奇蘭秋季紅茶加工過(guò)程主要生化成分變化及相關(guān)酶基因表達(dá)

劉金仙, 盧 莉, 傅仙玉, 史凌珊, 武廣珩

奇蘭秋季紅茶加工過(guò)程主要生化成分變化及相關(guān)酶基因表達(dá)

劉金仙1,2, 盧 莉1,2, 傅仙玉1,2, 史凌珊1,2, 武廣珩3*

1. 武夷學(xué)院茶與食品學(xué)院，福建武夷山 354300；2. 中國(guó)烏龍茶產(chǎn)業(yè)協(xié)同創(chuàng)新中心，福建武夷山 354300；3. 福建省生態(tài)產(chǎn)業(yè)綠色技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福建武夷山 354300

以武夷名叢奇蘭秋季鮮葉為原料，按傳統(tǒng)紅茶加工工藝制成紅茶，并探明其加工過(guò)程中主要生化成分含量、多酚氧化酶（PPO）活性及相關(guān)酶基因表達(dá)的變化規(guī)律，以期為秋季紅茶品質(zhì)改良和工藝改進(jìn)提供一定參考。結(jié)果表明：從鮮葉（XY）至發(fā)酵結(jié)束（FJ8），茶多酚、兒茶素、水浸出物、咖啡堿分別下降6.13%、15.66%、10.64%、0.10%；黃酮、茶黃素、茶紅素、茶褐素、游離氨基酸分別上升4.98 mg/g、7.45 mg/g、2.03%、5.58%、0.14%，其中咖啡堿變化幅度最小。茶黃素、茶紅素、茶褐素與兒茶素呈極顯著負(fù)相關(guān)，相關(guān)系數(shù)分別為：-0.991、-0.969、-0.972。PPO活性呈波動(dòng)變化，萎凋階段先上升后下降，揉捻時(shí)達(dá)到峰值，為458.83 U/g，約為XY的1.67倍；發(fā)酵階段快速下降，F(xiàn)J8時(shí)，PPO酶活顯著低于XY，約為XY的0.89。多酚氧化酶基因、表達(dá)變化規(guī)律一致：先上升后下降，相對(duì)表達(dá)量在萎凋15 h（WD15）最高，分別為XY的11.2、12.8倍，揉捻時(shí)開(kāi)始下降，發(fā)酵階段表達(dá)量與鮮葉無(wú)顯著差異。兒茶素類代謝相關(guān)酶基因、、、、、￠￠、、、、的表達(dá)在加工過(guò)程中均受不同程度抑制，相對(duì)表達(dá)量顯著低于XY，除與CG（兒茶素沒(méi)食子酸酯）呈負(fù)相關(guān)外，與兒茶素其他組分均呈正相關(guān)，但不顯著，相關(guān)系數(shù)在0.130～0.750之間。

秋季鮮葉；紅茶加工；生化成分；多酚氧化酶；相關(guān)酶基因

我國(guó)夏秋季雨水足、光照強(qiáng)、溫度高，茶樹(shù)生長(zhǎng)快，鮮葉產(chǎn)量高，每年產(chǎn)量可占全年鮮葉總產(chǎn)量的60%[1]。但夏秋茶受季節(jié)的影響，葉片中多酚類物質(zhì)含量較高，氨基酸、芳香類物質(zhì)等含量相對(duì)較低，用其加工烏龍茶或綠茶，苦澀感強(qiáng)、綜合品質(zhì)差、市場(chǎng)接受度低[2-3]。而茶多酚類物質(zhì)是形成紅茶茶湯紅艷明亮，滋味濃、強(qiáng)、鮮爽的重要物質(zhì)基礎(chǔ)[4]，因?yàn)榧t茶屬于全發(fā)酵茶，在其加工過(guò)程中，多酚類物質(zhì)會(huì)在多酚氧化酶和過(guò)氧化物酶的作用下生成茶黃素和茶紅素[3]。茶黃素具有辛辣和強(qiáng)烈收斂性，對(duì)紅茶滋味有極為重要的作用，影響著紅茶茶湯的濃度、強(qiáng)度和鮮爽度，尤其是強(qiáng)度和鮮爽度，茶紅素色澤棕紅，是紅茶湯色“紅”的主要成分，也是湯味濃度和強(qiáng)度的重要物質(zhì)[5-6]。為此在利用夏、秋季鮮葉加工紅茶方面，前人展開(kāi)了大量研究[7-9]，但大都集中于不同加工工藝對(duì)品質(zhì)影響，對(duì)鮮葉中主要化學(xué)成分在加工中變化缺乏系統(tǒng)性、整體性研究，特別跟品質(zhì)相關(guān)的酶活變化及關(guān)鍵酶基因的表達(dá)變化研究更是甚少。因此，本研究以武夷名叢奇蘭秋季鮮葉為原料，按傳統(tǒng)紅茶加工工藝對(duì)其進(jìn)行加工，并在各工藝點(diǎn)取樣，檢測(cè)其加工過(guò)程中主要生化成分、多酚氧化酶酶活、兒茶素類物質(zhì)代謝相關(guān)酶基因表達(dá)的動(dòng)態(tài)變化，通過(guò)數(shù)據(jù)整合分析，探討主要化學(xué)成分變化規(guī)律及相關(guān)酶基因表達(dá)規(guī)律，研究結(jié)果可為秋季紅茶品質(zhì)改良和工藝改進(jìn)提供一定參考數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

