融合多種技術(shù)的隱色孔雀石綠印跡傳感器的制備及其應(yīng)用

秦麗，李東東，田景升，韓俊華，張寅，李建文，高文惠

（1 河北科技大學(xué)食品與生物學(xué)院，河北 石家莊 050000；2 石家莊市食品藥品檢驗(yàn)中心，河北 石家莊 050011）

孔雀石綠（malachite green，MG）屬于人工合成的三苯甲烷類有機(jī)化合物，針對(duì)魚體水霉病和魚卵的水霉病有特效[1]。然而MG 及其代謝物的高殘留現(xiàn)象和“三致”等毒副作用也已被公開報(bào)道[2-3]。我國農(nóng)業(yè)部第235號(hào)公告明確規(guī)定孔雀石綠禁用于所有食品動(dòng)物中，所有可食組織中不得檢出。但因?yàn)槭袌?chǎng)上暫時(shí)缺少針對(duì)水霉病治療的特效藥，許多不法商家為了保證利益不惜鋌而走險(xiǎn)，使得MG的違規(guī)使用屢禁不止。MG經(jīng)魚體等迅速代謝后，以毒性更強(qiáng)的隱色孔雀石綠（leuco malachite green，LMG）貯藏在肌肉組織中，食用后可對(duì)人類的生命健康造成嚴(yán)重傷害[4]。因此，為了加大食品安全監(jiān)測(cè)力度，保障消費(fèi)者飲食安全，研發(fā)高效快速、靈敏且抗干擾能力強(qiáng)的檢測(cè)LMG 的方法是一項(xiàng)迫切任務(wù)。

國內(nèi)外用于MG及LMG的檢測(cè)方法主要有高效液相色譜法[5-7]、液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[8-10]和免疫法等[11-13]。其中色譜法存在儀器昂貴、前處理復(fù)雜耗時(shí)長(zhǎng)、難以實(shí)現(xiàn)快速檢測(cè)等不足；免疫法存在不耐酸堿、易失活、結(jié)果可能出現(xiàn)假陽性等缺點(diǎn)。鑒于水產(chǎn)品樣品中基質(zhì)復(fù)雜，含有較多的干擾物質(zhì)，需要選擇性更強(qiáng)、穩(wěn)定性更好的快速檢測(cè)方法，而性能優(yōu)越的分子印跡電化學(xué)傳感器（molecularly imprinted electrochemical sensor，MIECS）可滿足要求。

近年來，分子印跡技術(shù)與電化學(xué)分析技術(shù)相結(jié)合，彌補(bǔ)了色譜技術(shù)的不足，不僅樣品前處理得到簡(jiǎn)化，檢測(cè)時(shí)間短，操作簡(jiǎn)單，而且可以特異識(shí)別目標(biāo)物質(zhì)，靈敏度高，它的應(yīng)用降低了食品復(fù)雜基質(zhì)對(duì)檢測(cè)結(jié)果的影響[14]；自組裝技術(shù)（selfassembled technology，SAT）的引入為增加分子印跡膜（molecularly imprinted membrane，MIM）上有效識(shí)別位點(diǎn)帶來了新的思路，模板分子與功能單體間的自組裝賦予了印跡膜一定的有序性，增加了有效印跡位點(diǎn)的數(shù)量[15]；紫外光譜法與計(jì)算機(jī)模擬技術(shù)的應(yīng)用極大地簡(jiǎn)化了篩選功能單體的工作，其中，通過計(jì)算機(jī)模擬技術(shù)優(yōu)化分子構(gòu)型及其預(yù)組裝體系，使得模板分子與功能單體之間的作用形式與作用機(jī)理能更清晰、更直觀地呈現(xiàn)[16]；結(jié)合紫外光譜法測(cè)定其吸光度及最大吸收波長(zhǎng)，進(jìn)一步確定功能單體以及模板分子與功能單體之間的作用形式及比例[17]。因此，SAT、計(jì)算機(jī)模擬技術(shù)和紫外光譜法的引入可為分子印跡聚合物（molecularly imprinted polymer，MIP）的制備和應(yīng)用提供理論指導(dǎo)，將MIP對(duì)目標(biāo)物質(zhì)特異性識(shí)別的特點(diǎn)與電化學(xué)分析快速檢測(cè)的優(yōu)勢(shì)相結(jié)合可研制出LMGMIECS，以實(shí)現(xiàn)對(duì)水產(chǎn)品中LMG 的高效快速檢測(cè)，有效監(jiān)控水產(chǎn)品的質(zhì)量安全。

