美登素衍生物DM1聚合物雜質(zhì)聚合物1的合成研究

朱陽 姚長亮 夏廣兵

（上海醫(yī)藥集團股份有限公司中央研究院 上海 201203）

DM1 是 N2′-去乙?；?-N2′-（3-巰基 -1-氧代丙基）美登素的英文簡稱。DM1是一種能夠抑制細胞分裂的微管蛋白抑制劑，其與曲妥珠單抗通過偶聯(lián)方式形成靶向抗腫瘤藥物T-DM1[1]，后者的商品名為Kadcyla，2013年2月獲得美國FDA批準，用于治療人表皮生長因子受體-2陽性的晚期乳腺癌患者。

在DM1的制備過程[2-4]中，會產(chǎn)生一種DM1聚合物“聚合物1”（圖1）。聚合物1是DM1制備過程中產(chǎn)生的雜質(zhì)，故須在DM1成品中予以嚴格控制。制備聚合物1并進行相關(guān)研究，對于選擇合適方法有效控制甚至去除此雜質(zhì)，進而提高DM1乃至T-DM1的質(zhì)量具有重要的意義。

圖1 DM1（左）和聚合物1（右）的化學結(jié)構(gòu)

有文獻[2]報告了聚合物1的制備方法：將DM1溶于由磷酸緩沖液和乙醇組成的混合液中，在2, 2'-二硫二吡啶存在的條件下使DM1發(fā)生脫氫聚合生成聚合物1，最后通過濃縮、萃取、洗滌、減壓蒸餾等，殘余物再用色譜柱分離制得純聚合物1。我們按文獻操作，發(fā)現(xiàn)收率非常低，制備困難。對此，我們通過大量實驗摸索，發(fā)現(xiàn)DM1在1, 3-二甲基-2-咪唑啉酮（1, 3-dimethyl-2-imidazolidinone, DMI）或N, N-二甲基甲酰胺（N,N-dimethylformamide, DMF）等有機溶劑中很容易發(fā)生二聚化而生成聚合物1。利用該法制備聚合物1，操作簡便且易獲得高純度的聚合物1，經(jīng)檢索未見有相似研究報告。

1 儀器與試劑

1.1 儀器

Bruker Ascend 400 MHz核磁共振波譜儀（nuclear magnetic resonance spectroscopy, NMR）（內(nèi)標：四甲基硅烷）；Agilent 1260高效液相色譜儀（high performance liquid chromatography, HPLC）等。

1.2 試劑

DM1（自制，合成路線見圖2，HPLC檢測純度＞99%）；安絲菌素P-3（ansamitocin P-3, AP3）（HPLC檢測純度＞95%)、DMI（HPLC檢測純度＞98%）等試劑均為市售分析純試劑。

圖2 DM1合成路線

2 制備方法

2.1 DM1的制備

2.1.1 DM1-2制備

在反應(yīng)瓶中加入500 mL四氫呋喃，氬氣保護下壓入300 mL 1 mol/L四氫鋁鋰的四氫呋喃溶液，冷卻至＜-45 ℃后慢慢滴加30 g無水甲醇，內(nèi)溫控制在-45 ～-35 ℃，制得LiAl(OMe)3待用。將10.0 g（15.76 mmol）AP3溶于200 mL四氫呋喃中，然后快速滴加至上述LiAl(OMe)3中，氬氣保護，于-45 ～ -35 ℃反應(yīng)1.5 h。反應(yīng)結(jié)束后，加入150 mL飽和氯化銨水溶液淬滅反應(yīng)，再加入300 mL乙酸乙酯進行萃取，分出有機相，加入無水硫酸鎂脫水干燥1 h左右。過濾，（30±5）℃下減壓蒸餾，得8.8 g（15.57 mmol）泡狀固體即DM1-2，收率98.8%。

1H-NMR（400 MHz, CDCl3）：δ 7.18（d, J=1.5 Hz,1H），6.88（d, J=1.5 Hz, 1H），6.51（s, 1H），6.49（dd,J=11、15 Hz, 1H），6.13（d, J=11 Hz, 1H），5.50（dd,J=9、15 Hz, 1H），4.40（d, 1H），4.09（m, 1H），3.96（s,3H），3.46（d, 1H），3.44 ～ 3.45（d, 2H），3.33（s, 3H），3.18（s, 3H），3.12（d, J=12 Hz, 1H），2.58（d, J=9 Hz,1H），2.28（dd, 1H），2.09（dd, 1H），1.65（s, 3H），1.54（m,1H），1.25（d, 3H），1.22（d, 2H），0.79（s, 3H）。