供試品種為奇蘭，種植于武夷學(xué)院茶樹(shù)種質(zhì)資源圃，采摘標(biāo)準(zhǔn)為一芽二葉，采摘、加工制作、取樣時(shí)間為2021年9月。

1.2 方法

1.2.1 紅茶樣品制備與取樣 采摘的鮮葉按傳統(tǒng)紅茶制作工藝加工，并在鮮葉（XY）、萎凋5 h （WD5）、萎凋10 h（WD10）、萎凋15 h（WD15）、揉捻（RN）、發(fā)酵4 h（FJ4）、發(fā)酵8 h（FJ8）等工藝點(diǎn)取樣，理化檢測(cè)所取樣品采用烘干固樣，兒茶素、多酚氧化酶檢測(cè)及基因表達(dá)定量分析所取樣品采用液氮固樣，固樣后置于-80℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 樣品生化成分測(cè)定 磨碎茶樣的制備參照國(guó)標(biāo)（GB/T 8303—2002）[10]；茶多酚總量測(cè)定參照國(guó)標(biāo)《茶茶多酚測(cè)定》（GB/T 8313—2008）福林酚法[11]；游離氨基酸含量測(cè)定參照國(guó)標(biāo)《茶游離氨基酸的測(cè)定》（GB/T 8314—2002）[12]；水浸出物含量測(cè)定參照國(guó)標(biāo)《茶水浸出物測(cè)定》（GB/T 8305—2002）[13]；咖啡堿測(cè)定參照國(guó)標(biāo)《茶咖啡堿測(cè)定》（GB/T 8312—2002）[14]；黃酮含量測(cè)定采用三氯化鋁比色法[15]；茶紅素、茶褐素測(cè)定參照分光光度法[16]；兒茶素、茶黃素測(cè)定采用高效液相色譜法測(cè)定，色譜條件為Agilent EC-C18，流動(dòng)相A：90 mL乙腈、20 mL乙酸、2 mL EDTA定容至1 L，過(guò)0.45 μm濾膜；流動(dòng)相B：800 mL乙腈、20 mL乙酸2 mL EDTA定容至1 L，過(guò)0.45 μm濾膜；柱溫40℃；進(jìn)樣量10 μL；流速0.8 mL/min；梯度如下：100%A—15 min 68%A，32%B—25 min 68%A，32%B—30 min 100%A；檢測(cè)波長(zhǎng)278 nm。所有生化成分均重復(fù)測(cè)定3次。

1.2.3 多酚氧化酶測(cè)定 多酚氧化酶測(cè)定采用多酚氧化酶檢測(cè)試劑盒（Solarbio），具體操作按試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行。

1.2.4 加工過(guò)程相關(guān)酶基因表達(dá)分析

（1）RNA提取及cDNA合成。使用多糖多酚植物RNA提取試劑盒（TIANGEN）提取樣品總RNA，用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)所提RNA的完整性，cDNA合成采用Go ScriptTMReverse Transcription Mix (Promega)逆轉(zhuǎn)錄試劑盒，具體使用步驟見(jiàn)說(shuō)明書。

（2）熒光定量PCR分析。以茶樹(shù)18S為內(nèi)參，檢測(cè)加工過(guò)程主要相關(guān)酶基因的表達(dá)差異性，引物參照前人研究[17-19]，具體見(jiàn)表1。SYBR Green試劑盒為SuperReal PreMix Plus (TIANGEN)，PCR儀為CFX96實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀（Bio-Rad），以XY對(duì)照，其基因的表達(dá)量定義為1個(gè)單位，采用2–DDCT法計(jì)算基因的相對(duì)表達(dá)量，每個(gè)樣品均進(jìn)行3次重復(fù)。

表1 相關(guān)酶基因熒光定量PCR引物

1.3 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)處理及分析采用Microsoft Excel 2007、DPS 7.05、SPSS 19.0等軟件進(jìn)行。