目前，融合上述多種技術(shù)檢測(cè)水產(chǎn)品中LMG的方法尚未見報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)以LMG 為模板分子，擬以帶巰基及活性基團(tuán)的苯環(huán)結(jié)構(gòu)化合物為功能單體，采用計(jì)算機(jī)模擬技術(shù)、電化學(xué)和紫外光譜技術(shù)對(duì)模板分子和功能單體的預(yù)組裝體系進(jìn)行分析并優(yōu)化制備條件。采用還原氧化石墨烯（reduced graphene oxide，RGO） 和 納 米 金 粒 子（Au-nanoparticles，AuNPs）層層修飾玻碳電極，使用SAT 使模板分子與功能單體形成有序自組裝膜，通過電聚合法制備LMG 分子印跡電化學(xué)傳感器。通過循環(huán)伏安法（cyclic voltammetry，CV）和方波伏安法（square wave voltammetry，SWV）考察該傳感器的電化學(xué)性能，并將其應(yīng)用于實(shí)際樣品的快速檢測(cè)中。

1 實(shí)驗(yàn)材料和方法

1.1 材料與試劑

CHI660E 型電化學(xué)工作站，三電極系統(tǒng)[玻碳電極（glassy carbon electrode，GCE），Ag/AgCl 參比電極，鉑絲電極]，上海辰華儀器有限公司；S-4800-1 掃描電鏡，日本HITACHI；ALPHAⅡ紅外光譜儀，德國布魯克公司。

LMG （98%），MG （98%） 4-氨基苯硫酚（4-aminothiophenol， 4-ATP， 99%）， 結(jié) 晶 紫（98%），氯霉素（98%），喹乙醇（98%），4-羥基苯硫酚（4-mercaptophenol，4-MAP），硫代雙苯硫酚（4, 4'-thiobisbenzenethiol， TBBT）， 殼 聚 糖（chitosan，CS，脫乙酰度≥95%），RGO（98%），阿拉丁試劑有限公司；氯金酸（含金量47.3%），南京試劑廠；其余試劑均為分析純；實(shí)驗(yàn)用水為超純水。實(shí)驗(yàn)樣品：草魚、小龍蝦、海帶（均購于市場(chǎng)）。

1.2 計(jì)算機(jī)模擬分析

1.2.1 計(jì)算平臺(tái)

計(jì)算軟件：Gaussian 09，Gauss View 6.0。

計(jì)算硬件：PC計(jì)算機(jī)，12GB運(yùn)行內(nèi)存，2T硬盤，Windows操作系統(tǒng)。

1.2.2 計(jì)算方法

（1）應(yīng)用Gauss View 軟件建立模板分子LMG與功能單體4-ATP的幾何構(gòu)型。

（2）利用Gaussian 09 軟件，采用密度泛函理論（density functional theory，DFT）M06-2X[18-19]方法，在6-311+G(d,p)基組條件下，優(yōu)化LMG 與4-ATP的分子構(gòu)型，并進(jìn)行頻率分析，獲取熱力學(xué)數(shù)據(jù)；對(duì)各種分子進(jìn)行紅外光譜分析，以證實(shí)分子構(gòu)型無虛頻且穩(wěn)定。

（3）采用M06-2X/6-311+G(d,p)算法并加入色散校正項(xiàng)對(duì)LMG 與4-ATP 不同比例的復(fù)合物模型進(jìn)行優(yōu)化并計(jì)算其振動(dòng)頻率，獲取熱力學(xué)數(shù)據(jù)。通過計(jì)算所有復(fù)合物的結(jié)合能大小，分析作用機(jī)理。計(jì)算結(jié)合能時(shí)， 基組迭加誤差（basis set superposition error，BSSE）采用目前使用最廣泛的Boys和Bernardi提出的counterpoise方法[20]消除。

