轉(zhuǎn)座子編輯技術(shù)與CRISPR編輯技術(shù)在乳酸菌定向改良中應(yīng)用的研究進(jìn)展

楊 勇， 艾連中， 熊智強(qiáng)， 楊昳津， 宋 馨

(上海理工大學(xué) 健康科學(xué)與工程學(xué)院/上海食品微生物工程技術(shù)研究中心， 上海 200093)

乳酸菌(lactic acid bacteria，LAB)是一類可發(fā)酵碳水化合物產(chǎn)生大量乳酸的細(xì)菌統(tǒng)稱，是食品工業(yè)重要的微生物。除了可用于生產(chǎn)酸奶、奶酪、酪乳和開菲爾等乳制品，發(fā)酵蔬菜、谷物和肉類，制作酒精性飲料外，乳酸菌還具備降膽固醇、維持菌群平衡、抑制致病菌、增強(qiáng)免疫等多種益生作用。乳酸菌主要包括乳桿菌屬(Lactobacillus,Lb)、雙歧桿菌屬(Bifidobacterium)、乳球菌屬(Lactococcus,Lc)、鏈球菌屬(Streptococcus)和腸球菌屬(Enterococcus)等。由于野生型乳酸菌菌株可能具有某些特性，如乳桿菌的益生特性、腸球菌的致病性等，為了充分發(fā)揮有益菌的功能潛力或抑制致病菌毒性，通常需要對(duì)其進(jìn)行改良。

目前，乳酸菌改良策略包括傳統(tǒng)改造(如隨機(jī)突變、適應(yīng)性進(jìn)化和原生質(zhì)體融合等)以及基因編輯技術(shù)。當(dāng)下基因編輯工具(基于質(zhì)粒的同源重組、重組酶介導(dǎo)的單雙鏈DNA重組和CRISPR/Cas9系統(tǒng)等)存在的操作煩瑣、脫靶率高、效率低等缺點(diǎn)限制了其在乳酸菌中的廣泛使用[1]，因此開發(fā)應(yīng)用簡(jiǎn)便高效的遺傳操作工具對(duì)于乳酸菌基因功能的探究和某些有害菌致病機(jī)制的闡釋至關(guān)重要。轉(zhuǎn)座子(transposon，Tn)是一類可以在生物基因組內(nèi)移動(dòng)和復(fù)制的遺傳因子， 已作為重要的插入突變劑或分子標(biāo)簽廣泛應(yīng)用于細(xì)菌、真菌和其他微生物功能基因組研究中，成為有益微生物功能基因分析和致病微生物毒力基因挖掘的有力工具，如傷寒沙門氏菌(Salmonellatyphi)、霍亂弧菌(Vibriocholerae)、大腸桿菌(Escherichiacoli)等常見(jiàn)致病菌?；贑RISPR轉(zhuǎn)座子編輯系統(tǒng)更可快速實(shí)現(xiàn)大片段DNA在細(xì)菌基因組中多個(gè)位點(diǎn)的高效、定向、無(wú)標(biāo)記編輯整合，為千堿基規(guī)模的基因組工程提供了一種多功能的利器。本文以乳酸菌改良為出發(fā)點(diǎn)，簡(jiǎn)要概述了乳酸菌改良技術(shù)和應(yīng)用前景，并著重介紹了基于CRISPR轉(zhuǎn)座子編輯系統(tǒng)構(gòu)建，以期為后續(xù)開發(fā)新型乳酸菌和豐富益生乳酸菌功能提供更多理論指導(dǎo)。

1 傳統(tǒng)乳酸菌改良技術(shù)

野生型乳酸菌菌株可能具有某些遺傳特性，比如良好的發(fā)酵性和較強(qiáng)的耐受性，但由于外界各種不良環(huán)境的脅迫及不利因素的影響，嚴(yán)重限制了乳酸菌的生長(zhǎng)及代謝能力，阻礙了遺傳功能的發(fā)揮，抑制了高效活性的利用。因此，為了充分發(fā)揮乳酸菌的潛力，通常需要對(duì)其進(jìn)行特定改造。傳統(tǒng)的乳酸菌菌種改良技術(shù)包括適應(yīng)性進(jìn)化、隨機(jī)誘變和原生質(zhì)體融合技術(shù)，見(jiàn)表1。

表1 乳酸菌傳統(tǒng)改良技術(shù)的優(yōu)缺點(diǎn)