2 結(jié)果與分析

2.1 加工過(guò)程主要生化成分變化分析

2.1.1 多酚類物質(zhì)變化分析 茶葉中的多酚類物質(zhì)及其氧化產(chǎn)物有茶多酚、兒茶素、黃酮、茶黃素、茶紅素、茶褐素等。從表2可看出，隨著加工的推進(jìn)，茶多酚含量呈逐步下降趨勢(shì)，總體下降差異顯著，由XY的22.36%到FJ8的16.23%，下降了6.13%，降幅達(dá)到27.42%。

兒茶素類物質(zhì)是茶葉澀味品質(zhì)的主要呈味物質(zhì)，約占茶多酚總量的70%[20]。在奇蘭秋季紅茶加工過(guò)程中共檢測(cè)到8種兒茶素單體（表2）。從表2可知，總體含量排序?yàn)镋GCG（表沒(méi)食子兒茶素沒(méi)食子酸酯）>EGC（表沒(méi)食子兒茶素）>ECG（表兒茶素沒(méi)食子酸酯）>EC（表兒茶素）>GC（沒(méi)食子兒茶素）>C（兒茶素）>GCG（沒(méi)食子兒茶素沒(méi)食子酸酯）>CG（兒茶素沒(méi)食子酸酯）。由于各兒茶素單體參與眾多反應(yīng)，加工過(guò)程中不斷變化，除CG呈波動(dòng)上升之外，其余總體呈波動(dòng)下降趨勢(shì)，其中EGCG、EC、EGC、ECG與兒茶素總量變化趨勢(shì)相似，萎凋階段先是緩慢上升，但上升差異不顯著，萎凋后期開(kāi)始下降；另外，下降單體中除C外，其余均是在RN時(shí)出現(xiàn)急劇下降，發(fā)酵階段持續(xù)下降，這與劉亞芹等[21]、方駿婷[22]等的研究結(jié)論相似；從工序XY到RN，GC、EGCG、EC、GCG、EGC、ECG、酯型兒茶素、非酯型兒茶素及兒茶素總量降幅分別達(dá)到65.40%、51.96%、20.16%、33.61%、66.38%、21.70%、46.54%、55.65%、49.04%，至工序FJ8時(shí)，降幅分別為98.41%、92.75%、91.88%、92.62%、93.62%、83.49%、90.51%、93.82%、91.42%，非酯型兒茶素總體下降幅度大于酯型兒茶素。

黃酮是一類低分子量的多酚化合物，除了與紅茶的品質(zhì)密切相關(guān)之外，還具有抗氧化、抗炎癥、抗動(dòng)脈硬化等保健功效[23]。加工過(guò)程中黃酮的變化趨勢(shì)與茶多酚相反，總體呈不斷上升趨勢(shì)，F(xiàn)J8工序時(shí)，黃酮含量達(dá)10.45 mg/g，約為XY工序時(shí)的1.9倍，這與薄佳慧等[23]研究得出的黃酮在金花白茶加工過(guò)程總體呈上升變化的結(jié)論相近，與方駿婷[22]、張亞楠[2]等研究紅茶加工過(guò)程黃酮總體是下降的結(jié)論相反，具體原因有待進(jìn)一步探究。

表2 奇蘭秋季紅茶加工過(guò)程多酚類物質(zhì)的動(dòng)態(tài)變化

注：同列數(shù)據(jù)后不同小寫字母表示處理間差異顯著（<0.05）。

Note: Different lowercase letters after the same column of data indicate significant difference (<0.05).

茶黃素（theaflavins, TFs）、茶紅素（thearubigins, TRs）及茶褐素（theabrownins, TBs）都是茶多酚的水溶性氧化產(chǎn)物，直接影響紅茶品質(zhì)。其中TFs是影響茶湯亮度、滋味強(qiáng)度和鮮度的重要成分，由茶黃素雙沒(méi)食子酸酯（TFDG）、茶黃素-3￠-沒(méi)食子酸酯（TF-3￠-G），茶黃素（TF）、茶黃素-3-沒(méi)食子酸酯（TF-3-G）組成。從表3可知，TFDG、TF-3￠-G在鮮葉和萎凋階段并未檢測(cè)出，而TF、TF-3-G有檢測(cè)出，含量雖低，但總體呈緩慢上升趨勢(shì)；RN時(shí)TFDG、TF-3￠-G均已檢測(cè)出，含量分別為1.33 mg/g、0.35 TF mg/g，TF、TF-3-G含量開(kāi)始出現(xiàn)急劇上升；進(jìn)入發(fā)酵后4種單體含量持續(xù)上升，其中TFDG、TF-3￠-G及TF在FJ4時(shí)達(dá)到峰值，分別為2.97 mg/g、0.81 mg/g，1.22 mg/g，TF-3-G峰值出現(xiàn)在FJ8，為4.05 mg/g；茶黃素總量變化規(guī)律與TF、TF-3-G相似，先緩慢上升后急劇上升，F(xiàn)J4時(shí)茶黃素總量為9.03 mg/g，F(xiàn)J8時(shí)有所下降，但仍為XY的9.37倍，可見(jiàn)茶黃素主要是在加工中后期形成。