結(jié)合能ΔE的計(jì)算如式(1)所示，校正后能量CΔE計(jì)算如式(2)。

式中，Ecomplex為復(fù)合物能量；Etemplate為模板分子能量；ΣEmonomer為功能單體總能量；EBSSE為BSSE 校正能。

1.3 AuNPs/RGO/GCE制備

取0.02g RGO 加入10mL DMF，經(jīng)攪拌、超聲分散后得2g/L RGO-DMF分散液，并將其與相同體積的CS-1% CH3COOH 溶液混合，得到RGO 修飾劑。將其滴涂于GCE表面，烘干后得修飾電極RGO/GCE。將RGO/GCE置于含有0.6g/L HAuCl4·4H2O的0.1mol/L H2SO4沉積液中，采用計(jì)時(shí)電流法在-0.2V下沉積600s，使RGO/GCE 表面通過電沉積的方式將AuNPs 修飾在RGO/GCE 表面制成金基底，得到沉積電極AuNPs/RGO/GCE。

1.4 MIP/AuNPs/RGO/GCE制備

1.4.1 功能單體的自組裝

將AuNPs/RGO/GCE 浸于10mmol/L 4-ATP 乙腈溶液中，室溫下自組裝20h，使功能單體4-ATP與金基底之間充分形成金硫鍵，讓4-ATP 盡可能多地占據(jù)金基底表面；然后將電極移至5mmol/L LMG乙腈溶液中浸泡5h，使得電極表面的4-ATP 與LMG之間充分產(chǎn)生π-π作用。

1.4.2分子印跡電極的制備

將已自組裝的電極置于聚合液中，采用CV 在0～2.2V 電位范圍內(nèi)進(jìn)行電聚合，得到一層致密且絕緣的聚合物膜，將已聚合完成的電極浸入乙醇-0.4mol/L NaOH 水溶液（3∶1，體積比）中洗脫50min，用水反復(fù)沖洗，得到MIP/AuNPs/RGO/GCE。

1.5 樣品處理

稱取搗碎后樣品（草魚、小龍蝦、海帶）2.00g 置于50mL 離心管中，加入10mL 乙腈溶液，振蕩、超聲、離心（6000r/min、10min）；取上清液，再次加入5mL 乙腈二次提??；合并兩次上清液，用乙腈定容至20mL，待測(cè)。

1.6 電化學(xué)測(cè)量方法

電化學(xué)測(cè)量的設(shè)定參數(shù)如下：CV，掃描電位為-0.2～0.8V，掃描速率為50mV/s；SWV，起止電位為-0.1～0.6V，電位增量0.005V，脈沖幅度0.025V，頻率5Hz。

2 結(jié)果與討論

2.1 AuNPs/RGO/GCE的形貌表征

采用掃描電鏡對(duì)AuNPs/RGO/GCE 的形貌進(jìn)行表征[圖1(a)]，由圖1(a)可見大量粒徑為60～80nm的AuNPs 顆粒較均勻分布在RGO 表面，這種結(jié)構(gòu)能顯著增大電極的比表面積。此外，通過X射線能量色散譜分析方法[圖1(b)]進(jìn)一步證明了Au元素在GCE 上的存在，由此表明已成功制備AuNPs/RGO/GCE。

圖1 AuNPs/RGO/GCE的掃描電鏡圖(a)和能譜圖(b)

2.2 紅外光譜表征

利用紅外光譜對(duì)LMG、洗脫LMG 前MIP、非印跡聚合物（non-imprintedpolymer，NIP）及洗脫LMG后的MIP的化學(xué)結(jié)構(gòu)進(jìn)行表征（圖2）。圖2(b)中，1515cm-1、1610cm-1為模板分子LMG 中芳環(huán)雙鍵伸縮振動(dòng)吸收峰，1349cm-1為L(zhǎng)MG 中芳叔胺的伸縮振動(dòng)，2883cm-1為L(zhǎng)MG 中—CH3的伸縮振動(dòng)；圖2(b)為L(zhǎng)MG 洗脫前的MIP，圖2(a)、(b)的對(duì)比證明了洗脫LMG 前MIP 中LMG 的存在；圖2(c)、(d)中，可看出LMG的芳環(huán)、氨基、—CH3的吸收峰明顯減弱，洗脫LMG后的MIP與NIP的吸收特征峰曲線幾乎一致，說明在自組裝和電聚合過程中結(jié)合在MIP的LMG被大部分洗脫下來，在MIP中留下了與LMG 形狀、大小完全匹配的空穴，可實(shí)現(xiàn)對(duì)模板分子LMG的特異性吸附。

