視網(wǎng)膜缺血性損傷動物模型與發(fā)病機制的研究進展

秦亞麗，冀美琦，訾迎新，鄧婷婷，韓夢雨，金明

視網(wǎng)膜缺血性損傷（retinal ischemic injury，RII）是許多眼底血管性疾病的病理基礎(chǔ)之一，如視網(wǎng)膜血管阻塞、缺血性視神經(jīng)病變等[1-2]。RII 導(dǎo)致視網(wǎng)膜組織內(nèi)長期低灌注，并誘發(fā)不可逆的視神經(jīng)細胞退行性病變，最終造成患者視力下降或視覺障礙。選擇理想的RII 模型，深入探索其潛在的發(fā)病機制，可以為全面認識該病變并尋求有效的治療方法提供研究基礎(chǔ)。近年來，許多學(xué)者通過建立不同類型的急、慢性缺血性視網(wǎng)膜病變的動物模型，針對不同病變階段的多個機制環(huán)節(jié)做了大量研究，取得了一定的進展。本文對近年來與RII相關(guān)動物模型與發(fā)病機制的研究進展進行歸納總結(jié)。

1 RII常見動物模型

用于研究視網(wǎng)膜疾病的動物主要包括大鼠、小鼠、獼猴、家兔、家豬、貓和犬等[3]。常見的視網(wǎng)膜缺血模型包括升高眼壓法、視神經(jīng)或血管結(jié)扎法、光動力或藥物注射誘導(dǎo)法等。

1.1 升高眼壓法

升高眼壓法主要是通過輸液管將37℃的生理鹽水引入前房，增加輸液管的高度使眼內(nèi)壓提升至70～90 mm Hg（1 mm Hg=0.133 kPa），維持時間一般為45～60 min，顯微鏡下可以觀察到虹膜變白和視網(wǎng)膜動脈白化等現(xiàn)象[4]。這種方法多用于制作急性視網(wǎng)膜缺血或急性青光眼模型。也有采用前房注射聚苯乙烯珠誘導(dǎo)慢性高眼壓模型，在單次注射聚苯乙烯珠后，高眼壓至少能夠維持3 個月，導(dǎo)致視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞（retinal ganglion cell，RGC）發(fā)生漸進性萎縮[5]。

1.2 視神經(jīng)結(jié)扎或鉗夾法

大鼠眼動脈在視神經(jīng)鞘膜內(nèi)與視神經(jīng)伴行，采用視神經(jīng)結(jié)扎或鉗夾法等機械性損傷可有效阻斷視網(wǎng)膜血供。KONRAD K 等[6]持續(xù)結(jié)扎大鼠球后視神經(jīng)束60 min 后，觀察到視網(wǎng)膜血流中斷，視網(wǎng)膜電流圖顯示a、b 波振幅明顯降低，超微結(jié)構(gòu)觀察中可見細胞核固縮和殘留線粒體。JONAS JB 等[7]采用鉗夾球后視神經(jīng)束法制作恒河猴視網(wǎng)膜中央動脈（central artery retina，CRA）閉塞模型，鉗夾時間為97～300 min，通過眼底照相和熒光素眼底血管造影證實CRA閉塞成功。在中老年動脈粥樣硬化和動脈高血壓的恒河猴中，CRA閉塞的持續(xù)時間與視網(wǎng)膜神經(jīng)纖維層的可見性降低和視盤蒼白程度之間具有相關(guān)性，CRA 閉塞的持續(xù)時間為240 min 或以上，神經(jīng)纖維層幾乎全部出現(xiàn)損傷和嚴重視神經(jīng)萎縮[8]。

1.3 血管結(jié)扎法

雙側(cè)頸總動脈結(jié)扎（bilateral common carotid artery occlusion，BCCAO）或聯(lián)合雙側(cè)椎動脈結(jié)扎，即2 或4 血管閉塞法，是研究視網(wǎng)膜缺血模型的常用方法[9]。BCCAO 誘導(dǎo)的低灌注性視網(wǎng)膜病變典型病理表現(xiàn)為視網(wǎng)膜神經(jīng)細胞凋亡和膠質(zhì)細胞活化增生[10]。有學(xué)者[11-12]通過建立BCCAO 模型，觀察到視網(wǎng)膜動脈變細、靜脈擴張等眼底表現(xiàn)，形態(tài)學(xué)研究顯示視網(wǎng)膜感光細胞發(fā)生明顯的病理性損害。局部血管結(jié)扎主要是將視網(wǎng)膜中央動脈、靜脈和視神經(jīng)束一起進行結(jié)扎，或剪開球后視神經(jīng)鞘膜，僅分離并鉗夾CRA，60 min后松開，可以觀察到眼底視網(wǎng)膜血流中斷和再灌注現(xiàn)象[13]。