表3 奇蘭秋季紅茶加工過(guò)程茶黃素組分動(dòng)態(tài)變化

注：ND表示未檢測(cè)出；同列數(shù)據(jù)后不同小寫字母表示處理間差異顯著（<0.05）。

Note: ND indicates no detection; Different lowercase letters after the same column of data indicate significant difference (<0.05).

TRs是構(gòu)成茶湯“紅”的主體物質(zhì)，對(duì)茶湯滋味與湯色濃度起主要作用，TBs是造成茶湯色澤“深”的主要因素。加工過(guò)程TRs、TBs的含量變化差異顯著（圖1），TRs變化規(guī)律是先上升后下降，在FJ4時(shí)含量達(dá)到高峰，為5.56%，約為XY的1.73倍；TBs總體呈不斷上升趨勢(shì)，特別是發(fā)酵階段，總體含量要高于TRs，F(xiàn)J8時(shí)含量達(dá)7.67%，約為XY的3.78倍，比TRs高出2.43%。相關(guān)性分析得知，TFs、TRs、TBs與兒茶素呈極顯著負(fù)相關(guān)（<0.001），相關(guān)系數(shù)分別為–0.991、–0.969、–0.972，說(shuō)明兒茶素的下降與茶三素的形成高度相關(guān)。

不同小寫字母表示處理間差異顯著（P<0.05）。

2.1.2 水浸出物、咖啡堿及游離氨基酸的變化 水浸出物是茶葉中可溶于水的各種物質(zhì)的總稱，與茶湯滋味的濃強(qiáng)度有關(guān)。從圖2可看出，加工過(guò)程中水浸出物含量先上升后下降，WD15時(shí)達(dá)最高值，為48.64%，與XY相比，上升了2.72%，RN時(shí)開(kāi)始下降，F(xiàn)J8降到最低，為35.28%，相比XY，降低了13.36%。咖啡堿味苦，但會(huì)與茶多酚及其氧化物形成具有鮮爽滋味的絡(luò)合物，也是構(gòu)成茶湯滋味的重要成分。本研究加工過(guò)程咖啡堿含量雖呈“上升—下降—上升—下降”的波動(dòng)變化（圖2），但總體變化幅度不大，WD15時(shí)含量最高，為2.73%，相比XY增加了0.24%，到FJ8含量最低，為2.39%，與XY相比僅降低0.10%。游離氨基酸是茶葉鮮味的主要呈味物質(zhì)，同時(shí)也參與香氣的形成。圖2顯示氨基酸含量在萎凋階段不斷上升，在WD15時(shí)達(dá)到最高值4.93%，相比XY，增加了0.90%，RN時(shí)開(kāi)始下降，發(fā)酵階段進(jìn)一步減少，但總體含量仍比XY高，F(xiàn)J8時(shí)含量為4.17%，比XY高0.14%，總體變化規(guī)律與劉亞芹等[21]、王小云等[24]研究結(jié)論較為一致。

不同小寫字母表示處理間差異顯著（P<0.05）。

2.2 加工過(guò)程中PPO活性變化及CsPPO1、CsPPO2基因表達(dá)分析

多酚氧化酶（PPO）可將茶葉中的多酚類物質(zhì)酶促氧化成茶黃素、茶紅素等，直接影響紅茶品質(zhì)，在紅茶加工中至關(guān)重要。奇蘭秋季紅茶加工過(guò)程PPO酶活總體呈“M”型波動(dòng)變化（圖3A），與李會(huì)娟[25]研究紅茶加工過(guò)程中PPO活性變化規(guī)律較為相似。從工序XY到WD10逐步上升，WD15時(shí)有所下降，PPO酶活為319.53 U/g，揉捻時(shí)達(dá)到峰值為458.83 U/g，約為XY的1.67倍，進(jìn)入發(fā)酵后逐步下降，F(xiàn)J8時(shí)降至最低，為243.87 U/g，相比RN降幅達(dá)46.85%。結(jié)合前人研究分析，發(fā)酵階段PPO酶活之所以顯著下降，主要是因?yàn)閺孽r葉到揉捻PPO快速增加，加速了多酚類氧化產(chǎn)物的快速產(chǎn)生，而多酚類氧化產(chǎn)物與酶蛋白結(jié)合形成不溶性產(chǎn)物，抑制了PPO酶活性[2, 26]。