圖2 紅外光譜圖

2.3 LMG-MIECS電化學(xué)性能

采用CV表征修飾電極的修飾效果及LMG印跡傳感器的印跡效果。由圖3(a)中曲線g 可以看出探針離子在裸電極表面上發(fā)生了氧化還原反應(yīng)，形成了對(duì)稱且可逆的氧化還原峰；當(dāng)電極經(jīng)RGO 修飾后[圖3(a)曲線f]，其峰電流值明顯高于裸電極，這是由于RGO 有效地提高了電子的轉(zhuǎn)移速率；在RGO 表面沉積一層納米金后峰電流進(jìn)一步增加，同時(shí)在0.2V附近出現(xiàn)了金的特征還原峰，如圖3(a)中曲線e所示，說明AuNPs的修飾明顯提高了電極的靈敏度。當(dāng)修飾電極完成自組裝后，氧化峰電流明顯下降[圖3(a)曲線c]。修飾電極經(jīng)電聚合后[圖3(a)曲線b]響應(yīng)電流值幾乎為0，表明此時(shí)電極表面形成了致密且?guī)缀醪粚?dǎo)電的MIM。經(jīng)洗脫模板分子后的印跡電極[圖3(a)曲線a]由于洗脫劑破壞了功能單體與模板分子之間的作用力，使模板分子脫附下來，形成與模板分子空間結(jié)構(gòu)相吻合的三維印跡空穴，探針離子通過印跡空穴在電極表面實(shí)現(xiàn)電子轉(zhuǎn)移。此外，實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步采取SWV 對(duì)結(jié)果進(jìn)行了驗(yàn)證，通過比較圖3(a)、(b)可以看出兩種表征方法效果一致。結(jié)果表明LMG 印跡傳感器已被成功制備并具有良好的修飾效果和印跡效果。

圖3 MIECS修飾效果和印跡效果表征

2.4 功能單體的選擇及計(jì)算機(jī)模擬預(yù)組裝體系分析

2.4.1 功能單體的設(shè)計(jì)

依據(jù)自組裝技術(shù)，通過對(duì)工作電極外層修飾材料性質(zhì)以及LMG 的結(jié)構(gòu)及其所含官能團(tuán)[圖4(a)]進(jìn)行分析，選取最佳功能單體，設(shè)計(jì)LMG-MIECS。與功能單體相連的外層修飾材料是經(jīng)AuNPs 修飾后的金粒子基底，因此功能單體的首端基團(tuán)可使用巰基等可與金基底形成穩(wěn)定Au—S鍵的官能團(tuán)。功能單體與修飾層間形成穩(wěn)固的共價(jià)鍵，能提高印跡位點(diǎn)與MIM 的穩(wěn)定性。LMG 分子結(jié)構(gòu)中帶有三個(gè)苯環(huán)，其環(huán)結(jié)構(gòu)與π鍵特性較為明顯，因此考慮選用帶有苯環(huán)的功能單體，可與LMG 通過苯環(huán)之間的π-π 作用相結(jié)合，并且苯環(huán)的堆疊增大了分子間的摩擦力，有利于增加功能單體間的緊密程度，減少M(fèi)IM 結(jié)構(gòu)松散等問題。經(jīng)考察，4-ATP、4-MAP、TBBT 基本滿足設(shè)計(jì)要求，其結(jié)構(gòu)式如圖4(b)～(d)所示。

