣本，證明了內蒙古地區(qū)存在BVDV 的流行。但該方法易受其他因素影響，逐漸被ELISA 取代。

3）免疫熒光技術（IFA）。又稱熒光抗體技術，利用抗原-抗體反應的原理進行組織或細胞內抗原物質的定位，該方法靈敏度高，檢測速度快，特異性強，但對儀器要求較高，非特異性染色問題尚未完全解決，應用較少。

4）膠體金技術（GICT）。膠體金技術是利用抗原抗體特異性結合的原理進行體外診斷的一種檢測方法，可根據不同需要制備不同的檢測卡，此方法成本低、特異性好、便于操作、檢測快速，但對于BVDV 抗原的檢測卡尚不成熟，可作為未來獸醫(yī)臨床診斷的突破口。2019 年，梅力等[31]利用P80 抗原建立了一種檢測BVDV 抗體的試紙條，并與國外ELISA 進行對比，陽性符合率達到86.7%，陰性符合率達到100%。

4.2 分子生物學檢測

1）反轉錄-多聚鏈式反應（RT-PCR）。逆轉錄PCR（reverse transcription PCR）或者稱反轉錄PCR（reverse transcription-PCR，RT-PCR），是如今動物疫病常用的檢測方法之一，可用于BVDV 的鑒定與分型。該方法可以很好地區(qū)分細胞病變型和同屬病毒，常用于部分地區(qū)流行病學調查[32-33]。

2）LAMP 檢測方法。LAMP 是一種新型的核酸等溫擴增技術，該方法通過對反應過程中所產生的焦磷酸鎂白色沉淀的觀察，實現(xiàn)對擴增反應全過程的監(jiān)控，該方法檢測結果直觀，方法簡便，反應快速、具有高靈敏度，特異性強，但對引物要求較高。張宇名等[34]建立了一步RT-LAMP 檢測方法，并與商品化ELISA 試劑盒比較，共13 份樣本，符合率達100%。

ELISA 與PCR 檢測方法在世界各國應用廣泛，比中和試驗和免疫熒光技術靈敏性高，特異性好，但對儀器設備和操作人員要求較高，耗時時間長不宜推廣，上述中膠體金檢測卡的成本低、檢測速度快，對操作人員無技術要求，可快速推廣。Yao 等[35]建立了一種基于CRISPR-Cas13a 的NADL 菌株檢測方法，雖然該方法在可視化和現(xiàn)場測試方面需要不斷改進和加強，但它為快速、穩(wěn)定和靈敏地檢測BVDV 等RNA 病毒開辟了一種新的策略。

5 臨床癥狀

BVDV 是一種易感動物高發(fā)并且死亡率高的一種綜合征，可分為3 個類型，黏膜?。∕D）、急性型、持續(xù)感染型（PI），大多數(shù)牛都會出現(xiàn)腹瀉、發(fā)燒癥狀，體溫超過40 ℃，伴隨精神不振、厭食、呼吸系統(tǒng)疾病、消化系統(tǒng)疾病，嚴重者出現(xiàn)血便等，潛伏期一般5～7 d[36]。

持續(xù)感染型（PI）：持續(xù)感染型是牛場中最大的傳染源，當妊娠初期的母牛感染BVDV 且產下犢牛時，犢牛由于免疫系統(tǒng)尚不發(fā)達，不能產生免疫應答，病毒就存在于動物體中產生PI 牛。當妊娠后期感染可導致流產、死胎等。PI 牛的分泌物包括唾液、糞便、鼻液等中都含有大量病毒，PI 牛大多數(shù)表面健康，但其終生帶毒排毒，且在其體內檢測不到抗體，是最容易被忽視的傳染源，也是牛場凈化BVDV 最大的阻礙。大多數(shù)PI 牛生長緩慢，免疫系統(tǒng)不完善，發(fā)育不良，會因二次感染而導致黏膜病而死亡[37]。

急性型：PI 牛雖然是BVDV 傳播的病原之一，但感染后常見為急性型，急性病毒性腹瀉的動物發(fā)病急，體溫迅速升高，腹瀉、流涎、流鼻涕等，病情嚴重者還會出現(xiàn)便血，最后脫水死亡[38]。相關報道顯示，發(fā)病急的主要原因是機體為應對單核細胞吞噬，而不斷產生炎癥性細胞因子[39]。

黏膜病（MD）：黏膜病是牛感染BVDV 最為嚴重的類型，其雖不常見，但死亡率極高，幾乎達到100%，黏膜?。∕D）類型初期不表現(xiàn)臨床癥狀，在表現(xiàn)臨床癥狀后1 周左右死亡，可見動物重度腹瀉、脫水、皮炎、蹄炎、淋巴組織壞死、體溫升高。剖檢可見動物胃腸道黏膜潰瘍、糜爛。據報道，黏膜病產生的原因是當持續(xù)感染的動物二次感染相同或相似的CP 型，可引起NS3 蛋白重組，即可導致黏膜病。