1.1 適應(yīng)性進(jìn)化

微生物在長(zhǎng)期受到新環(huán)境影響后，會(huì)逐漸改變自身遺傳信息以適應(yīng)外界環(huán)境變化，最終形成新的變異株。在新環(huán)境下能快速生長(zhǎng)的菌體則成為優(yōu)勢(shì)株，而野生型和負(fù)突變型由于無(wú)法適應(yīng)新環(huán)境最終被淘汰。適應(yīng)性進(jìn)化模擬微生物在自然進(jìn)化過(guò)程中發(fā)生的隨機(jī)變異及自然選擇作用，通過(guò)設(shè)定特殊人工環(huán)境富集正向突變細(xì)胞，最后從變異株中篩選得到期望菌株。酸脅迫、冷凍脅迫、氧脅迫和滲透壓脅迫都會(huì)影響乳酸菌的生存能力，尤其是雙歧桿菌屬，它們對(duì)外界環(huán)境壓力的耐受性較差。Zhang等[2]將B.bifidumCCFM16置于實(shí)驗(yàn)室高滲透壓環(huán)境下連續(xù)傳代1 000代，所得突變體傳代時(shí)間較原始菌株減少了2/3。Jiang等[3]通過(guò)酸脅迫提高了B.longumBBMN68的耐酸性，突變株在pH=2.5條件下，2 h內(nèi)的耐酸能力有了顯著提高。適應(yīng)性進(jìn)化在微生物育種進(jìn)程中發(fā)揮了重要作用，存在靶向性強(qiáng)、效果明顯、性狀穩(wěn)定的優(yōu)點(diǎn)，但菌株低頻率的自發(fā)突變以及進(jìn)化周期較長(zhǎng)等缺點(diǎn)限制了該技術(shù)的大范圍推廣使用。為了提高菌株的突變頻率、加快微生物的進(jìn)化速度，科研人員常在適應(yīng)性進(jìn)化過(guò)程中加入人工誘變策略。

1.2 隨機(jī)誘變

隨機(jī)誘變是一種常用的微生物菌種改良手段，通過(guò)誘變劑誘發(fā)基因突變，這樣可以顯著提高變異的頻率，篩選到各種類型用于生產(chǎn)或研究的突變株。根據(jù)誘變劑的不同可以將隨機(jī)誘變分為物理誘變和化學(xué)誘變。賀曉潔等[4]對(duì)篩選到的Lb.plantarumL-14進(jìn)行二輪紫外誘變，突變株在產(chǎn)酸及耐酸、耐膽鹽和耐鹽等方面均優(yōu)于原始菌株，這為高鹽發(fā)酵劑的工業(yè)化生產(chǎn)提供了新途徑。高鈺淇等[5]分別使用紫外線、60Co-γ射線、硫酸二乙酯對(duì)Lb.acidophilusNX2-6進(jìn)行誘變, 突變株的細(xì)菌素合成量最高達(dá)6 230.79 U/mL，較原始株提高了2.21倍。Zhao等[6]將紫外線照射與亞硝基胍聯(lián)合作用于Lb.plantarumC88，使菌株的黏附能力得到顯著增強(qiáng)。近年來(lái)，我國(guó)在常壓室溫等離子體(atmospheric and room temperature plasma，ARTP)、重離子束等新型隨機(jī)誘變技術(shù)及裝備上取得了重要進(jìn)展，這些新一代隨機(jī)誘變技術(shù)具有相對(duì)生物效應(yīng)高、損傷的修復(fù)效應(yīng)小、突變快、突變體穩(wěn)定、遺傳周期短等優(yōu)點(diǎn)，被廣泛應(yīng)用于重要微生物菌種的選育。殷娜等[7]采用ARTP對(duì)從酸馬奶中篩選的Lb.plantarumYL15進(jìn)行誘變，選育出產(chǎn)酸能力高并且發(fā)酵性能穩(wěn)定的乳酸菌菌株。

隨機(jī)誘變雖然能夠得到突變菌株，但后期篩選的工作量較大、獲得的正突變較少，且突變株的穩(wěn)定性不易控制，極易出現(xiàn)菌株衰退現(xiàn)象。因此，既能減少工作量，又能保證較高正突變率的誘變技術(shù)成為今后誘變篩選的研究方向之一。