利用定量PCR測(cè)定了多酚氧化酶基因、在奇蘭秋季紅茶加工過(guò)程的相對(duì)表達(dá)量，發(fā)現(xiàn)、在加工過(guò)程中相對(duì)表達(dá)量變化規(guī)律一致（圖3B），先上升后下降，均在WD15時(shí)出現(xiàn)表達(dá)高峰，相對(duì)表達(dá)量分別為XY的11.2、12.8倍，揉捻時(shí)急劇下降，發(fā)酵階段持續(xù)下降，F(xiàn)J4、FJ8時(shí)、基因的相對(duì)表達(dá)量均與XY無(wú)顯著差異。另外，對(duì)比圖3A與圖3B發(fā)現(xiàn)，PPO酶活變化規(guī)律與多酚氧化酶基因、表達(dá)變化規(guī)律并未一致，PPO酶活峰值出現(xiàn)時(shí)間比、基因相對(duì)表達(dá)量峰值晚，PPO酶活峰值出現(xiàn)在RN，而基因表達(dá)出現(xiàn)在WD15。

不同小寫字母表示處理間差異顯著（P<0.05）。

2.3 加工過(guò)程兒茶素類物質(zhì)代謝相關(guān)酶基因的表達(dá)分析

作為澀味主要呈味物質(zhì)兒茶素是植物重要的次生代謝產(chǎn)物，其代謝途徑與其他植物類黃酮物質(zhì)代謝途徑基本一致，主要有莽草酸途徑、苯丙燒代謝途徑和類黃酮合成途徑，涉及的主要酶類有[27-28]：PAL（苯丙氨酸脫氨酶，phenylalanine ammonialyase）、C4H（肉桂酸羥化酶，cinnamate4-hydroxylase）、CHS（查耳酮合成酶，chalcone synthase）、CHI（查耳酮異構(gòu)酶，chalcone isomerase）、F3H（黃烷酮3-羥化酶，flavanone 3-hydroxylase）、F3￠H（黃烷酮3￠-羥化酶，flavanone 3-hydroxylase）、F3￠5￠H（黃烷酮3￠,5￠-羥化酶，flavonoid 3￠,5￠-hydroxylase）、DFR（二氫黃烷醇4-還原酶，dihydroflavonol 4-reductase）、LAR（無(wú)色花色素還原酶，leucoanthocyanidin reductase）、ANR（花青素還原酶，anthocyanidin reductase），F(xiàn)LS（黃酮醇合成酶，F(xiàn)lavonol synthase）、ANS（花青素合成酶，anthocyanidin synthase）等。眾多研究表明，植物類黃酮的生物合成積累及其相關(guān)基因的表達(dá)受到紫外線、紅光輻照、生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑等外界因素，以及低溫、病原體侵染等逆境脅迫的影響[29]。茶葉加工過(guò)程中的萎凋、揉捻、發(fā)酵等本身就是一種逆境，因此，利用qRT-PCR技術(shù)探究這幾個(gè)相關(guān)基因在加工過(guò)程的表達(dá)情況，除￠、基因未檢測(cè)出外，其他結(jié)果見(jiàn)圖4，從圖4中可知：不同基因有不同表達(dá)變化規(guī)律，其中與基因相對(duì)表達(dá)量變化規(guī)律一致，從XY到WD10，表達(dá)量持續(xù)下降，WD15時(shí)表達(dá)有所上升，RN時(shí)又下降，雖有波動(dòng)變化，但所有萎凋、揉捻、發(fā)酵環(huán)節(jié)相對(duì)表達(dá)量無(wú)顯著差異；與基因隨著加工過(guò)程推進(jìn)，相對(duì)表達(dá)量呈不斷下降變化趨勢(shì)；、、、、￠￠、基因表達(dá)變化規(guī)律相似。均為下降—上升—下降，其中、、￠￠基因在WD15時(shí)相對(duì)表達(dá)量有所上升，RN時(shí)又急劇下降；DFR是在WD10有所上升，WD15又開(kāi)始下降，但與WD10無(wú)顯著差異，RN時(shí)急劇下降，且與整個(gè)發(fā)酵階段無(wú)顯著差異；與則是在RN時(shí)有所上升，進(jìn)入發(fā)酵后又急劇下降。綜上分析可知，所有基因在萎凋、揉捻、發(fā)酵等加工環(huán)節(jié)的表達(dá)均受不同程度抑制，表達(dá)量顯著低于鮮葉XY，除了與基因在揉捻時(shí)有所上升外，其中基因的表達(dá)均是揉捻后急劇下降，說(shuō)明揉捻造成的機(jī)械損傷會(huì)強(qiáng)烈抑制這些基因的表達(dá)。

