AVP1參與植物生長及調控研究進展

楊文靜聶峰杰張麗劉璇鞏檑

(1.寧夏農林科學院農業(yè)生物技術研究中心，寧夏 銀川 750002；2.寧夏農業(yè)生物技術重點實驗室，寧夏 銀川 750002)

植物液泡具有多方面的作用，包括維持滲透壓、細胞質pH值和離子穩(wěn)態(tài)、保護植物抵抗環(huán)境脅迫、解毒、色素沉著和細胞信號轉導。這些作用是通過定位在液泡膜上的許多蛋白質協(xié)同作用來實現，其中的質子泵發(fā)揮了至關重要的作用。植物細胞液泡膜上能量依賴的溶質轉運由2個H+泵驅動：液泡(“V型”)H+-ATP酶(EC3.6.1.3)和H+-(焦磷酸鹽激發(fā))無機焦磷酸酶(H+-PPase：EC3.6.1.1)。其中的無機焦磷酸酶是由AVP1(Arabidopsis Vacuolar Proton-pump 1)基因編碼，其cDNA序列由Sarafian V等于1992年在擬南芥中首次完整克隆[1]。

經典研究認為，AVP1是一種進化保守的，廣泛存在于植物、原生動物、細菌以及真菌中的H+轉運酶。在液泡膜上水解焦磷酸鹽(PPi)，不僅削弱PPi濃度過高對胞質中生物大分子合成的影響，還可以用PPi水解產生的自由能催化H+由胞質向液泡的運輸，與液泡膜H+-ATPase一起建立跨液泡膜質子驅動力，為各種溶質分子(如金屬離子和糖類)的跨液泡膜主動運輸提供驅動力。

但最近也有研究表明，AVP1也可以定位于韌皮部的伴胞細胞質膜上，在H+濃度梯度存在的情況下，“反向”合成焦磷酸鹽而發(fā)揮焦磷酸鹽合成酶的作用[2]。這種焦磷酸鹽合成酶作用能夠增強光合作用、韌皮部的轉運和向庫器官的運送等促進植物生長的一系列事件。

植物的生產力在很大程度上是由同化物在生產地點和利用地點之間的分配決定的。質子泵焦磷酸酶(H+-PPase)參與植物的許多能量過程，包括一般生長和生物量積累、CO2固定、養(yǎng)分獲取和脅迫響應。

本文綜述了AVP1基因編碼蛋白在植物形態(tài)建成、響應非生物脅迫和營養(yǎng)物質積累等方面的研究結果，重點介紹了其在旱、鹽、金屬離子耐受、元素利用效率、糖代謝等過程中發(fā)揮的作用及可能的機制，以及AVP1基因的轉錄、翻譯調控方式。為AVP1基因的生理功能提供全面的梳理，也為利用基因工程技術手段利用其功能育種提供視角。

1 AVP1基因的主要功能

1.1 AVP1影響植物形態(tài)建成

在植物生長發(fā)育過程中，營養(yǎng)、生殖器官形態(tài)是否正常發(fā)育、結構有無畸變、數量多寡都是影響生物量、產量和品質的重要先決條件。許多研究都表明，AVP1能夠影響植物形態(tài)建成的多方面表現。

1.1.1 AVP1影響花粉發(fā)育

Sato M H等利用GUS-報告基因檢測系統(tǒng)，在擬南芥H+-PPase的編碼基因AVP1的調控區(qū)域分離得到1個0.4Kb僅在花粉中有活性的區(qū)域。表明AVP1基因可以組織特異性的調控H+-PPase表達，并揭示了H+-PPase在花粉成熟過程中生物學意義[3]。

1.1.2 AVP1促進胚胎發(fā)育

擬南芥H+-PPase和H+-ATPase同時敲除的突變體受精胚胎第1次分裂幾乎對稱的，而導致后續(xù)在胚胎發(fā)育的各個階段都形成了異常模式，并伴隨著子葉、根系、幼苗的發(fā)育缺陷而抑制生長[4]。