1.3 原生質(zhì)體融合

原生質(zhì)體融合屬于雜交育種方法，是人為地使遺傳性狀不同的兩個(gè)親株細(xì)胞的原生質(zhì)體發(fā)生融合，并進(jìn)而發(fā)生遺傳重組以獲得兼具兩個(gè)親本優(yōu)良性狀的遺傳性穩(wěn)定的融合子的過(guò)程。由于該技術(shù)具有重組頻率高、重組類型多、能克服隨機(jī)誘變出現(xiàn)的菌株衰退問(wèn)題等優(yōu)點(diǎn)，在乳酸菌菌種改良中得到廣泛的應(yīng)用。姜雄韜等[8]通過(guò)原生質(zhì)體融合技術(shù)獲得Lb.plantarumZJQ與Lb.plantarumZJ316的原生質(zhì)體融合子, 成功提高了細(xì)菌素合成量。王慕華等[9]將Lb.bulgaricus和具有抗噬菌體能力的嗜熱鏈球菌(S.thermophilus)融合得到的融合子Rh6具有抗噬菌體功能，并且具備優(yōu)良的酸奶發(fā)酵特性。胡鈺潔[10]通過(guò)將Lb.acidophilus同納豆芽孢桿菌(Bacillusnatto)融合，得到的融合子發(fā)酵納豆拉絲效果佳且無(wú)不良風(fēng)味。原生質(zhì)體融合技術(shù)獲得的產(chǎn)品沒(méi)有安全隱患，但該技術(shù)還存在著如遺傳標(biāo)記的選擇、雜種的鑒定、融合菌株性狀優(yōu)化、雜種細(xì)胞間的異源基因相互排斥等問(wèn)題，這些需要進(jìn)一步的深入研究。

2 轉(zhuǎn)座子編輯技術(shù)在乳酸菌改良中的應(yīng)用

2.1 轉(zhuǎn)座子分類及結(jié)構(gòu)

根據(jù)物理結(jié)構(gòu)和轉(zhuǎn)座機(jī)制差異，可以將轉(zhuǎn)座子分為兩大類：RNA類轉(zhuǎn)座子和DNA類轉(zhuǎn)座子。RNA類轉(zhuǎn)座子又稱反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子或逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子，通過(guò)“復(fù)制- 粘貼”機(jī)制以類似于逆轉(zhuǎn)錄病毒生命周期的方式移動(dòng)：RNA中間體被逆轉(zhuǎn)錄成cDNA分子，然后通過(guò)逆轉(zhuǎn)座酶將其插入到基因組中[11]。其結(jié)構(gòu)復(fù)雜，根據(jù)功能劃分為不同的結(jié)構(gòu)域，如長(zhǎng)末端重復(fù)序列、重復(fù)區(qū)和種屬特異性抗原等。DNA類轉(zhuǎn)座子無(wú)需RNA中間體介導(dǎo)，結(jié)構(gòu)相對(duì)比較簡(jiǎn)單，通常包括編碼轉(zhuǎn)座酶基因、靶位點(diǎn)重復(fù)序列和兩側(cè)的末端反向重復(fù)序列，通過(guò)“DNA-DNA”的“剪切- 粘貼”機(jī)制移動(dòng)，DNA轉(zhuǎn)座子從一個(gè)位置切除并通過(guò)編碼的轉(zhuǎn)座酶靶向識(shí)別末端重復(fù)序列，將DNA轉(zhuǎn)座子重新整合到靶位點(diǎn)[11]。