1.4 光動力誘導(dǎo)法

此法通常采用注射誘導(dǎo)劑聯(lián)合激光制作眼底分支血管缺血模型，單純激光或單純誘導(dǎo)劑干預(yù)并不能成模。WANG RS 等[14]通過注射血卟啉衍生物2 h 后再給予氪紅色激光照射（波長647 nm）誘導(dǎo)前部缺血性視神經(jīng)病變大鼠模型，病變早期可見視盤水腫，后期出現(xiàn)視網(wǎng)膜神經(jīng)纖維層變薄。也有學(xué)者[15]采用注射赤蘚紅素B 染液加激光誘導(dǎo)制備后部缺血性視神經(jīng)病變模型。國內(nèi)有研究[16]采用光化學(xué)法誘導(dǎo)兔視網(wǎng)膜分支靜脈阻塞模型，觀察到阻塞區(qū)域單位面積內(nèi)血液灌注量明顯下降。

1.5 藥物誘導(dǎo)法

常用誘導(dǎo)劑如血管內(nèi)皮素-1（endothefin，ET-1），由于其強大的血管收縮作用，會導(dǎo)致視網(wǎng)膜缺血和氧化應(yīng)激，加重RGC 凋亡和視神經(jīng)軸突退行性損傷[17]。在大鼠眼球后植入ET-1 滲透式微型泵，通過熒光標記法監(jiān)測發(fā)現(xiàn)了RGC 存活時間減少，伴有視神經(jīng)血流灌注量減少68%[18]。在兔視神經(jīng)周圍植入ET-1 微型泵后，觀察到2 周時視神經(jīng)微血管中氧蛋白的表達增加，8周后RGC 數(shù)量減少，內(nèi)、外核層隨著時間的推移變得越來越薄[19]。

2 RII主要發(fā)病機制

2.1 氧自由基損傷

正常情況下，細胞內(nèi)存在的氧自由基和氧化物處于較低水平，維持細胞內(nèi)的多種生理活動。然而組織缺血、缺氧時活性氧（reactive oxygen species，ROS）含量增加，通過介導(dǎo)線粒體呼吸鏈、還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（nicotinamide adenine dinucleotide phosphate，NADPH）氧化酶、一氧化氮合成酶（nitric oxide synthetase，NOS）等多種途徑產(chǎn)生細胞毒性作用[20]。NADPH 氧化酶的非吞噬細胞氧化酶（non-phagocytic cell oxidase，NOX）有許多亞型，其中，在視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮、周細胞、神經(jīng)節(jié)細胞和小膠質(zhì)細胞中表達的亞型主要包括NOX1、NOX2 和NOX4 等，其過度表達增加了ROS 的形成，誘發(fā)視網(wǎng)膜新生血管形成、毛細血管阻塞、血管滲漏和視網(wǎng)膜色素上皮細胞加速衰老等病變[21-22]。體外研究[23]發(fā)現(xiàn)，巨噬細胞和小膠質(zhì)細胞的過度活化使誘導(dǎo)型NOS 表達上調(diào)，釋放大量一氧化氮（nitric oxide，NO），過量NO 通過與超氧陰離子結(jié)合形成強氧化物，也會加重視網(wǎng)膜組織的氧化損傷。

2.2 線粒體功能障礙

線粒體通透性轉(zhuǎn)移孔（mitochondrial permeability transition pore，MPTP）介導(dǎo)的神經(jīng)元細胞死亡被認為是RII導(dǎo)致線粒體功能障礙后的一個重要病理機制[24]。線粒體基質(zhì)特異性蛋白親環(huán)素D（cyclophilinD，CypD）是MPTP 的重要結(jié)構(gòu)組成部分，在MPTP 的開放中起著關(guān)鍵作用，CypD 水平升高，導(dǎo)致局部缺血后線粒體膜電位異常和ROS 的過度生成[25]。線粒體轉(zhuǎn)錄因子A（mitochondrial transcription factor A，MTFA）是一種細胞核編碼的DNA 結(jié)合蛋白，在線粒體基因表達和線粒體DNA 維護中起著重要作用[26]。KIM SY 等[27]研究發(fā)現(xiàn)，急性視網(wǎng)膜缺血可以誘發(fā)MTFA 蛋白和CypD 蛋白的過度表達，二者是介導(dǎo)視網(wǎng)膜神經(jīng)細胞凋亡的重要因素。

2.3 興奮性氨基酸毒性作用

Na+的細胞轉(zhuǎn)運依賴于Müller 細胞內(nèi)谷氨酸-天冬氨酸轉(zhuǎn)運體（glutamate-aspartate transporter，GLAST），GLAST 的喪失會導(dǎo)致視網(wǎng)膜神經(jīng)細胞退行性損害[28]。興奮性氨基酸轉(zhuǎn)運蛋白-1（excitatory amino acid transporter-1，EAAT-1）的功能紊亂往往是導(dǎo)致興奮性細胞死亡的關(guān)鍵因素[29]。研究[28]發(fā)現(xiàn)，視網(wǎng)膜缺血、缺氧時激活p38 絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinases，MAPK）信號通路，肌動蛋白細胞骨架不穩(wěn)定，使細胞膜上Na+/K+-ATP 酶減少，細胞能量生成障礙，Müller 細胞內(nèi)Na+濃度增加，對細胞外谷氨酸的攝取減少，導(dǎo)致Ca2+通道異常開放，細胞內(nèi)Ca2+超載，激活線粒體膜上半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶（Caspase）通路，細胞色素C 釋放增加，啟動細胞凋亡。Ca2+超載導(dǎo)致的線粒體功能障礙引起氧自由基過量釋放，加重氧化損傷，使神經(jīng)元的結(jié)構(gòu)和功能受到破壞，直到死亡，被稱為興奮性神經(jīng)毒性作用[30]。

