基于流式細(xì)胞術(shù)對(duì)27種石斛的倍性鑒定和基因組大小分析

熊文艷，普 冉，劉云禮，陳軍文，張敬麗*

基于流式細(xì)胞術(shù)對(duì)27種石斛的倍性鑒定和基因組大小分析

熊文艷1,2，普 冉1,2，劉云禮1,2，陳軍文2,3，張敬麗1,2*

1. 云南農(nóng)業(yè)大學(xué)園林園藝學(xué)院，云南昆明 650201；2. 西南中藥材種質(zhì)創(chuàng)新與利用國(guó)家地方聯(lián)合工程研究中心，云南昆明 650201；3. 云南農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)與生物技術(shù)學(xué)院，云南昆明 650201

石斛屬（）是蘭科（Orchidaceae）一個(gè)大屬，我國(guó)植物志記載有76種，主要分布于我國(guó)海南省、西南和兩廣地區(qū)，石斛屬植物種類繁多，花朵鮮艷，顏色豐富，花期長(zhǎng)，具有極高觀賞價(jià)值。目前，石斛屬植物野外資源瀕臨滅絕，面臨自交異交不親和、觀賞種數(shù)量少、缺乏優(yōu)良育種親本的困境，為保護(hù)現(xiàn)有良種、培育新物種及為建立基因分子庫(kù)奠定基礎(chǔ)，以石斛屬植物幼嫩葉片為材料，采用MGb解離液制備細(xì)胞核懸浮液，利用玉米（, ‘B73’）和番茄（）作為內(nèi)標(biāo)，建立了基于流式細(xì)胞術(shù)測(cè)定石斛倍性和基因組大小的方法，用流式細(xì)胞儀對(duì)蘭科（Orchidaceae）石斛屬（）27種石斛屬植物的倍性和基因組大小進(jìn)行測(cè)定。研究表明：以玉米為內(nèi)標(biāo)區(qū)分度較好，且沒(méi)有重疊峰，峰型清晰集中，對(duì)27種石斛屬植物的倍性和基因組大小能準(zhǔn)確估測(cè)；27種石斛中二倍體19種，三倍體5種，四倍體3種；27種石斛分屬于8組，分別是禾葉組1種，頂葉組2種，石斛組16種，瘦軸組1種，叉唇組1種，距囊組1種，草葉組4種，基腫組1種，各個(gè)組間基因組大小不同，各組內(nèi)基因組大小也存在差異；27種石斛預(yù)估基因組大小在0.98～2.41 pg之間，預(yù)估的平均基因組大小為1.44 pg，27種石斛的基因組大小均大于0.7 pg，主要集中在0.7～1.4 pg之間，其中草石斛的預(yù)估基因組最大，梳唇石斛最小，二者的預(yù)估基因組大小相差近2.5倍；27種石斛的基因組可歸為極小基因組或小基因組。該研究為石斛屬植物的人工雜交授粉配置、雜交育種、多倍體誘導(dǎo)提供便利，同時(shí)，為石斛屬植物基因分子庫(kù)的建立以及石斛屬植物基因組學(xué)、遺傳變異、進(jìn)化生物學(xué)與全基因組測(cè)序等研究奠定基礎(chǔ)。

流式細(xì)胞術(shù)；石斛；倍性；基因組大小

蘭科（Orchidaceae）石斛屬（）植物，全屬有15 000多個(gè)原生種，分布橫跨亞洲至大洋洲的熱帶及亞熱帶地區(qū)，我國(guó)植物志記載有原生種76種，主要分布在我國(guó)海南省和西南、兩廣地區(qū)[1]。石斛屬植物種類繁多，花朵鮮艷，顏色豐富，花期長(zhǎng)，具有極高觀賞價(jià)值[2]。近年來(lái)，由于石斛屬植物對(duì)生境要求及其嚴(yán)格，自然條件下種子萌發(fā)率極低，加之繁殖速度過(guò)慢，且野生資源采挖現(xiàn)象嚴(yán)重，石斛野外資源瀕臨滅絕，被列為《國(guó)家重點(diǎn)保護(hù)野生植物名錄》中的國(guó)家二級(jí)保護(hù)野生植物，并被列入《瀕危野生動(dòng)植物種國(guó)際貿(mào)易公約》（CITES）附錄Ⅱ中，大部分種也被列入世界自然保護(hù)聯(lián)盟（IUCN）物種紅色名錄中[3]，因此保護(hù)現(xiàn)有物種及繁育新物種迫在眉睫。