Tn916家族(Tn925、Tn919和TnF01等)、Tn917、Mu噬菌體、部分插入序列(insertion sequences，IS，如IS946、IS3家族和ISS1等)以及Mariner家族轉(zhuǎn)座子是目前乳酸菌中應(yīng)用較為廣泛的幾類轉(zhuǎn)座子，而且都已被改造并成功應(yīng)用于乳酸菌突變體庫(kù)的構(gòu)建及基因功能的研究中[12]。插入序列IS是最先被鑒定出的簡(jiǎn)單轉(zhuǎn)座子，大多數(shù)IS包含單一轉(zhuǎn)座酶編碼基因，能夠獨(dú)立完成轉(zhuǎn)座功能。Tn916和Tn917轉(zhuǎn)座子同屬一類轉(zhuǎn)座子，這類轉(zhuǎn)座子包含所編碼的抗性基因、轉(zhuǎn)座酶基因、解離酶基因、末端重復(fù)序列以及解離位點(diǎn)，其轉(zhuǎn)座過(guò)程由所攜帶的轉(zhuǎn)座基因和抗性單元完成。Mu噬菌體的DNA為線性分子, 不含末端重復(fù)序列，能隨機(jī)地插入宿主染色體中，引發(fā)變異。上述幾類均來(lái)源于原核生物，而Mariner轉(zhuǎn)座元件是一種最簡(jiǎn)單的真核轉(zhuǎn)座子，與其他轉(zhuǎn)座子相比，Mariner轉(zhuǎn)座元件具有插入位點(diǎn)隨機(jī)性高，以及與品種特定的寄主因素?zé)o關(guān)、可以在不同品種間水平轉(zhuǎn)移的特點(diǎn)。Mariner轉(zhuǎn)座元件兩端為30 bp的重復(fù)序列，元件內(nèi)部具有單一閱讀框(open reading frame，ORF)，用于編碼轉(zhuǎn)座酶。轉(zhuǎn)座酶的氮端為具有螺旋- 轉(zhuǎn)角- 螺旋空間結(jié)構(gòu)的DNA結(jié)合區(qū)域，碳端為3個(gè)天冬氨酸殘基構(gòu)成的催化結(jié)構(gòu)域，結(jié)合區(qū)域與催化區(qū)域間存在高度保守的連接區(qū)域。上述轉(zhuǎn)座子各自具有不同特點(diǎn)，在乳酸菌突變體的構(gòu)建與功能研究方面表現(xiàn)出良好的應(yīng)用前景。

2.2 轉(zhuǎn)座子編輯技術(shù)的應(yīng)用

轉(zhuǎn)座子編輯技術(shù)即利用轉(zhuǎn)座子特有的轉(zhuǎn)座功能，對(duì)生物基因組進(jìn)行基因突變并研究基因功能，如常利用轉(zhuǎn)座子構(gòu)建菌株突變體文庫(kù)，其技術(shù)特征是所有轉(zhuǎn)座子都攜帶轉(zhuǎn)座所必需的基因，因此它并不依賴于轉(zhuǎn)座子與靶點(diǎn)間的序列同源性。因轉(zhuǎn)座子插入阻斷了轉(zhuǎn)錄或翻譯過(guò)程，導(dǎo)致靶點(diǎn)基因失活，而且插入往往表現(xiàn)出極性效應(yīng)，即轉(zhuǎn)座子在操縱子上游基因的插入影響到下游基因的表達(dá)，原因是轉(zhuǎn)座子序列中含有終止子或終止密碼子，造成轉(zhuǎn)錄或翻譯的終止，因此影響后續(xù)基因的表達(dá)，進(jìn)而依靠表型鑒定出突變體[13]。

Tn916家族是一類應(yīng)用較多的轉(zhuǎn)座子，已被證明能夠在多種乳酸菌中進(jìn)行轉(zhuǎn)移[14](見(jiàn)表2)。Devirgiliis等[15]研究表明來(lái)自于Lb.paracasei的轉(zhuǎn)座子Tn916轉(zhuǎn)移至糞腸球菌(E.faecalis)JH2-2的頻率極低(1×10-8)，并且插入位點(diǎn)并不是文獻(xiàn)報(bào)道的高頻特征序列。由此可見(jiàn)，Tn916作為誘變轉(zhuǎn)座子仍存在兩個(gè)問(wèn)題：轉(zhuǎn)移和整合到各種乳酸菌的頻率相對(duì)較低，無(wú)法構(gòu)建龐大的突變體文庫(kù)以供篩選；此插入位點(diǎn)存在偏好性也影響了突變文庫(kù)的構(gòu)建。Tn917在糞腸球菌中普遍存在，經(jīng)常被用于乳球菌屬、鏈球菌屬、乳桿菌屬和腸球菌屬的隨機(jī)插入突變，以挖掘表型相對(duì)應(yīng)的未知基因。此外，Tn917的各種衍生物都具有無(wú)啟動(dòng)子的lacZ基因，從而能夠與插入位點(diǎn)兩側(cè)的基因發(fā)生轉(zhuǎn)錄融合[16]。Israelsen等[17]構(gòu)建的Tn917-lacZ衍生物在Lc.lactisMG1363中形成了一個(gè)隨機(jī)插入的lacZ融合文庫(kù)(包含2 500個(gè)整合子)，并從該文庫(kù)中鑒定出一系列受調(diào)控的啟動(dòng)子。Jones等[18]基于轉(zhuǎn)座子標(biāo)簽誘變技術(shù)鑒定了新生鼠敗血癥感染模型中無(wú)乳鏈球菌(S.agalactiae)生長(zhǎng)和存活所需的基因，通過(guò)對(duì)Tn7誘變篩選出大約1 600個(gè)S.agalactiae突變體，其中鑒定的120個(gè)突變體能在模型體內(nèi)存活。同源插入序列(IS)也被用于乳酸菌突變體庫(kù)構(gòu)建。李晨等[19]利用載體pGhost9: ISS1，經(jīng)復(fù)制型轉(zhuǎn)座構(gòu)建了Lb.delbrueckiisubsp.bulgaricusLb-MH的突變體，得到3 株具有抗后酸化能力的突變株LA-1、LA-2、LA-3。其他轉(zhuǎn)座子如Mariner家族中的Himar1轉(zhuǎn)座元件也已被成功地應(yīng)用于腸球菌屬和鏈球菌屬[20]。由此可見(jiàn)，轉(zhuǎn)座子誘變技術(shù)需要DNA鏈斷裂，安全性低，且并不適用于廣泛的宿主特性。