1H-NMR、13C-NMR和質(zhì)譜檢測均確證所得物質(zhì)為DM1-2。

2.1.2 DM1-3a制備

在反應(yīng)瓶中分別加入9.6 g（74.42 mmol）DM1-1、8.5 g（15.01 mmol）DM1-2和 130 mL DMF， 氬 氣保護下攪拌溶解?？刂茰囟龋?0 ℃，分批加入催化劑Zn(CF3SO3)2（共18 g）和N, N-二異丙基乙胺（共15 g），15 ～ 20 ℃攪拌反應(yīng)過夜。翌日，加入200 mL飽和碳酸氫鈉水溶液淬滅反應(yīng)，然后加入200 mL飽和氯化鈉水溶液，攪拌5 ～ 10 min，再用500 mL乙酸乙酯萃取共3 ～ 5次。分出并合并有機相，用500 mL水和500 mL飽和氯化鈉水溶液分別洗滌后，于（30±5）℃、0.08 MPa條件下減壓蒸餾至干，得12.5 g DM1-3a粗品。以柱層析純化，采用二氯甲烷-甲醇（20∶1）洗脫。收集產(chǎn)物流分，（30±5）℃下減壓蒸餾至干，得8.7 g（13.38 mmol）黃色固體即DM1-3a，收率89.1%。

1H-NMR（400 MHz, CDCl3）：δ 6.87（d, J=1.5 Hz,1H），6.85（d, J=1.5 Hz, 1H），6.43（dd, J=11、15 Hz,1H），6.14（d, J=11 Hz, 1H），5.52（dd, J=9、15 Hz,1H），4.94（dd, J=3、12 Hz, 1H），4.26（m, 1H），3.98（s,3H），3.69（q, 1H），3.50（d, 1H），3.49（d, 1H），3.37（s, 3H），3.23（dd, 1H），3.12（s, 3H），2.59（d, J=12 Hz, 1H），2.54（d, J=9 Hz, 1H），2.37（s, 3H），2.19（dd,J=3、14 Hz, 1H），1.67（s, 3H），1.58（d, J=13 Hz, 1H），1.38（m, 1H），1.30（d, 3H），1.27（d, 3H），1.24（d,1H），0.84（s, 3H）。

1H-NMR、13C-NMR和質(zhì)譜檢測均確證所得物質(zhì)為DM1-3a。

2.1.3 DM1-3L制備

在反應(yīng)瓶中分別加入7.5 g（11.54 mmol）DM1-3a和60 mL二氯甲烷，攪拌溶解后再依次加入7.6 g 3-（甲基二硫烷基）丙酸和8.8 g 1-（3-二甲氨基丙基）-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽，室溫攪拌反應(yīng)3.0 h。然后，依次向反應(yīng)瓶中加入60 mL pH為6的磷酸緩沖液和30 mL二氯甲烷，攪拌，分出有機相，水相用30 mL二氯甲烷萃取。合并有機相，用水洗滌2次后于（30±5）℃下減壓蒸餾至干，得10.5 g DM1-3L粗品。粗品用50 mL乙醇重結(jié)晶2次，得5.1 g（6.50 mmol）白色固體即DM1-3L，收率56.3%。

1H-NMR（400 MHz, CDCl3）：δ 6.82（d, J=1.5 Hz,1H），6.73（d, J=11 Hz, 1H），6.64（d, J=1.5 Hz, 1H），6.44（dd, J=11、15 Hz, 1H），6.30（s, 1H），5.66（dd,J=9、15 Hz, 1H），5.42（q, J=7 Hz, 1H），4.77（dd, J=3、12 Hz, 1H），4.26（m, 1H），3.98（s, 3H），3.69（d, J=12 Hz, 1H），3.46（s, 1H），3.55（d, J=9 Hz, 1H），3.35（s,3H），3.23（s, 3H），3.12（d, J=12 Hz, 1H），3.09（d,J=9 Hz, 1H），2.90（m, 2H），2.88（s, 3H），2.85（m,2H），2.60（m, 1H），2.26（s, 3H），2.17（dd, J=3、14 Hz, 1H），1.98（s, 1H），1.64（s, 3H），1.55（d, J=13 Hz, 1H），1.46（m, 1H），1.23 ～ 1.31（m, 6H），1.21（d,J=13 Hz, 1H），0.80（s, 3H）。

1H-NMR、13C-NMR和質(zhì)譜檢測均確證所得物質(zhì)為DM1-3L。

2.1.4 DM1制備

將5 g（6.37 mmol）DM1-3L粗品和5.1 g DL-二硫蘇糖醇用由120 mL乙酸乙酯和120 mL甲醇組成的混合液溶解后，加入120 mL pH為7.5的磷酸緩沖液，氬氣保護下室溫反應(yīng)3.5 h。然后，加入240 mL pH為6.0的磷酸緩沖液，用120 mL乙酸乙酯萃取，有機相用30 mL水洗滌5次，再于（30±5）℃下減壓蒸餾至干，得5.2 g DM1粗品。以柱層析純化，采用二氯甲烷-甲醇（20∶1）洗脫。收集產(chǎn)物流分，（30±5）℃下減壓蒸餾至干，得4.1 g（5.55 mmol）白色固體即DM1，收率87.1%，HPLC檢測純度＞99%。