1.1.3 AVP1維持葉的形態(tài)發(fā)育

實驗證明，在擬南芥AVP1基因缺失突變體中，積累了過量的焦磷酸鹽(PPi)，植株表現出葉畸形、扁平細胞畸變、表皮缺陷、補償性細胞腫塊和葉脈畸形等葉片形態(tài)異常，進而生長遲緩[5]。而在AVP1過表達的擬南芥植株中，由于葉細胞數量增加而表現葉片數量和葉單面積增加[6]。

1.2 AVP1提高植物生物量、產量

生物量和產量是評價作物品種非常重要的性狀和考量，因此研究如何通過多種手段提高產量是育種家的關鍵課題。但常規(guī)育種工作量大、周期長，而利用基因工程技術可以精準實現對目標性狀的改良，因其目標明確、周期短被越來越多的應用于作物改良。隨之而來也有越來越多的科學家致力于發(fā)掘更多的、新的直接影響產量的主效基因，近年來發(fā)現AVP1是一個可以顯著影響生物量和產量的基因。

在小麥中發(fā)現，AVP1能夠通過優(yōu)化碳的源-庫分配而增加產量，溫室和田間的AVP1轉基因小麥也獲得了更高的籽粒產量和單株種子數，且根系生物量有所增加[7]。轉AVP1基因的大麥由于莖面積的增加而產生更大的莖生物量，更重要的是與野生型相比，單株產量更高[8]。OsSIZ1/AVP1共同過表達的棉花植株在旱地條件下比野生型纖維含量更高、產量更高[9]。

1.3 AVP1提高植物對旱、鹽的耐受

干旱是限制植物生長發(fā)育和物質積累的最重要因素之一，在全球變暖和目前農業(yè)可用水資源普遍匱乏的背景下，水資源短缺日益加劇，干旱脅迫已經成為非生物脅迫中影響植物生長的最主要因素。植物抵抗和適應干旱的途徑主要有節(jié)水保水，如植物葉片氣孔關閉和加快吸水，如降低滲透，滲透勢調節(jié)是植物抗旱性的主要機制。AVP1能夠利用水解焦磷酸產生的能量催化H+由胞質像液泡運輸形成的跨液泡膜質子驅動力為物質運輸和滲透勢調節(jié)提供了可能。

在楊樹、小麥、染色茜草、擬南芥和草坪草等多種植物中的研究都表明，AVP1過表達植株較野生型有更強的旱、鹽耐受性。過表達AVP1的甘蔗根系長而豐富，與此同時能夠承受較高的鹽和旱脅迫[10]。過表達AVP1番茄根生物量增加并將Na+隔離到液泡中而減弱Na+積累的毒性作用，從而提高了番茄的旱、鹽脅迫[11]。在大麥中鑒定到了與鹽、旱耐受相關的AVP1位點。轉AVP1基因棉花植株耐鹽性較對照顯著提高。AVP1介導的棉花抗逆性增強的分子機制可能是，過表達AVP1似乎刺激生長素的極性運輸，進而刺激根的發(fā)育，較大的根系使AVP1過表達植株在干旱和鹽堿條件下更有效地吸收水分，從而提高了抗逆性和產量；由于液泡焦磷酸酶質子泵的活性增強，生成一個高跨液泡膜質子電化學梯度，導致液泡內低水勢和更高的二次運輸活動，防止細胞質內積累有毒離子[12]。鹽脅迫下的轉AVP1基因煙草長勢更好、鮮重更大，是由于AVP1增強了液泡膜上的質子電化學梯度，避免Na+在細胞質中積累。同時，丙二醛和H2O2顯著低于野生型，表明AVP1能夠在鹽脅迫下發(fā)揮保護作用[13]。

1.4 AVP1提高重金屬元素的耐受

面對土壤中廣泛存在的重金屬污染，植物自身具備相應的機制以便在低濃度元素條件下提高利用效率,在高濃度條件下減少積累量來維持正常生長。提高一些離子轉運相關基因和蛋白的表達量就是這些機制中的一種，AVP1的跨液泡膜驅動力可以為離子轉運提供動力，可能在離子脅迫響應中發(fā)揮作用。