表2 轉(zhuǎn)座子編輯技術(shù)在乳酸菌中的應(yīng)用

3 CRISPR編輯技術(shù)在乳酸菌改良中的應(yīng)用

在過(guò)去的30年里，各種基因編輯組件的開發(fā)，如基于質(zhì)粒的同源重組、外源重組酶介導(dǎo)的單雙鏈DNA重組等系統(tǒng)，使得乳酸菌的遺傳操作工具得到了極大改進(jìn)。但上述技術(shù)存在關(guān)鍵的問(wèn)題需要解決，包括周期長(zhǎng)、效率低、篩選標(biāo)記不足、容易造成回復(fù)突變、無(wú)法實(shí)現(xiàn)基因組的無(wú)痕敲除等(表3)。成簇規(guī)律間隔短回文重復(fù)序列(clustered regularly interspaced short palindromic repeats，CRISPR)系統(tǒng)開辟了基因組編輯研究的新篇章。目前已在多種微生物中得到廣泛應(yīng)用，如大腸桿菌、黏細(xì)菌(Myxobacteria)、金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)、芽孢桿菌(Bacillus)、乳桿菌、嗜熱鏈球菌和乳酸乳球菌等。CRISPR/Cas9系統(tǒng)由Cas蛋白、反式激活CRISPR RNA(trans-activating CRISPR RNA, tracrRNA)和CRISPR RNA陣列(crRNA，包含2個(gè)重復(fù)區(qū)和1個(gè)間隔區(qū))組成，為簡(jiǎn)化用于目的基因的編輯，將crRNA和tracrRNA融合，形成單一的sgRNA(synthetic guide RNA)。Cas蛋白與sgRNA結(jié)合并識(shí)別基因組的原型間隔序列毗鄰基序(protospacer adjacent motif，PAM)位點(diǎn)(-NGG)，產(chǎn)生雙鏈斷裂，雙鏈斷裂后會(huì)激發(fā)非同源末端連接或同源定向修復(fù)機(jī)制進(jìn)行修復(fù)。

表3 可用于乳酸菌基因組編輯的工具

3.1 在乳酸菌基因敲除中的應(yīng)用

鑒于Cas蛋白可與具有不同位點(diǎn)的sgRNA共同作用，因此該系統(tǒng)可用于多個(gè)位點(diǎn)的同時(shí)編輯。Oh和van Pijkeren將CRISPR/Cas系統(tǒng)和單鏈DNA(ssDNA)重組技術(shù)相結(jié)合，成功對(duì)Lb.reuteriATCC6475進(jìn)行基因編輯[21]。Huang等[22]通過(guò)RecE/T輔助修復(fù)的Cas9工具，在雙質(zhì)粒系統(tǒng)中成功實(shí)現(xiàn)植物乳桿菌和短乳桿菌單基因敲除，且敲除效率達(dá)到50%～100%，高效修復(fù)雙鏈斷裂。Song等[23]使用CRISPR/Cas9D10A在干酪乳桿菌中建立了一種快速且準(zhǔn)確的基因編輯方法。利用該系統(tǒng)成功敲除了4個(gè)非必需基因，插入了1個(gè)綠色熒光蛋白報(bào)告基因，基因敲除和插入的效率為25%～62%。