2.4 加工過(guò)程兒茶素組分與兒茶素類代謝相關(guān)酶基因表達(dá)量的相關(guān)性分析

運(yùn)用SPSS軟件分析兒茶素組分含量與相關(guān)酶基因相對(duì)表達(dá)量的相關(guān)性（表4），從表4可知，、、、、、￠￠、、、、與CG呈負(fù)相關(guān)，相關(guān)系數(shù)為–0.539～–0.280；與GC、C、EGCG、EC、GCG、EGC、ECG、總兒茶素（TCA）呈正相關(guān)，但均不顯著，相關(guān)系數(shù)在0.130～0.750之間，其中與C的相關(guān)系數(shù)值最低，為0.130～0.394；另外基因與GC、CG、EGCG、EC、GCG、EGC、ECG、TCA相關(guān)系數(shù)絕對(duì)值最大，分別為0.750、0.539、0.714、0.616、0.671、0.737、0.624、0.709，因此推測(cè)DFR是奇蘭紅茶加工中主導(dǎo)兒茶素合成的主要酶類之一。

不同小寫字母表示處理間差異顯著（P<0.05）。

表4 兒茶素組分與相關(guān)酶基因表達(dá)量的相關(guān)性分析

3 討論

3.1 奇蘭秋季紅茶加工過(guò)程主要生化成分變化

茶葉生化成分的含量是決定茶湯的滋味的物質(zhì)基礎(chǔ)，而生化成分的含量與整個(gè)加工工藝密切相關(guān)。多酚類物質(zhì)在加工時(shí)經(jīng)過(guò)酶促氧化、非酶促氧化、熱解、聚合、轉(zhuǎn)化等反應(yīng)，部分氧化成茶三素，部分多酚類及其氧化產(chǎn)物與蛋白結(jié)合產(chǎn)生不溶性化合物[30]，所以含量總體呈下降趨勢(shì)。本研究發(fā)現(xiàn)，除黃酮不斷上升和兒茶素單體CG波動(dòng)上升之外，其余總體呈下降趨勢(shì)，其中茶多酚呈不斷下降趨勢(shì)，從XY的22.36%到FJ8的16.23%，下降了6.13%。兒茶素單體EGCG、EC、EGC、ECG與及兒茶素總量變化趨勢(shì)相似，先是緩慢上升后下降，另外下降的單體中除C外，其余均是在RN時(shí)出現(xiàn)急劇下降，發(fā)酵階段持續(xù)下降，從XY到RN，GC、EGCG、EC、GCG、EGC、ECG與及兒茶素總量降幅分別達(dá)到65.40%、51.96%、20.16%、33.61%、66.38%、21.70%、46.54%、55.65%、49.04%。結(jié)合前人研究分析，可能的原因是從鮮葉到萎凋水分散失，水溶性兒茶素類物質(zhì)濃度增大，隨著萎凋的繼續(xù)，多酚氧化酶活性逐漸增強(qiáng)，兒茶素類物質(zhì)開(kāi)始氧化，揉捻時(shí)細(xì)胞遭破壞，兒茶素與氧化酶之間的隔離被打破，水解和氧化作用增強(qiáng)，因此出現(xiàn)急劇下降。TFs、TRs、TBs是兒茶素氧化而來(lái)，總體變化相似，呈上升趨勢(shì)，與兒茶素呈極顯著負(fù)相關(guān)，相關(guān)系數(shù)分別為-0.991、-0.969、-0.972?？Х葔A在整個(gè)加工過(guò)程雖呈波動(dòng)變化，但總體變化幅度不大，F(xiàn)J8含量最低，與XY相比，僅降低0.10%，這應(yīng)與其穩(wěn)定的化學(xué)性質(zhì)有關(guān)[31]。加工過(guò)程中水浸出物與氨基酸變化規(guī)律相似，萎凋階段呈上升趨勢(shì)，均在WD15時(shí)出現(xiàn)峰值，含量分別為48.64%、4.93%，揉捻開(kāi)始下降，到發(fā)酵階段持續(xù)下降。結(jié)合前人研究分析，可能的原因是萎凋失水細(xì)胞內(nèi)水解酶活性增強(qiáng)，一些不溶性物質(zhì)轉(zhuǎn)化為可溶性物質(zhì)，如低分子蛋白質(zhì)、多肽類化合物水解，所以萎凋階段水浸出物與氨基酸含量增加[32]；揉捻使細(xì)胞損傷，呼吸作用和酶促氧化作用增強(qiáng)，細(xì)胞內(nèi)可溶性物質(zhì)發(fā)生水解，所以水浸出物與氨基酸含量開(kāi)始下降；發(fā)酵階段因呼吸作用和酶促氧化作用持續(xù)，導(dǎo)致水浸出物含量持續(xù)下降，另外，雖然蛋白質(zhì)持續(xù)水解，但游離氨基酸參與脫氨、脫羧等眾多反應(yīng)，形成了相應(yīng)的醇、醛、酸等，導(dǎo)致氨基酸含量也逐步下降[21]。