龔建英等[4]研究發(fā)現(xiàn)石斛屬植物中有些種自交、異交都不親和，且不同種植物之間雜交，坐果率、膨大率和萌發(fā)率以及單果質(zhì)量會(huì)出現(xiàn)不同變異情況，推測(cè)出石斛種間雜交親和性可能與親本材料親緣關(guān)系的遠(yuǎn)近、植物染色體數(shù)量等相關(guān)。植物細(xì)胞核的重要組成成分染色體是基因的主要載體，染色體數(shù)目的變化常導(dǎo)致植物形態(tài)、生理、生化代謝等諸多遺傳特性的變異。其中在雜交育種中，育種親本植物的染色體信息研究是進(jìn)行雜交的基礎(chǔ)，對(duì)雜交育種有著非常重要的指導(dǎo)作用，廖道龍等[2]利用流式細(xì)胞術(shù)結(jié)合形態(tài)學(xué)鑒定出21種石斛屬植物為二倍體，但是也發(fā)現(xiàn)染色體比較復(fù)雜，倍性同樣具有多樣性；黃少玲[5]利用流式細(xì)胞術(shù)鑒定了20多種國(guó)產(chǎn)原生種的染色體倍性，同時(shí)用染色體壓片的方法進(jìn)行了結(jié)果驗(yàn)證，表明2種方法處理得到的結(jié)果差異不大，為開(kāi)展石斛屬植物的倍性鑒定提供科學(xué)依據(jù)。

生物體的單倍體基因組所含的DNA含量被稱為基因組大小或C值（chromatin-value）[6]。一般以重量為度量計(jì)算基因組大小，單位是pg，也可以以核苷酸堿基對(duì)的數(shù)量表示，1 pg DNA的量約等于978 Mb堿基對(duì)的量[7]。通過(guò)比較參照植物熒光強(qiáng)度，利用公式計(jì)算出待測(cè)樣品DNA含量的方法就是流式細(xì)胞術(shù)（flow cytometry, FCM）測(cè)定基因組大小方法。測(cè)定植物的基因組大小，既可以為其基因組學(xué)研究和遺傳進(jìn)化生物學(xué)研究提供理論基礎(chǔ)，也為生態(tài)學(xué)和細(xì)胞生物學(xué)的研究提供參考[8]。張桂芳等[9]用流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)行了鐵皮石斛核DNA檢測(cè)，篩選出了較為快速、準(zhǔn)確的利用流式細(xì)胞儀檢測(cè)鐵皮石斛倍性的方法以及最佳解離液，為后續(xù)石斛屬植物的流式細(xì)胞檢測(cè)奠定了基礎(chǔ)。流式細(xì)胞儀檢測(cè)不受取材時(shí)間限制，已廣泛應(yīng)用于細(xì)胞學(xué)、遺傳學(xué)、細(xì)胞周期分析及植物基因組大小估算等研究中，迄今在蓮瓣蘭（）和墨蘭（）[10]、蝴蝶蘭（）[11]、蕙蘭（）[12]等蘭科植物和火龍果（）[13]、野草莓（L.）[14]、橡膠（）[15]等植物以及茉莉花（）[16]、鳶尾屬（）植物[17]、桂花（）[18]等觀賞花木中運(yùn)用流式細(xì)胞術(shù)鑒定倍性并均證實(shí)了染色體倍性的可靠性。

綜上所述，目前有關(guān)石斛倍性研究、染色體核型分析、DNA含量的測(cè)定等細(xì)胞遺傳學(xué)方面的研究資料還較少，相關(guān)研究也只有零星報(bào)道。細(xì)胞遺傳學(xué)方面的研究，包括染色體的數(shù)目、倍性、形態(tài)、大小等，對(duì)于植物遺傳改良和雜交育種工作具有重要意義，亟需進(jìn)一步研究探索。本研究采用流式細(xì)胞術(shù)對(duì)27種石斛屬植物的倍性和基因組大小進(jìn)行研究，一方面為石斛屬植物的人工雜交授粉配置、雜交育種、倍性育種等提供便利，另一方面為石斛屬植物基因分子庫(kù)的建立，及石斛屬植物基因組學(xué)、遺傳變異、進(jìn)化生物學(xué)與全基因組測(cè)序等研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