3.2 在乳酸菌基因轉(zhuǎn)錄抑制中的應(yīng)用

除了敲除或插入基因外，CRISPR編輯技術(shù)還能在轉(zhuǎn)錄水平對(duì)目的基因進(jìn)行調(diào)控?；贑as蛋白的修飾突變，衍生出了CRISPR干擾(CRISPR interference, CRISPRi)系統(tǒng)。將Cas9結(jié)構(gòu)域同時(shí)失活構(gòu)成的dCas9系統(tǒng)中的Cas9與目標(biāo)基因結(jié)合后，失去靶向裂解基因的能力，成為實(shí)現(xiàn)基因沉默和轉(zhuǎn)錄調(diào)控的強(qiáng)大工具。目前已經(jīng)有研究利用CRISPRi系統(tǒng)對(duì)乳酸菌基因轉(zhuǎn)錄進(jìn)行調(diào)控的報(bào)道。Berlec等[24]通過(guò)CRISPRi系統(tǒng)靶向和沉默Lc.lactisNZ9000中的upp基因，使其mRNA的相對(duì)轉(zhuǎn)錄水平降低了50倍。Xiong等[25]在乳酸乳球菌中也對(duì)CRISPRi系統(tǒng)進(jìn)行了研究，成功地將轉(zhuǎn)錄抑制從單基因擴(kuò)展到多基因，抑制效率高達(dá)99%，并同時(shí)鑒定了一系列功能基因。

4 基于CRISPR的轉(zhuǎn)座子編輯系統(tǒng)在乳酸菌改良中的應(yīng)用展望

過(guò)去十年，轉(zhuǎn)座子誘變?nèi)匀皇菢?gòu)建突變體庫(kù)和篩選關(guān)鍵基因的主要方法，但因其低效而未廣泛使用。CRISPR系統(tǒng)雖設(shè)計(jì)簡(jiǎn)單、操作方便、效率高、特異性強(qiáng)，但同樣依賴DNA斷裂和同源重組，且存在嚴(yán)重的脫靶效應(yīng)。最近，研究人員在對(duì)CRISPR系統(tǒng)生物多樣性的探索中，發(fā)現(xiàn)了CRISPR相關(guān)轉(zhuǎn)座酶的存在，并開始將轉(zhuǎn)座酶的強(qiáng)大整合能力與RNA引導(dǎo)的Cas核酸酶的精確靶向結(jié)合起來(lái)，以實(shí)現(xiàn)靶向轉(zhuǎn)座子整合[26-28]。目前的分析研究確定了含有crRNA陣列元件、Cas基因和轉(zhuǎn)座酶特異性基因的CRISPR位點(diǎn)[28]。典型的例子就是CRISPR-Cas系統(tǒng)與Tn7樣轉(zhuǎn)座子結(jié)合進(jìn)行基于RNA的靶向轉(zhuǎn)座[29-30]。