圖4 模板分子與功能單體結(jié)構(gòu)式

2.4.2 紫外光譜法篩選功能單體

選擇合適的功能單體在MIECS 的制備過程中起著非常重要的作用，然而大多數(shù)模板分子結(jié)構(gòu)較為復(fù)雜，酸性、堿性等多種性質(zhì)差異較大的基團(tuán)往往共存于同一分子結(jié)構(gòu)中，同時(shí)由于空間位阻對(duì)分子間穩(wěn)定結(jié)合的阻礙，導(dǎo)致難以單純依靠經(jīng)驗(yàn)篩選出最佳功能單體以及對(duì)模板分子與功能單體的配比進(jìn)行判斷。電化學(xué)法作為傳統(tǒng)篩選功能單體的方法，工作量較大且耗時(shí)較長(zhǎng)。然而，紫外光譜法可以克服上述缺點(diǎn)，能簡(jiǎn)單準(zhǔn)確地篩選功能單體及其與模板分子的配比[21-22]。在紫外光譜理論中，當(dāng)兩種物質(zhì)不發(fā)生作用時(shí)，該兩種物質(zhì)混合物的吸光度在任意波長(zhǎng)下應(yīng)為兩者吸光度數(shù)值的加和，此數(shù)值被稱為吸光度的理論值[23]。然而分子之間受共軛效應(yīng)、氫鍵等相互作用的影響，會(huì)使混合物吸光度的大小偏離理論值，即實(shí)際測(cè)量值與理論值之間會(huì)產(chǎn)生一定差異。當(dāng)吸光度的理論值與實(shí)際值之間差值越大，表明兩者之間的相互作用力越強(qiáng)[17]。

實(shí)驗(yàn)初步對(duì)4-ATP、TBBT、4-MAP 三種常見功能單體進(jìn)行篩選，如圖5所示。在最大吸收波長(zhǎng)下，三種功能單體和LMG 作用的實(shí)際吸光值與理論吸光值之差分別為0.6580、0.4258 及0.4781，由此可知LMG 與4-ATP 之間的相互作用力最大。因此確定最佳功能單體為4-ATP。

圖5 模板分子與功能單體紫外光譜曲線

2.4.3 分子構(gòu)型優(yōu)化及紅外光譜分析

根據(jù)ChemFinder 檢索得到模板分子與所選功能單體的結(jié)構(gòu)式，用Gauss View 6.0 軟件分別構(gòu)造各分子初始模型，使用Gaussian 09 軟件在M06-2X/6-311+G(d,p)水平下優(yōu)化分子構(gòu)型，并對(duì)振動(dòng)頻率進(jìn)行計(jì)算，優(yōu)化后的各分子構(gòu)型如圖6所示。

圖6 分子構(gòu)型優(yōu)化

通過對(duì)優(yōu)化后的分子進(jìn)行紅外光譜分析，如圖7所示，可明顯看出模板分子與功能單體的振動(dòng)頻率。LMG 與4-ATP 的最低頻率分別為23.93cm-1和117.19cm-1，在所有模式下的振動(dòng)頻率均為正值，未出現(xiàn)虛頻現(xiàn)象，說明在該計(jì)算方法下所有構(gòu)型均得到收斂。

圖7 LMG和4-ATP的紅外光譜圖

2.4.4 計(jì)算機(jī)模擬分析預(yù)組裝體系結(jié)合能

通過構(gòu)建LMG 與4-ATP 比例為1∶1、1∶2 及1∶3 的復(fù)合物模型，優(yōu)化不同比例下復(fù)合物的構(gòu)型，優(yōu)化后的各比例下最優(yōu)構(gòu)型如圖8所示。對(duì)比不同比例復(fù)合物優(yōu)化后的結(jié)果，可見LMG-2(4-ATP)型復(fù)合物在空間構(gòu)型上較為規(guī)則、緊密，如圖8(b)所示。2 個(gè)4-ATP 分子通過苯環(huán)間的共軛效應(yīng)緊密結(jié)合在LMG 分子上，空間上的緊密性確保了所形成的印跡“空穴”在大小和形狀上與LMG互補(bǔ)，更好地顯示其特異性；并且2個(gè)4-ATP分子上的巰基均在LMG 分子的同一側(cè)，在空間上更方便與AuNPs 成鍵，使得自組裝的有序性更為明顯，與紫外光譜法篩選功能單體的結(jié)果一致。當(dāng)繼續(xù)增加功能單體數(shù)量時(shí)，如圖8(c)所示，所增加的4-ATP在空間上未與LMG上的苯環(huán)產(chǎn)生共軛作用。