3.2 加工過(guò)程PPO酶活變化及CsPPO1、CsPPO2基因表達(dá)特性

PPO以其在紅茶加工中的重要作用受到廣泛關(guān)注和研究。BOKUCHAVA[33]、竹尾忠一[34]研究發(fā)現(xiàn)，PPO活性在茶鮮葉的萎凋、揉捻工藝中逐漸增加，揉捻時(shí)酶活性高達(dá)鮮葉的2～3倍。阮宇成[35]在紅碎茶加工中PPO活性及同工酶的變化研究中，也得到了類似的結(jié)果。劉仲華等[36]研究發(fā)現(xiàn)，PPO活性隨萎凋過(guò)程中茶葉失水而提高，含水量為65%左右時(shí)活性達(dá)到頂峰，但進(jìn)一步過(guò)度萎凋使PPO活性降低。TAKEO[37]研究表明，PPO活性在揉捻時(shí)急驟增加，隨后依發(fā)酵進(jìn)程而降低，且發(fā)酵溫度越高，酶活性下降越快。筆者在奇蘭秋季紅茶加工過(guò)程中發(fā)現(xiàn)，PPO酶活呈“M”型變化趨勢(shì)，在鮮葉萎凋階段先逐步上升，萎凋后期（WD15）時(shí)下降，揉捻時(shí)急劇上升，且達(dá)到峰值，進(jìn)入發(fā)酵后又持續(xù)降低，這一結(jié)果與前人研究結(jié)果較為一致，也進(jìn)一步驗(yàn)證了前人的研究。

PPO是由多個(gè)基因編碼，具有多基因家族特性，且家族基因較為保守。筆者在奇蘭秋季紅茶加工過(guò)程中檢測(cè)了、的相對(duì)表達(dá)量，表達(dá)量均在萎凋階段逐步上升，WD15時(shí)達(dá)到峰值，表達(dá)量分別約為XY的11.2、12.8倍，進(jìn)入發(fā)酵后又逐步下降，它們表達(dá)量變化規(guī)律完全一致。李會(huì)娟[25]在“茶樹(shù)CsPRXs在干旱脅迫和紅茶加工中的表達(dá)分析”研究中也發(fā)現(xiàn)、表達(dá)量變化規(guī)律在加工過(guò)程中也一致[25]。推測(cè)其原因可能是家族基因保守，保守域在加工中發(fā)揮了相同的功能。

本研究結(jié)果分析發(fā)現(xiàn)，PPO酶活變化規(guī)律與、表達(dá)變化規(guī)律不一致，本試驗(yàn)PPO酶活測(cè)定采用的是體外提取的粗酶，粗酶是含有較多同工酶的混合酶，因此，PPO酶活不一定完全由、基因調(diào)控，所以它們變化規(guī)律不一樣應(yīng)屬正常。另外還發(fā)現(xiàn)PPO酶活峰值出現(xiàn)在RN，比、基因相對(duì)表達(dá)量峰值晚，推測(cè)其可能的原因是從基因開(kāi)始到最后表現(xiàn)出PPO酶活性中間有很多過(guò)程，如基因的翻譯，蛋白質(zhì)的修飾以及酶的活性表現(xiàn)等[38]，這些因素都有可能造成酶活性比基因表達(dá)晚的現(xiàn)象。