所用石斛材料為剛萌發(fā)的新生嫩葉或嫩芽，采集地點(diǎn)見(jiàn)表1，其中憑證標(biāo)本存放于云南農(nóng)業(yè)大學(xué)園林園藝學(xué)院標(biāo)本室。以二倍體的玉米（）‘B73’和番茄（）為內(nèi)參，基因組大小分別為2.3 Gb和900 Mb，內(nèi)參采集于中國(guó)科學(xué)院昆明植物研究所。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞懸浮液制備 參考李春牛等[16]的方法，將樣品置于解離液中，將組織用鋒利的刀片迅速垂直切碎，連同解離液在冰上靜置10 min，然后用濾網(wǎng)過(guò)濾，即得到細(xì)胞核懸浮液。將得到的細(xì)胞核懸浮液置于冰上避光染色1 h。

表1 本研究材料來(lái)源

注：–表示未評(píng)估；VU表示易危；NT表示近危；EN表示瀕危；CR表示極危；LC表示無(wú)危。

Note: – means not assessment; VU means vulnerable; NT means nearly unstoppable; EN means endangered; CR means critically endangered; LC means no danger.

1.2.2 流式細(xì)胞儀檢測(cè) 參考李春牛等[16]的方法將待測(cè)樣品的懸液和內(nèi)參樣品的懸液按適當(dāng)比例混合進(jìn)行上機(jī)檢測(cè)。使用Modifit 3.0分析軟件作圖分析。

1.2.3 基因組大小計(jì)算 根據(jù)計(jì)算公式：待測(cè)樣品DNA含量或倍性水平=參照樣本核DNA含量或倍性水平×參照樣本G0或G1峰熒光值/待測(cè)樣本G0或G0峰熒光值[19]。

2 結(jié)果與分析

2.1 27種石斛屬植物的倍性分析

以玉米為內(nèi)參，采用內(nèi)參法對(duì)27種石斛屬植物DNA含量進(jìn)行測(cè)定，以二倍體鐵皮石斛為對(duì)照，流式細(xì)胞儀測(cè)得二倍體鐵皮石斛染色體的熒光強(qiáng)度值為30.5。27個(gè)石斛屬植物中，18種熒光強(qiáng)度值在24.05～36.23之間，呈0.78～1.18倍二倍體的熒光強(qiáng)度，與對(duì)照相比為二倍體（圖1A）；有5種熒光強(qiáng)度值在43.60～56.06之間，呈現(xiàn)為1.43～1.83倍二倍體的熒光強(qiáng)度，與對(duì)照相比為三倍體（圖1B）；3種熒光強(qiáng)度在56.32～60.23之間，呈現(xiàn)為1.83～1.97倍二倍體的熒光強(qiáng)度，與對(duì)照相比為四倍體（圖1C）。綜上所述，27種石斛屬植物中，除二倍體鐵皮石斛外，共有18種為二倍體，5種為三倍體，3種為四倍體（表2）。

2.2 27種石斛屬植物的預(yù)估基因組大小分析

27種石斛預(yù)估基因組大小在0.98～2.41 pg（表2），預(yù)估的平均基因組大小為1.44 pg。其中預(yù)估基因組大小在0～0.7 pg的石斛為0，0.7～ 1.4 pg有17種，1.4～3.5 pg有10種。27種石斛的基因組大小均大于0.7 pg，主要集中在0.7～1.4 pg，其次在1.4～3.5 pg，其中草石斛的預(yù)估基因組最大，梳唇石斛最小，二者的預(yù)估基因組大小相差近2.5倍。根據(jù)植物基因組IC值大小分類，IC< 0.7 pg的為超小基因組，IC≥0.7 pg和IC≤1.4 pg的基因組劃分為極小基因組，IC>1.4 pg和IC≤3.5 pg的基因組劃分為小基因組的分類標(biāo)準(zhǔn)[20]，這27種石斛的基因組可歸為極小基因組或小基因組。