圖8 不同比例模板分子與功能單體的復(fù)合構(gòu)型優(yōu)化

LMG與4-ATP不同比例復(fù)合物的結(jié)合能如表1所示。結(jié)果表明，復(fù)合物中4-ATP 數(shù)量增加時(shí)，所釋放的熱量隨之增加。形成LMG-2(4-ATP)型復(fù)合物所釋放的熱量與形成LMG-(4-ATP)型復(fù)合物所釋放的熱量相比增加了57.459kJ/mol，形成LMG-3(4-ATP)型復(fù)合物時(shí)釋放出的熱量比上一級(jí)僅增長(zhǎng)了16.223kJ/mol，遠(yuǎn)小于之前的增幅，說明LMG 與4-ATP 形成LMG-2(4-ATP)型復(fù)合物時(shí)，LMG 上所結(jié)合4-ATP 的能力達(dá)到飽和，因此主要形成了LMG-2(4-ATP)型復(fù)合物且該復(fù)合物空間構(gòu)型穩(wěn)定。

表1 不同比例模板分子與功能單體復(fù)合物的能量和結(jié)合能

2.5 實(shí)驗(yàn)條件的優(yōu)化

2.5.1 自組裝時(shí)間的優(yōu)化

實(shí)驗(yàn)對(duì)功能單體與金基底通過自組裝形成金硫鍵至飽和的時(shí)間進(jìn)行了探究，實(shí)驗(yàn)從16h起每隔2h對(duì)自組裝電極進(jìn)行一次CV 表征，如圖9 所示。隨著自組裝時(shí)間增加，金的特征還原峰逐漸減弱，當(dāng)自組裝時(shí)間達(dá)20h 時(shí)，金的特征還原峰基本消失，說明此時(shí)功能單體與金基底之間的結(jié)合已達(dá)飽和狀態(tài)，因此選取最佳自組裝時(shí)間為20h。

圖9 自組裝時(shí)間的優(yōu)化

2.5.2 聚合體系中模板分子與功能單體物質(zhì)的量濃度比的確定

在MIM 聚合過程中，功能單體的用量會(huì)影響MIECS的靈敏性和穩(wěn)定性。一方面，如果功能單體數(shù)量過少，會(huì)延長(zhǎng)MIM 的形成時(shí)間，阻礙模板分子與功能單體之間的結(jié)合，從而會(huì)降低印跡位點(diǎn)的數(shù)量和MIECS 的靈敏性。另一方面，過多的功能單體會(huì)導(dǎo)致功能單體自身產(chǎn)生締合現(xiàn)象，使特異性識(shí)別位點(diǎn)減少，降低選擇性[24]。

實(shí)驗(yàn)采用紫外光譜法對(duì)聚合體系中模板分子與功能單體的配比進(jìn)行了優(yōu)化，如圖10(a)所示。以不同物質(zhì)的量比混合體系的紫外光譜最大吸收為縱坐標(biāo)，最大吸收波長(zhǎng)為橫坐標(biāo)作圖，如圖10(b)所示?？芍?1∶1)～(1∶4)的比例范圍內(nèi)混合體系的紫外吸光度呈上升趨勢(shì)，且最大吸收波長(zhǎng)發(fā)生了明顯藍(lán)移，說明在(1∶1)～(1∶4)的物質(zhì)的量比內(nèi)，隨著4-ATP 比例的增大，LMG 與4-ATP 之間形成的共軛效應(yīng)逐漸增強(qiáng)，進(jìn)一步驗(yàn)證了計(jì)算機(jī)模擬對(duì)LMG 與4-ATP 之間預(yù)組裝體系結(jié)合能的理論計(jì)算結(jié)果。當(dāng)混合體系物質(zhì)的量比在(1∶4)～(1∶8)的范圍內(nèi)又產(chǎn)生了紅移現(xiàn)象，說明繼續(xù)增大功能單體的比例會(huì)使功能單體之間發(fā)生自聚，使得功能單體之間出現(xiàn)締合現(xiàn)象，會(huì)減少印跡位點(diǎn)的生成，降低靈敏度。因此確定聚合體系中LMG 與4-ATP 的最佳物質(zhì)的量比為1∶4。

圖10 紫外光譜法優(yōu)化聚合體系配比

2.5.3 聚合圈數(shù)的優(yōu)化

實(shí)驗(yàn)采用CV 進(jìn)行電聚合，該方法形成的MIM表面致密均勻且可通過改變聚合圈數(shù)對(duì)MIM 的厚度進(jìn)行控制。由圖11可知，隨著聚合圈數(shù)的增加，電極的響應(yīng)峰電流值不斷減??；當(dāng)掃描20 圈時(shí)，響應(yīng)值趨近于0；而聚合超過20 圈的MIM 在洗脫模板分子后仍存在不同程度的模板分子被包埋的現(xiàn)象，使形成的印跡空穴相對(duì)較少，導(dǎo)致洗脫后的MIM 在表征溶液中的響應(yīng)峰電流下降。因此，實(shí)驗(yàn)確定最佳聚合圈數(shù)為20圈。