植物對重金屬的耐受策略之一是將重金屬隔離在液泡中，小麥中分離得到的TaVP1轉入煙草，轉基因煙草在銅脅迫下表現出更強的根系、更大的生物量、更少的葉綠素損失和更高的銅積累量[14]。基于串聯質粒標記(TMT)的蛋白質組學分析了低鎘積累量和高鎘積累量2種水稻發(fā)現25個與低鎘積累相關的蛋白，其中包括液泡H+焦磷酸酶1(OVP1)。過表達OVP1降低了水稻地上部分的鎘濃度，促進了水稻生長，表明OVP1在水稻鎘積累中發(fā)揮重要作用[15]。硼是植物必需的微量元素，具有減輕重金屬毒害的作用。硼對西瓜釩耐受性的改善作用是基于硼的內穩(wěn)態(tài)和抗氧化防御系統(tǒng)的改善，其中根細胞液泡中釩的排除量是由H+-ATPase、H+-PPase活性的提高和VHP1等基因的轉錄水平升高而驅動的[16]。

1.5 AVP1參與植物糖代謝

種子植物的發(fā)芽后生長需要特殊的代謝，如糖異生，以支持幼苗的異養(yǎng)生長，直到功能光合器官建立。但擬南芥avp1突變體在萌發(fā)后無法支持異養(yǎng)生長，與野生型相比，下胚軸伸長在黑暗中嚴重受損、焦磷酸(PPi)水平高2.5倍。因此，AVP1在植物體內的主要功能是對胞質PPi的水解，植物細胞通過消除細胞質中的PPi來優(yōu)化其代謝功能，以實現胚胎后異養(yǎng)生長[17]。

在柑橘中鑒定到3個焦磷酸酶基因CsVPP-1、CsVPP-2、CsVPP-4，且在7個柑橘品種果實中I型V-PPase基因的轉錄水平與蔗糖呈顯著正相關。過表達I型V-PPase基因顯著提高了PPase活性，降低了焦磷酸鹽含量，增加了蔗糖含量。因此，CsVPP-1和CsVPP-2在液泡中蔗糖的儲存發(fā)揮關鍵作用，不僅通過調節(jié)焦磷酸鹽穩(wěn)態(tài)，最終還通過轉錄水平與蔗糖生物合成和蔗糖轉運基因相關[18]。

植物的適應和脅迫響應依賴于源庫器官碳平衡的動態(tài)優(yōu)化。到目前為止，對如何控制速率的分子機制的研究主要集中在負責將蔗糖裝載到葉脈韌皮部篩管元件-伴生細胞復合物的糖轉運蛋白上。最近，對擬南芥的細胞類型特異性轉錄組數據分析確定了AVP1對于控制糖出口速率的調控作用[19]。

1.6 AVP1提高元素利用效率

氮(N)、磷(P)、鉀(K)等是植物生長發(fā)育所必需的營養(yǎng)物質，缺乏這些營養(yǎng)物質將會嚴重限制作物生長、坐果、果實發(fā)育及產量，生產實踐中需要定期施肥以獲得高產和防止土壤退化。但肥料的低效利用增加了成本和污染，因此深入解析高效利用肥料的品種對農業(yè)可持續(xù)發(fā)展具有重要意義。

過表達擬南芥H(+)-PPase基因的生菜對15N標記肥料的積累明顯高于對照植株，同時轉基因植株的根系生長也更旺盛[20]。番茄中過表達AVP1基因，能夠在缺磷條件下增加25%的單株可售成熟果實；且在低磷條件下，AVP1過表達番茄植株從葉片(源)到果實(庫)的磷轉運增加；溫室和大田試驗中，AVP1過表達植株的移栽成活率比對照植株高11%[21]。披堿草中鑒定到的v型H+-焦磷酸酶基因EdVP1基因，在2個小麥品種中過表達EdVP1。連續(xù)2a的試驗結果表明，EdVP1顯著提高了轉基因小麥的產量和鉀利用效率。盆栽實驗表明，轉基因植株的芽和根明顯更長，鉀離子流入和氫離子流出也更高[22]。