27種石斛分屬于8組，分別是禾葉組1種，頂葉組2種，石斛組16種，瘦軸組1種，叉唇組1種，距囊組1種，草葉組4種，基腫組1種，組間預(yù)估基因組大小不同。石斛組的16種預(yù)估基因組大小為1.18～2.13 pg，大小為0.7～1.4 pg的有9種，1.4～3.5 pg的有7種，預(yù)估的平均基因組大小為1.49 pg。草葉組的4種預(yù)估基因組大小為0.98～2.41 pg，其中大小為0.7～1.4 pg有2種，1.4～3.5 pg有2種，預(yù)估的平均基因組大小為1.67 pg。瘦軸組的重唇石斛和基腫組的針葉石斛基因組大小較為接近，禾葉組的竹枝石斛與頂葉組的2種石斛基因組大小也比較接近。

圖1 部分石斛的倍性檢測(cè)結(jié)果

表2 27種石斛倍性及基因組大小

組間預(yù)估平均基因組大小不同，8組內(nèi)石斛預(yù)估基因組大小也存在差異。草葉組內(nèi)的4種石斛基因組大?。?.98～2.41 pg）差異最大，約為2.5倍；石斛組內(nèi)的16種石斛基因組大小（1.18～ 2.13 pg）差異較大，約為1.8倍，而頂葉組的2種石斛基因組大小較為接近（1.01～1.06 pg），差異最小。

3 討論

流式細(xì)胞術(shù)測(cè)定植物倍性和基因組大小的要求是有一個(gè)已知的基因組作為參考標(biāo)準(zhǔn)，內(nèi)標(biāo)可以防止因儀器漂移或染色不均勻而導(dǎo)致的誤差[17]。在選擇內(nèi)標(biāo)時(shí)，本研究全部樣品選擇了與待測(cè)樣品不同屬性的、細(xì)胞核大小相近的、符合作為內(nèi)參條件的玉米作為內(nèi)標(biāo)，排除了種之間因?yàn)閮?nèi)標(biāo)不一樣造成的誤差，使變異系數(shù)控制在5%以內(nèi)，更精確地分析鑒定了石斛倍性。

倍性分析是研究遺傳進(jìn)化、系統(tǒng)分類以及開(kāi)展雜交育種工作的基礎(chǔ)[21]。植物倍性鑒定一是通過(guò)染色體計(jì)數(shù)的方法鑒定倍性，該方法對(duì)于細(xì)胞核較小或染色體多的植物很難得到準(zhǔn)確的結(jié)果，并且試驗(yàn)操作技術(shù)要求較高，費(fèi)時(shí)費(fèi)工；二是從外形特征、氣孔大小、保衛(wèi)細(xì)胞數(shù)目等方面間接鑒定，該方法受材料所處的生理狀態(tài)影響較大，準(zhǔn)確性不高，很難區(qū)分非整倍體和嵌合體[22]。流式細(xì)胞術(shù)不受植物取材部位和細(xì)胞所處時(shí)期的限制，制樣簡(jiǎn)單，靈敏度、分辨率及準(zhǔn)確性較高，數(shù)據(jù)的可重復(fù)性較好，測(cè)試速度快，適于樣品較多的倍性檢測(cè)分析[21]，目前流式細(xì)胞術(shù)已成為鑒定植物倍性和基因組大小的首選方法，但是對(duì)于同一種植物而言，采用不同的參照標(biāo)品、使用不同解離液、不同的取材部位、染色時(shí)間和方法、流式細(xì)胞儀和畫圖軟件的不同型號(hào)，基因組大小測(cè)定值都會(huì)有所不同[23]。本研究中經(jīng)流式細(xì)胞術(shù)鑒定玫瑰石斛、重唇石斛、聚石斛、細(xì)莖石斛、金釵石斛均為二倍體，細(xì)葉石斛為四倍體，該結(jié)果與前人的研究結(jié)果一致；流蘇石斛本研究中鑒定為三倍體，與黃少玲[5]的流式細(xì)胞術(shù)鑒定結(jié)果一致，但傳統(tǒng)染色體計(jì)數(shù)法鑒定流蘇石斛為二倍體，出現(xiàn)倍性鑒定結(jié)果不一致，原因可能是流蘇石斛相比較其他石斛具有較多的染色體數(shù)目，在染色體計(jì)數(shù)法中用根尖制片的過(guò)程中部分根尖細(xì)胞破碎，導(dǎo)致部分染色體丟失，出現(xiàn)了倍性不一致的現(xiàn)象，所以相比傳統(tǒng)方法，流式細(xì)胞檢測(cè)結(jié)果更加準(zhǔn)確。