圖11 聚合圈數(shù)的優(yōu)化曲線

2.5.4 洗脫條件的優(yōu)化

對(duì)MIM 進(jìn)行模板分子洗脫時(shí)發(fā)現(xiàn)，通過在乙醇、甲醇等極性溶液中浸泡的方式洗脫，效果不理想。因此，通過在洗脫劑中加入酸、堿的方式增大洗脫劑極性從而加大洗脫劑對(duì)模板分子與功能單體間作用力的破壞程度。但使用酸性洗脫劑洗脫時(shí)發(fā)現(xiàn)MIM有破裂現(xiàn)象，是因?yàn)镽GO修飾層中的CS溶于弱酸，使得RGO 修飾層被破壞。因此選擇在甲醇、乙醇、乙腈中添加NaOH 制成堿性洗脫劑對(duì)MIM進(jìn)行洗脫，結(jié)果表明，乙醇-0.4mol/L的NaOH水溶液（3∶1，體積比）作為洗脫劑時(shí)，具有良好的洗脫效果，而其他條件下洗脫效果均不佳。

實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步優(yōu)化了洗脫時(shí)間，將印跡電極置于洗脫劑中進(jìn)行攪拌洗脫，每5min 取出電極，用水沖洗，氮?dú)獯蹈?，采用SWV 進(jìn)行表征，結(jié)果如圖12所示。當(dāng)洗脫50min時(shí)峰電流達(dá)到最大，之后逐漸趨于平穩(wěn)，說明50min 時(shí)MIM 上的LMG 最大程度上被去除。綜上確定洗脫時(shí)間為50min。

圖12 模板分子洗脫時(shí)間優(yōu)化曲線

2.6 選擇性

選取與模板分子LMG結(jié)構(gòu)類似的MG和結(jié)晶紫作為結(jié)構(gòu)類似物，干擾物質(zhì)選用可能用于治療水產(chǎn)品疾病的藥物氯霉素和喹乙醇，將印跡傳感器分別在1μmol/L的五種藥品的標(biāo)準(zhǔn)溶液中吸附相同的時(shí)間，通過SWV 考察吸附前后的響應(yīng)峰電流變化（ΔI）以研究傳感器的選擇性，結(jié)果如圖13 所示。由圖13 可見，該傳感器對(duì)LMG 吸附能力最強(qiáng)，對(duì)MG 的吸附能力稍低，對(duì)結(jié)晶紫的吸附能力較小，而對(duì)干擾物質(zhì)幾乎無響應(yīng)。結(jié)果表明該MIECS 具有良好的選擇性。

圖13 印跡電極的選擇性

2.7 線性關(guān)系與檢出限

配制濃度為1.0×10-4～1.0×10-11mol/L 的LMG 標(biāo)準(zhǔn)溶液，將印跡電極浸泡到空白溶液及上述不同濃度的LMG 標(biāo)準(zhǔn)溶液中吸附相同時(shí)間，分別測(cè)定吸附后電極的SWV 響應(yīng)曲線，以不同濃度LMG 標(biāo)準(zhǔn)溶液對(duì)應(yīng)的-lgC為橫坐標(biāo)，ΔI為縱坐標(biāo)作圖。通過圖14 可以看出，LMG 在3.3×10-11～1.0×10-6mol/L濃度范圍內(nèi)與ΔI呈良好線性關(guān)系，線性方程為ΔI=0.8004lgC+15.1457，線性相關(guān)系數(shù)R2=0.9914，以S/N=3確定LMG的檢出限為1.0×10-11mol/L。