2.4 炎癥反應(yīng)

視網(wǎng)膜缺血時，組織中許多炎性因子和趨化因子被激活，如白細胞介素-1α（interleukin-1α，IL-1α）過度表達，細胞間粘附分子-1（intercellular adhesion molecule，ICAM-1）、組織金屬蛋白酶抑制劑（tissue inhibitor of metalloproteinase，TIMP）和血管內(nèi)皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）等含量增加，趨化蛋白如細胞因子誘導(dǎo)的中性粒細胞化學(xué)引誘物（cytokine-induced neutrophil chemoattractant，CINC）和巨噬細胞炎癥蛋白（macrophage inflammatory protein，MIP）等表達水平也明顯增加[31]。在眼缺血綜合征模型中發(fā)現(xiàn)，Toll 樣受體（Toll-like receptors，TLRs）介導(dǎo)的髓樣分化因子（myeloid differentiation factor88，MYD88）信號通路被激活，并啟動下游炎癥信號，激活核轉(zhuǎn)錄因子（nuclear factor-κB，NF-κB）和轉(zhuǎn)錄因子激活蛋白-1（activator protein-1，AP-1）等，進一步調(diào)控炎性因子的表達[32]。

2.5 細胞凋亡

細胞凋亡是一種在多種內(nèi)源性或外源性因素誘導(dǎo)下，相關(guān)基因調(diào)控機制被激活，導(dǎo)致細胞發(fā)生特異性程序化死亡的現(xiàn)象。缺血時ROS 過度釋放，對B 細胞原癌基因（B-cell lymphocyte/leukemia-2，Bcl-2）家族參與的神經(jīng)細胞凋亡具有調(diào)控作用[33]。Bcl-2 為凋亡抑制蛋白，主要位于線粒體外膜，拮抗細胞質(zhì)內(nèi)的促凋亡因子對線粒體的攻擊；Bcl-2關(guān)聯(lián)X 蛋白（Bcl-2 associated X protein，Bax）為凋亡促進蛋白，與線粒體內(nèi)膜的腺苷轉(zhuǎn)位因子和外膜的電壓依賴性陰離子通道結(jié)合，介導(dǎo)線粒體跨膜通道開放，釋放細胞色素C 進入細胞質(zhì)，激活細胞質(zhì)內(nèi)一系列促凋亡因子，最后激活下游Caspase-3，完成蛋白質(zhì)降解。在視網(wǎng)膜缺血模型中觀察到，RGC層、內(nèi)核層和內(nèi)、外叢狀層可見Bax蛋白表達增加、Bcl-2表達降低現(xiàn)象[34]。GALINA D 等[4]將RGC 進行氧糖剝奪離體培養(yǎng)實驗發(fā)現(xiàn)，細胞中有引發(fā)壞死的受體相互作用蛋白激酶（receptor-interacting protein kinase，RIPK）表達。MESTER L等[35]發(fā)現(xiàn)視網(wǎng)膜低灌注可以誘導(dǎo)細胞毒性信號通路中的c-Jun 氨基末端蛋白激酶（c-Jun N-terminal protein kainse，JNK）和MAPK 磷酸化，在介導(dǎo)缺血誘導(dǎo)的視網(wǎng)膜神經(jīng)元退行性病變過程中發(fā)揮了重要作用。

3 小結(jié)

本文總結(jié)發(fā)現(xiàn)，RII與腦低灌注損傷關(guān)系密切，已成為神經(jīng)科和眼科等領(lǐng)域交叉疾病的研究熱點。誘導(dǎo)RII 動物模型的方法以血管壓迫類或血管結(jié)扎類為主。氧自由基損傷是視網(wǎng)膜缺血發(fā)病機制的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，并伴隨出現(xiàn)線粒體能量代謝障礙、興奮性氨基酸毒性作用等現(xiàn)象，最終導(dǎo)致視網(wǎng)膜神經(jīng)細胞凋亡的結(jié)局。因此在本病的治療上，緩解視網(wǎng)膜缺血、缺氧狀態(tài)，阻止細胞凋亡的發(fā)生與加重，是改善視網(wǎng)膜神經(jīng)細胞功能，進而提高患者視覺質(zhì)量的關(guān)鍵點。在今后的工作中，還需要更深入地展開RII的防治研究。