張文駒等[24]研究表明，山茶屬植物從起源點(diǎn)向北擴(kuò)張的過(guò)程中為了適應(yīng)寒冷氣候逐漸從二倍體向六倍體進(jìn)化，與典型的多倍化增強(qiáng)植物的耐寒機(jī)制相符。本研究中27種石斛屬植物大部分為二倍體，少數(shù)出現(xiàn)三倍體和四倍體，是否與多倍化現(xiàn)象增強(qiáng)了植物的耐寒性機(jī)制相符，或者是為了適應(yīng)環(huán)境變化產(chǎn)生的協(xié)調(diào)進(jìn)化等，這些在石斛屬植物中有待進(jìn)一步研究。

染色體片段的擴(kuò)增和缺失可能導(dǎo)致基因組大小的變化[25]。本研究中鐵皮石斛預(yù)估基因組大小為1.15 GB，而已經(jīng)公布的鐵皮石斛基因組大小為1.35 GB[26]，存在差異首先可能是所取的材料來(lái)源于不同的植物群體且自身發(fā)生了變異，其次也有可能是實(shí)驗(yàn)操作過(guò)程中的操作技術(shù)和操作條件等存在差異，KNIGHT等[27]研究也表明植物DNA含量與物種所處的海拔、緯度、溫度、降水等環(huán)境有關(guān)，所以在檢測(cè)過(guò)程中應(yīng)該充分考慮試驗(yàn)材料、試驗(yàn)條件等問(wèn)題，盡量把誤差降到最低，同時(shí)應(yīng)該注意考慮不同居群間的變異和差異，加強(qiáng)居群物種水平上的基因組大小的評(píng)估。

本研究中聚石斛（1.01 pg）和勐海石斛（1.01 pg）基因組大小相同，2種石斛雖然植株矮小，但是在花、葉、莖等方面差異極其明顯，聚石斛花為黃色，勐海石斛花朵玲瓏小巧，為白綠色；針葉石斛（1.20 pg）、鐵皮石斛（1.21 pg）、細(xì)莖石斛（1.22 pg）、玫瑰石斛（1.22 pg）基因組大小相近或相同，但是在株高、莖的類型、葉型、大小、花色等方面有較明顯的差異；束花石斛（1.30 pg）、西疇石斛（1.31 pg）基因組大小較為相近，但是束花石斛花期在9—10月，花為黃色，西疇石斛花期7月，花為白色，花色差異較大。這與THOMAS[28]和杜文文等[29]的研究結(jié)果一致，表明27種石斛屬植物中，基因組大小與植物形態(tài)沒(méi)有相關(guān)性。

石斛屬植物除了部分具有藥用價(jià)值的鐵皮石斛[30]、霍山石斛（）[31]等在藥理作用方面研究較多外，在倍性育種等方面的研究較少。葉天文等[32]在海南油茶中研究表明天然多倍體經(jīng)過(guò)自然界的長(zhǎng)期馴化，染色體組較為穩(wěn)定，特別是在偶數(shù)倍多倍體中育性正常；梁森林等[33]在四倍體枇杷中采用離體萌發(fā)法和人工雜交分析其育性表明與二倍體沒(méi)有差異。本研究中疊鞘石斛、流蘇石斛鑒定為三倍體，在黃捷[34]的研究中表明，這2種石斛自交親和，存在一定的自交可育性，而三倍體叉唇石斛、四倍體細(xì)葉石斛和單葶草石斛自交不親和，沒(méi)有自交可育性。本研究?jī)H對(duì)27種石斛進(jìn)行了倍性鑒定及基因組大小分析，基于細(xì)胞學(xué)方面的核型分析、可育性等方面有待進(jìn)一步研究。