6 流行情況

BVDV 可感染各品種牛、駱駝、豬等動物，8～24月齡最易感染，主要傳染源為PI 牛和患病動物，可通過水平傳播和接觸傳播感染，水平傳播主要依靠畜禽間接觸傳播，如舔食帶毒動物所分泌的液體；垂直傳播主要依靠胎盤傳播。該病全年可發(fā)病，冬、秋兩季節(jié)居多。

自從1946 年該病毒在美國紐約州首次發(fā)現(xiàn)以來，BVDV 在全球范圍內流傳，尤其在一些發(fā)達國家。在哥倫比亞索塔基拉牛中BVDV 的血清陽性率達40%以上[40]。Demil 等[41]對埃塞俄比亞西北部貢德爾市奶牛進行流行病學調查發(fā)現(xiàn)，BVDV 抗體流行率為26.84%，畜群血清陽性率為68.3%。近年各國也都采取了凈化BVDV 措施，取得了良好的效果，但根據流行病學調查發(fā)現(xiàn)，其在全球流行的形式依然嚴峻。Hou 等[42]對中國東部地區(qū)的36 群奶牛的牛奶進行了流行病學調查，結果表明，其中77.8%的樣品中呈現(xiàn)BVDV 抗體陽性，進一步調查了2 個畜群的個體動物狀況，陽性率分別為49.74%、24.64%，犢牛、小母牛和哺乳期奶牛的平均陽性率分別為15.94%、40.16%和41.7%。Ran 等[43]對中國多地進行流行病學調查，結果表明在奶牛群中最高BVDV 陽性率在中國的福建省達到90.0%，其次為陜西?。?8.9%）和山東?。?3.3%）。

常麗云等[44]采集了河北省唐山市38 個奶牛場共計788 份糞便樣品，利用PCR 方法進行檢測，結果顯示BVDV 平均陽性率為29.82%，但灤南縣陽性率高達45.38%。李天增等[45]利用血清中和試驗對全國2 831 份血清進行檢測，結果顯示，陽性比例高達99.47%。羅潤波等[46]對西藏、青海等4 省藏區(qū)牦牛共計897 份血清進行了流行病學調查，采用ELISA 方法檢測，陽性樣本179 份，陰性樣本718份，其中，青海地區(qū)陽性率達30%，甘肅與四川陽性率分別為17.62%、10.13%，西藏陽性率最低為5.98%。以上數(shù)據均表明，牛病毒性腹瀉病毒（BVDV）不僅在其他國家傳播，在我國也已經廣泛存在并且愈演愈烈，養(yǎng)牛行業(yè)基層工作者應予以重視，保護牛群健康，減少經濟損失。

7 預防措施

7.1 檢 測

由于各場發(fā)病情況不同，建議群體檢測BVDV抗體，了解場內感染情況，制定防控計劃。檢測BVDV 抗原，因PI 牛抗體檢測陰性，抗原檢測為陽性，排除PI 牛是場區(qū)凈化BVDV 的關鍵。凈化后制定合理檢測計劃，保持場區(qū)BVDV 檢測陰性。

7.2 加強飼養(yǎng)管理、制定免疫計劃

加強畜舍衛(wèi)生工作，衛(wèi)生與牛群的健康密切相關，可以減少病毒或細菌等微生物滋生，進而降低畜禽發(fā)病率。選取低毒廣譜消毒藥對畜禽生活區(qū)定期消毒，包括水槽、鐵鍬等日常生產用具，定期更換消毒藥，避免產生耐藥性，糞便尿液等進行無害化處理。為牛群提供優(yōu)質飼料，提高免疫力，制定合理的免疫計劃，選取正確疫苗，在幼年時期進行接種，提高免疫效果。群體免疫也不代表根除，因為BVDV毒株易變異，常導致胎牛不被保護，導致繼續(xù)形成PI 牛，控制計劃的重點在于降低疾病的流行率，而根除計劃的重點是維持牛群檢測為陰性。

7.3 加強人員管理、堅持自繁自養(yǎng)

嚴格遵守消殺制度，對于場外返回人員或車輛嚴格控制，不得隨意進出。對場區(qū)員工進行專業(yè)培訓，提高防范意識，避免疫情發(fā)生。建議自繁自養(yǎng)，盡量全進全出，減少交叉。但我國常引進新品種，應對精液等進行病原檢測，對新引進品種一定要確保健康后才可混群飼養(yǎng)[47-49]。BVDV 是一種與養(yǎng)牛業(yè)高度相關的病原體。PI 型BVD 是輕度或無癥狀的，所以它們是健康牛感染BVDV 的主要來源。因此，從牛群中快速識別和清除PI 動物非常重要[50]。

8 結 語

牛病毒性腹瀉病毒已經廣泛流傳，對于此病的凈化也已經迫在眉睫，在日常飼養(yǎng)中應加強飼養(yǎng)管理，快速識別PI 牛，凈化牛場病毒性腹瀉。目前的診斷方法操作要求較高，不利于基層普及，應研發(fā)一種操作簡單、價格低廉、檢測準確快速的體外診斷方法，為我國養(yǎng)牛業(yè)提供有力保障，提高經濟效益。