1H-NMR（400 MHz, CDCl3）：δ 6.86（d, J=1.5 Hz,1H），6.75（d, J=11 Hz, 1H），6.69（d, J=1.5 Hz, 1H），6.46（dd, J=11、15 Hz, 1H），6.29（s, 1H），5.66（dd,J=9、15 Hz, 1H），5.45（q, J=7 Hz, 1H），4.78（dd, J=3、12 Hz, 1H），4.26（m, 1H），3.99（s, 3H），3.69（d, J=12 Hz, 1H），3.55（d, J=9 Hz, 1H），3.46（s, 1H），3.37（s,3H），3.22（s, 3H），3.12（d, J=12 Hz, 3H），3.04（d,J=9 Hz, 1H），2.86（s, 3H），2.60 ～ 2.83（m, 5H），2.19（dd,J=3、14 Hz, 1H），1.78（s, 1H），1.68（s, 3H），1.58（d,J=13 Hz, 1H），1.43 ～ 1.63（m, 1H），1.27 ～ 1.35（m,6H），1.24（d, J=13 Hz, 1H），0.81（s, 3H）。

1H-NMR、13C-NMR和質(zhì)譜檢測均確證所得物質(zhì)為DM1。

2.2 聚合物1的制備

2.2.1 方法一

將1.5 g（2.03 mmol）DM1加至由40 mL DMI和40 mL水組成的的混合液中，室溫攪拌20 h左右，至反應(yīng)液中已逐漸有白色固體析出且HPLC檢測顯示DM1完全消失止。加入200 mL水，攪拌并冷卻到0 ～ 5 ℃，1 h后過濾。濾餅用少量80%乙醇水溶液洗滌，然后真空干燥，得1.2 g（0.81 mmol）白色固體即聚合物1，收率79.8%，HPLC檢測純度＞98%。

1H-NMR（400 MHz, 二甲基亞砜 -d6）：δ 7.17（d,J=1.2 Hz, 1H），6.87（s, 1H），6.69 ～ 6.44（m, 3H），5.91（s, 1H），5.68 ～ 5.47（m, 1H），5.31（q, J=6.6 Hz, 1H），4.54（dd, J=2.5、12.0 Hz, 1H），4.08（t, J=11.8 Hz, 1H），3.94（s, 3H），3.50（d, J=9.0 Hz, 1H），3.45（d, J=12.4 Hz, 1H），3.27（s, 3H），3.18（d, J=12.5 Hz, 1H），3.10（s,3H），2.84 ～ 2.74（m, 2H），2.70（s, 3H），2.57 ～ 2.45（m,4H），2.05（d, J=12.1 Hz, 1H），1.60（s, 3H），1.46（d,J=12.9 Hz, 2H），1.27（d, J=3.4 Hz, 1H），1.18（d, J=6.8 Hz, 3H），1.13（d, J=6.3 Hz, 3H），0.79（s, 3H）。

電噴霧電離質(zhì)譜：[M+H]+計算值為1 473.53，實測值是1 473.56。

1H-NMR、13C-NMR、DEPT、COSY、HSQC、HMBC和質(zhì)譜檢測均確證所得物質(zhì)為聚合物1。

2.2.2 方法二

將100 mg（0.136 mmol）DM1加至4 mL DMF中，攪拌加熱至80 ℃反應(yīng)31 h。然后，冷卻到室溫，加入20 mL水，繼續(xù)攪拌冷卻到0 ～ 5 ℃。1 h左右后過濾，濾餅用水洗滌，得100 mg白色固體即聚合物1粗品。以1 cm×10 cm硅膠柱純化，采用二氯甲烷-甲醇（20∶1）洗脫。收集產(chǎn)物流分，于（30±5）℃、0.08 MPa條件下減壓蒸餾至干，得65 mg（0.044 mmol）白色固體即聚合物1，收率64.7%，HPLC檢測純度為95%。

3 結(jié)果與討論

本研究是在研究DM1制備過程中對DM1的聚合物雜質(zhì)聚合物1進行的合成研究。我們通過實驗摸索發(fā)現(xiàn)，DM1在DMI、DMF等有機溶劑中很容易發(fā)生二聚化而生成聚合物1，尤其是在選用市售DMI為溶劑時，經(jīng)過簡單操作，不需繁瑣的后處理或柱層析純化，即能獲得高純度的聚合物1，可直接用作DM1有關(guān)物質(zhì)質(zhì)量控制的對照品。此外，這一發(fā)現(xiàn)也提示我們，欲在DM1制備過程中有效控制甚至避免聚合物1的產(chǎn)生，必須在DM1制備過程中盡可能不使用DMI、DMF等有機溶劑，此有利于獲得高純度的DM1及其產(chǎn)業(yè)化。

致謝：感謝上海醫(yī)藥集團股份有限公司中央研究院的質(zhì)量研發(fā)團隊與所有參與此項目研究的同事們的大力支持。