目前，蘭科植物的細(xì)胞組學(xué)、分子生物學(xué)、雜交育種、新品種選育等的研究多集中在蝴蝶蘭屬（）等傳統(tǒng)洋蘭品種和部分國(guó)蘭種中，石斛屬植物的研究較少[35]。自小蘭嶼蝴蝶蘭（）[36]全基因組公布后，相繼又公布了鐵皮石斛[26]、深圳擬蘭（）[37]、天麻（）[38]、鼓槌石斛（）[39]的全基因組。石斛屬作為蘭科植物的一個(gè)大屬，原生種類較多，花色豐富多樣，石斛屬植物全基因組的破譯及基因組學(xué)的研究為揭示石斛屬植物的起源、進(jìn)化及培育新物種并為其分子機(jī)理提供研究基礎(chǔ)。本研究采用流式細(xì)胞術(shù)對(duì)27種石斛屬植物的倍性和基因組大小進(jìn)行研究，不僅為原生石斛的全基因組測(cè)序工作的預(yù)算評(píng)估提供基礎(chǔ)，也為該屬的細(xì)胞遺傳學(xué)、分子生物學(xué)、基因組學(xué)等提供理論指導(dǎo)，對(duì)有效開(kāi)展人工授粉雜交、染色體工程和轉(zhuǎn)基因等育種方法，培育觀賞性狀優(yōu)良、抗寒性較強(qiáng)的優(yōu)良石斛屬植物新品種具有十分重要的意義。

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Estimation Ploidy and Genome Size of 27Species by Flow Cytometry

XIONG Wenyan1,2, PU Ran1,2, LIU Yunli1,2, CHEN Junwen2,3, ZHANG Jingli1,2*

1. College of Landscape and Horticulture, Yunnan Agricultural University, Kunming, Yunnan 650201, China; 2. National-Local Joint Engineering Research Center on Gemplasm Innovation & Utilization of Chinese Medicinal Materials in Southwest China, Kunming, Yunnan 650201, China; 3. College of Agronomy and Biotechnology, Yunnan Agricultural University, Kunming, Yunnan 650201, China

is a large genus within Orchidaceae, and there are 76 species recorded in China, mainly distributed in Hainan, southwest China, and Guangdong, Guangxi.species are highly ornamental because of the wide variety, bright, colorful flowers and long flowering period. At present,plant resources in the field are facing the dilemma of extinction, self-incompatibility, rare ornamental species and lack of good breeding parents.In order to protect the existing varieties, cultivate new species and establish a gene molecular library, the nuclear suspension was prepared by MGb dissociation solution from the young leaves ofspeceis, and maize (‘B73’) and tomato () were used as internal standard. At the same time, to establish a method for determining the ploidy and genome size ofspecies based on flow cytometry, the ploidy and genome size of 27species in Orchidaceae were determined by flow cytometry.The results show that it is better differentiation by using maize as internal standard, clear and concentrated which can accurately estimate the ploidy and genome size ofspecies. Among 27species, 19 species were diploid, 5 species were triploid and 3 species were tetraploid. The 27species belong to 8 sections, including 1 species of sect., 2 species of sect., 16 species of sect., 1 species of sect., 1 species of sect., 1 species of sect., 4 species of sect.and 1 species of sect.. The estimated genome size of 27species ranged from 0.98 pg to 2.41 pg, and the estimated average genome size was 1.44 pg. The estimated genome size of 27species were all greater than 0.7 pg, mainly between 0.7–1.4 pg. The estimated genome size ofwas the largest, and that ofwas the smallest, and the difference between them was nearly 2.5 times; the genomes of 27species can be classified as minimal genome or small genome.This study provides convenience for artificial cross pollination configuration, cross breeding and polyploid induction ofspecies, lays a foundation for the establishment of gene molecular library, genetic variation, evolutionary biology and whole genome sequencing forspecies.

flow cytometry;species; ploidy; genome size

S567.239

A

10.3969/j.issn.1000-2561.2022.11.009

2022-04-01；

2022-05-08

云南省重大科技專項(xiàng)計(jì)劃項(xiàng)目（No. 202102AE090042，No. 202102AA310033，No. 2017ZF003）。

熊文艷（1996—），女，碩士研究生，研究方向：園林植物資源利用與創(chuàng)新。*通信作者（Corresponding author）：張敬麗（ZHANG Jingli），E-mail：jl200812@yeah.net。