1.7 反向合成焦磷酸

焦磷酸酶通過水解焦磷酸鹽而部分介導植物能量分配和生長調節(jié)是已被證實的典型作用，但也有研究表明焦磷酸酶可以作為焦磷酸合酶發(fā)揮作用。

H+-PPase突變株系擬南芥液泡的向內電流明顯減少，而高表達H+-PPase的液泡中明顯增加。并且發(fā)現與反向H+轉運相關的電流振幅取決于膜電位、胞漿Pi濃度和整個液泡pH梯度的大小[23]。另一個過表達AVP1基因擬南芥擬南芥的研究發(fā)現，轉基因植株積累了更多的地上和根系生物量、韌皮部卸載和運輸能力增強。研究者認為，焦磷酸酶定位于質膜，而非液泡膜，AVP1基因過表達介導的生長增強是由于其在韌皮部伴生細胞中發(fā)揮PPi合成酶的功能[24]。

2 AVP1基因的主要調控方式

2.1 蛋白相互作用

在擬南芥中發(fā)現，14-3-3蛋白存在時，AVP1的酶活性和質子泵活性增加、在高濃度PPi條件下對AVP1提供保護、高溫條件下提高AVP1的結構穩(wěn)定性、減輕Na+對AVP1的傷害，也鑒定到了AVP1與14-3-3蛋白的結合位點[25]。AVP1作為Na+/H+交換器是維持Na+穩(wěn)態(tài)的關鍵基因，在番茄中的研究發(fā)現，鈣調蛋白SlCBL10突變體葉片Na+積累能力下降，導致從木質部上傳的Na+較低，使有毒離子到達頂端和花[26]。說明AVP1是處于下游位置作為上游調控蛋白的靶位點而發(fā)揮作用，并影響生長發(fā)育事件。

2.2 轉錄調控

在擬南芥中發(fā)現，花粉發(fā)育受到轉錄激活因子AtCAMTA1和AtCAMTA5以及AtVOZ1和AtVOZ2的調控，轉錄激活因子能夠結合在AVP1基因啟動子區(qū)一個38bp的特異的順式作用區(qū)，激活AVP1基因的表達而影響花粉發(fā)育過程[27]。

2.3 翻譯后調控

擬南芥中的研究表明，AVP1的高表達提高了焦磷酸依賴的質子泵活性、耐鹽性、根毛發(fā)育等；但在過表達AVP1的SOS1功能缺失突變體中，這些表型受到負性影響[28]。表明AVP1蛋白水平的提高需要SOS1參與，并且這種調控似乎是翻譯后的，通過計算機建模，確定了幾個可能調控亞細胞轉運和活性的磷酸化、泛素化和素泛素化靶位點。

3 展望

AVP1基因編碼的無機焦磷酸酶是一種廣泛存在于動物、植物和原生動物的獨特H+轉運酶。在液泡膜上，H+-PPase能將PPi水解為2個Pi，不僅削弱PPi濃度過高對胞質中生物大分子合成的影響，還可以用PPi水解產生的自由能，催化H+由胞質向液泡的運輸，與液泡膜H+-ATPase一起建立跨液泡膜質子驅動力，為各種溶質分子(如陽離子、元素、糖類等)的跨液泡膜主動運輸提供驅動力。焦磷酸酶以經典水解焦磷酸和“反向”合成焦磷酸功能在植物形態(tài)建成、糖積累、元素利用效率、產量及旱、鹽、金屬離子脅迫等過程中發(fā)揮積極作用。其表達和功能發(fā)揮已發(fā)現可通過蛋白相互作用、轉錄調控和翻譯后調控等方式，對于基因的開發(fā)利用具有一定的借鑒意義。

雖然在多種植物中都證明了焦磷酸酶對于生長發(fā)育的關鍵作用，但其具體機制和參與的信號通路沒有完善，一定程度上影響了焦磷酸酶基因的利用。如，經典的水解焦磷酸功能和“反向”合成焦磷酸功能分別觸發(fā)的具體調控通路，水解與合成的觸發(fā)機制，以及水解-合成的穩(wěn)態(tài)維持策略。這些問題還有待研究者深入研究以完善焦磷酸酶調控機制的理論，從而為在植物中通過生物技術手段利用焦磷酸酶基因提供理論支撐。