4.1 基于CRISPR的轉(zhuǎn)座子編輯系統(tǒng)的構(gòu)建

在CRISPR系統(tǒng)中，Cas效應(yīng)蛋白(如Cas9和Cas12)通過(guò)引導(dǎo)RNA定位于基因組中特定的DNA序列，誘導(dǎo)DNA雙鏈斷裂，然后通過(guò)同源重組或非同源末端連接進(jìn)行修復(fù)，但這種類型的編輯效率往往不盡如人意[31]?；谵D(zhuǎn)座子載體的插入效率在一定程度上高于宿主介導(dǎo)的同源重組，但局限于轉(zhuǎn)座元件靶序列特異性較差的缺點(diǎn)。在2019年，Strecker等[27]在藍(lán)細(xì)菌Scytonemahofmanni和Anabaenacylindrica中開發(fā)了用于DNA插入的CRISPR相關(guān)轉(zhuǎn)座酶(CRISPR-associated transposase，CAST)系統(tǒng)(ShCAST和AcCAST)(圖1)。該系統(tǒng)包含2個(gè)質(zhì)粒，由單蛋白效應(yīng)物Cas12k、轉(zhuǎn)座酶復(fù)合物和crRNA陣列組成的輔助質(zhì)粒(pHelper)以及由目的基因和轉(zhuǎn)座子左右臂組成的供體質(zhì)粒(pDonor)。首先Cas12k特異性識(shí)別具有5’-GTN的PAM序列，同時(shí)在tracrRNA協(xié)助下，crRNA間隔區(qū)與靶DNA鏈互補(bǔ)配對(duì)形成DNA-RNA雜交鏈，隨后轉(zhuǎn)座酶復(fù)合物識(shí)別引導(dǎo)目的基因整合至靶DNA中[32]。ShCAST和AcCAST系統(tǒng)的DNA整合分別位于PAM下游的60～66 bp和49～56 bp處的5 bp重復(fù)插入序列。雖然整合原理相同，但來(lái)自不同來(lái)源的酶的CAST引導(dǎo)的DNA定向整合具有不一致的位置偏好和插入效率，AcCAST系統(tǒng)的DNA插入效率僅為ShCAST系統(tǒng)的30%，且轉(zhuǎn)座效率受插入序列大小和目標(biāo)位點(diǎn)的影響，脫靶率較高(約50%)。CAST系統(tǒng)規(guī)避了對(duì)基因組DNA的切割和對(duì)DNA的損傷修復(fù)系統(tǒng)的利用，直接通過(guò)RNA引導(dǎo)的轉(zhuǎn)座酶進(jìn)行目的DNA的插入，相較于現(xiàn)階段的遺傳編輯技術(shù)存在很多優(yōu)勢(shì)。

圖1 CAST系統(tǒng)介導(dǎo)的外源DNA整合

美國(guó)哥倫比亞大學(xué)Klompe等[26]將來(lái)自于V.cholerae的天然轉(zhuǎn)座子與CRISPR系統(tǒng)相結(jié)合，開發(fā)出一種強(qiáng)大的DNA插入系統(tǒng)(insert transposable elements by guide RNA-assisted targeting，INTEGRATE)(圖2)。該系統(tǒng)包含3個(gè)質(zhì)粒，由Cas678效應(yīng)復(fù)合物、TniQ和crRNA陣列組成的級(jí)聯(lián)復(fù)合質(zhì)粒(pQCascade)，由轉(zhuǎn)座酶復(fù)合物(TnsA-TnsB-TnsC)組成的pTnsABC以及pDonor。首先Cas8通過(guò)靶DNA雙鏈小溝序列特異性識(shí)別5’-CC的PAM序列，并穩(wěn)定被打開的DNA雙鏈，便于靶DNA鏈與crRNA的間隔區(qū)互補(bǔ)配對(duì)形成DNA-RNA雜交鏈，并由Cas7穩(wěn)定，TniQ形成同源二聚體結(jié)合在Cascade復(fù)合物頭部，分別與Cas7和Cas6相互作用，并負(fù)責(zé)招募非序列特異性DNA結(jié)合蛋白TnsC，轉(zhuǎn)座子本身被TnsA和TnsB結(jié)合，形成一個(gè)配對(duì)末端復(fù)合物，被TnsC招募整合至目標(biāo)DNA上[33]。整合位點(diǎn)位于PAM序列下游80～82 bp處，偏向于轉(zhuǎn)座子右臂靠近靶位點(diǎn)。與CAST相比，它不需要tracrRNA，更適合直接插入多個(gè)基因組目標(biāo)。此外，Cas678效應(yīng)復(fù)合物的存在可能是該系統(tǒng)脫靶率低于5%的關(guān)鍵，但該系統(tǒng)的DNA插入沒(méi)有方向性，大片段(3～10 kbp)轉(zhuǎn)座效率低于CAST系統(tǒng)。隨后，為了簡(jiǎn)化策略，消除抗生素承載和對(duì)多種轉(zhuǎn)化過(guò)程的需求，提高整合效率，該團(tuán)隊(duì)在原來(lái)基礎(chǔ)上通過(guò)將關(guān)鍵元件有效組合，構(gòu)建出INTEGRATE單質(zhì)粒系統(tǒng)pSPIN(圖3)，使得10 kb片段的整合效率達(dá)到100%，并在其他革蘭氏陰性菌如產(chǎn)酸克雷伯氏桿菌(Klebsiellaoxytoca)及惡臭假單胞菌(Pseudomonasputida)中證實(shí)了pSPIN系統(tǒng)的有效性；相比之下，具有三質(zhì)粒的INTEGRATE系統(tǒng)僅對(duì)低于1 kbp的片段具有較強(qiáng)的整合效率。此外，通過(guò)多陣列組合，并結(jié)合Cre-loxp系統(tǒng)，作者成功敲除了20 kbp的大片段，為微生物研究中實(shí)現(xiàn)更復(fù)雜的基因編輯操作提供了可能性。