3.3 加工過(guò)程兒茶素類物質(zhì)代謝相關(guān)酶基因的表達(dá)及其與兒茶素組分的相關(guān)性

從本試驗(yàn)多酚類物質(zhì)變化分析可知，奇蘭秋季紅茶加工過(guò)程兒茶素組分及總兒茶素不斷發(fā)生變化，除了加工過(guò)程受各氧化酶影響外，推測(cè)還可能與兒茶素生物合成途徑上調(diào)控基因有關(guān)。從前人研究可知，植物類黃酮的生物合成積累及其相關(guān)基因的表達(dá)受到外界環(huán)境、逆境脅迫等因素影響，而茶葉加工過(guò)程中的萎凋、揉捻及發(fā)酵等過(guò)程就屬于失水、機(jī)械損傷逆境。陳靜[29]在白茶萎凋過(guò)程中發(fā)現(xiàn)、、、F3H、、、的表達(dá)與兒茶素組分單體EC、GC、EGC的積累規(guī)律基本一致，兒茶素組分與相關(guān)酶基因表達(dá)水平的相關(guān)系數(shù)為0.22～0.99，部分為顯著相關(guān)，研究認(rèn)為白茶萎凋過(guò)程中發(fā)現(xiàn)兒茶素合成途徑關(guān)鍵基因表達(dá)水平具有調(diào)控兒茶素生物合成的作用。而本研究發(fā)現(xiàn)，、、、、、￠￠、、、、基因在萎凋、揉捻、發(fā)酵等加工環(huán)節(jié)的表達(dá)均受不同程度抑制，表達(dá)量顯著低于鮮葉XY，除了與基因在揉捻時(shí)有所上升外，其余基因的相對(duì)表達(dá)均是揉捻時(shí)急劇下降，說(shuō)明機(jī)械損傷對(duì)這些基因的表達(dá)具有強(qiáng)烈的抑制作用。另外，相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)，這些基因除了與CG呈負(fù)相關(guān)外，與GC、C、EGCG、EC、GCG、EGC、ECG、總兒茶素（TCA）均呈正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)在0.130～0.750之間，但均不顯著。因此，在奇蘭秋季紅茶加工過(guò)程中，這些關(guān)鍵酶基因具有調(diào)控兒茶素生物合成的作用有待進(jìn)一步研究。

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Changes of Main Biochemical Components and Expression of Related Enzyme Genes of Qilan Autumn Black Tea During Processing

LIU Jinxian1,2, LU Li1,2, FU Xianyu1,2, SHI Lingshan1,2, WU Guangheng3*

1. College of Tea and Food Science, Wuyi University, Wuyishan, Fujian 354300, China; 2. Collaborative Innovation Center of Chinese Oolong Tea Industry, Wuyishan, Fujian 354300, China; 3. Fujian Provincial Key Laboratory of Eco-Industrial Green Technology, Wuyishan, Fujian 354300, China

In order to provide reference for the quality improvement and process improvement of black tea in autumn, the fresh leaves of tea cultivars Qilan were processed to black tea in autumn, and the change law of content of main biochemical components, polyphenol oxidase (PPO) activity, and related enzyme gene expression was analyzed during processing process. The tea polyphenols, catechins, water extracts, and caffeine decreased from fresh leaves (XY) to the end of fermentation (FJ8) by 6.13%, 15.66%, 10.64%, and 0.10% respectively, and flavonoids, theaflavins, thearubigins, theabrownins, and free amino acids increased by 4.98 mg/g, 7.45 mg/g, 2.03%, 5.58%, and 0.14% respectively, among which the change range of caffeine was the smallest. Theaflavins, thearubigins, theabrownins and catechins showed a very significant negative correlation, and the correlation coefficient was –0.991, –0.969, –0.972 respectively. PPO enzyme activity fluctuated, increased first and then decreased in the withering stage, reached a peak value of 458.83 U/g during rolling, about 1.67 times that of XY, finally decreased rapidly in the fermentation stage, which was significantly lower than that of XY, and was about 0.89 times that of XY. The expression of polyphenol oxidase genesandboth increased first and then decreased from rolling, and the highest relative expression appeared at 15 h of withering (WD15), 11.2 and 12.8 times that of XY, respectively. There was no significant difference between theexpression in fermentation stage and fresh leaves. The expression of catechins metabolism related enzyme genes,,,,,￠￠,,,, and Awas inhibited in varying degrees during processing, and significantly lower than that of XY. Except for the negative correlation with CG (Catechin Gallate), the genes were positively correlated with other components of catechins, and the correlation coefficient was 0.130–0.750.

autumn fresh leaves; black tea processing; biochemical components; polyphenol oxidase; related enzyme genes

S571.1

A

10.3969/j.issn.1000-2561.2022.11.023

2022-03-28；

2022-04-17

福建省科技創(chuàng)新平臺(tái)建設(shè)（No. 2018N2004）；福建省自然科學(xué)基金項(xiàng)目（No.2022J011200，No. 2020J01410）。

劉金仙（1981—），女，博士，副教授，研究方向：茶樹(shù)栽培與綜合利用。*通信作者（Corresponding author）：武廣珩（WU Guangheng），E-mail：wugh@wuyiu.edu.cn。