圖14 線性關(guān)系曲線

2.8 回收率與精密度

在最佳實(shí)驗(yàn)條件下，按1.5 節(jié)方法處理的水產(chǎn)樣品（草魚、小龍蝦、海帶）在1.0×10-9mol/L、1.0×10-8mol/L 和1.0×10-7mol/L 加標(biāo)水平下進(jìn)行回收率實(shí)驗(yàn)，結(jié)果如表2所示。樣品加標(biāo)平均回收率為85.5%～101.2%，RSD為1.28%～2.48%（n=5）。結(jié)果表明該MIECS的測(cè)定結(jié)果準(zhǔn)確可靠。

表2 水產(chǎn)樣品的加標(biāo)回收率和精密度（n=5）

2.9 重現(xiàn)性與穩(wěn)定性

平行制備3支印跡電極，進(jìn)行連續(xù)吸附（同一濃度的LMG標(biāo)準(zhǔn)溶液）-洗脫-檢測(cè)20次，并在表征溶液中分別對(duì)其進(jìn)行電化學(xué)檢測(cè)，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差小于等于1.82%（n=20），表明此MIECS 重現(xiàn)性良好。實(shí)驗(yàn)將制備的印跡電極在4℃下保存，分別在放置7d、14d、21d 后，在探針離子溶液中對(duì)其進(jìn)行電化學(xué)檢測(cè)，其實(shí)際測(cè)量值分別為初始值的92.6%、89.9%及83.2%。結(jié)果表明，制得的LMG印跡電化學(xué)傳感器穩(wěn)定性良好，可在一定條件下穩(wěn)定保存并重復(fù)使用。

2.10 實(shí)際樣品檢測(cè)

將印跡傳感器應(yīng)用于小樣本量的實(shí)際樣品（草魚、小龍蝦、海帶）的檢測(cè)中，按1.5節(jié)方法處理樣品，取10mL 樣液，通過1.6 節(jié)方法檢測(cè)，結(jié)果未在樣品中檢出LMG。

2.11 與其他方法比較

與文獻(xiàn)報(bào)道的其他方法比較，如表3所示。本實(shí)驗(yàn)方法檢出限低，線性范圍寬，滿足樣品中LMG檢測(cè)要求。

表3 本文方法與其他測(cè)定LMG的方法比較

3 結(jié)論

以RGO 和AuNPs 作為玻碳電極的納米修飾材料，其比表面積大、導(dǎo)電性能高、穩(wěn)定性好，可提高電極的靈敏度；以LMG 為模板分子，將紫外光譜法與計(jì)算機(jī)模擬計(jì)算相結(jié)合篩選4-ATP 為功能單體；通過自組裝20h 與電聚合20 圈制備LMGMIECS。應(yīng)用計(jì)算機(jī)模擬技術(shù)對(duì)模板分子與功能單體之間的作用形式和機(jī)理進(jìn)行研究，兩者通過共軛效應(yīng)產(chǎn)生相互作用，形成了構(gòu)型穩(wěn)定的LMG-2(4-ATP)型復(fù)合物；結(jié)合紫外光譜法進(jìn)一步驗(yàn)證，在1∶1～1∶4 的物質(zhì)的量比范圍內(nèi)，LMG 與4-ATP之間的共軛效應(yīng)隨著4-ATP比例的增大逐漸增強(qiáng)，形成與LMG在大小和形狀上互補(bǔ)的印跡“空穴”。

通過CV、SWV 對(duì)制備條件進(jìn)行優(yōu)化，并對(duì)該MIECS 的印跡效果、選擇性及分析性能進(jìn)行了考察。結(jié)果表明，所制備的MIECS 具有優(yōu)異的印跡效果以及良好的選擇性、重現(xiàn)性與穩(wěn)定性；該方法在3.3×10-11～1.0×10-6mol/L 之間線性關(guān)系良好，檢出限為1.0×10-11mol/L，樣品平均回收率為85.5%～101.2%，RSD 為1.28%～2.48%。因此，本實(shí)驗(yàn)將計(jì)算機(jī)模擬技術(shù)、紫外光譜技術(shù)、自組裝技術(shù)及電化學(xué)分析等多種技術(shù)相融合制備的LMG-MIECS 可用于水產(chǎn)品中LMG 的靈敏快速檢測(cè)，滿足食品安全快檢需求。本研究有望為簡(jiǎn)化、精準(zhǔn)地篩選功能單體以及開發(fā)性能更優(yōu)越的分子印跡電化學(xué)傳感器的研究提供新的思路和方法。