圖2 INTEGRATE系統(tǒng)介導(dǎo)的外源DNA整合

4.2 基于CRISPR的轉(zhuǎn)座子編輯系統(tǒng)的應(yīng)用

許多學(xué)者利用合成生物學(xué)研究表明：Cas核酸酶可以作為RNA引導(dǎo)的DNA結(jié)合蛋白域被重新用于操縱DNA序列和基因表達(dá)，如CRISPRi[34]、CRISPR激活(CRISPR activation，CRISPRa)[35]、FokI-dCas9二聚核酸酶[36]、堿基編輯器[37]和靶向組蛋白修飾[38]等。同樣，轉(zhuǎn)座酶也可以融合到dCas9上進(jìn)行靶向轉(zhuǎn)座。研究人員開發(fā)了一種新型合成轉(zhuǎn)座子，Cas-轉(zhuǎn)座子(CasTn)，它可以將Himar1轉(zhuǎn)座酶的DNA整合能力和dCas9的可編程基因組靶向能力結(jié)合起來(lái)，以實(shí)現(xiàn)在基因位點(diǎn)的定點(diǎn)轉(zhuǎn)座子插入[39]。Vo等[40]將V.cholerae來(lái)源的CRISPR轉(zhuǎn)座酶系統(tǒng)(VchINT)和S.hofmanni來(lái)源的CRISPR轉(zhuǎn)座酶系統(tǒng)(ShoINT)聯(lián)用，有效避免了已整合DNA片段的重新轉(zhuǎn)座和整合，大大提高了多位點(diǎn)不同片段整合的特異性。轉(zhuǎn)座子相關(guān)CRISPR-Cas系統(tǒng)的應(yīng)用并不僅限于插入或敲除靶基因，與質(zhì)粒依賴的表達(dá)策略相比，使用轉(zhuǎn)座子相關(guān)CRISPR-Cas系統(tǒng)的染色體工程在控制拷貝數(shù)和保持異源基因的穩(wěn)定性方面具有優(yōu)勢(shì)，而且該系統(tǒng)允許在細(xì)胞生長(zhǎng)和繁殖時(shí)進(jìn)行不間斷的DNA整合，這對(duì)于構(gòu)建多拷貝文庫(kù)具有獨(dú)特的吸引力。如Zhang等[41]通過(guò)多陣列組合的CRISPR相關(guān)轉(zhuǎn)座酶策略建立的E.coli文庫(kù)能在5 d內(nèi)連續(xù)增加拷貝數(shù)至10個(gè)[圖3(a)]；而且，他還使用CAST系統(tǒng)實(shí)現(xiàn)了多拷貝染色體整合，并將其應(yīng)用于N-乙酰葡萄糖胺(GlcNAc)的生產(chǎn)，得到的高產(chǎn)GlcNAc(11.59 g/L)突變體是含有pET-GNAc質(zhì)粒菌株的6.2倍[42][圖3(c)]。此外，轉(zhuǎn)座子相關(guān)CRISPR-Cas系統(tǒng)也有可能應(yīng)用于跨物種，這對(duì)混合細(xì)菌群落的基因操作特別有用。一項(xiàng)通過(guò)基因間結(jié)合將pSPIN系統(tǒng)從供體大腸桿菌遞送到小鼠腸道菌群中的研究，成功實(shí)現(xiàn)了目標(biāo)和物種的特異性整合[40][圖3(b)]。

圖3 基于CRISPR的轉(zhuǎn)座子系統(tǒng)的相關(guān)應(yīng)用

4.3 基于CRISPR的轉(zhuǎn)座子編輯系統(tǒng)在乳酸菌定向改良中的應(yīng)用展望

傳統(tǒng)的乳酸菌改良技術(shù)雖能影響其生理代謝，致使部分基因發(fā)生突變，但卻收效不佳；基于同源重組的基因編輯技術(shù)也存在一定的缺陷性。轉(zhuǎn)座子是基因組重要組成部分，是微生物遺傳操作的寶貴生物工具，對(duì)于基因功能分析至關(guān)重要。轉(zhuǎn)座子誘變技術(shù)可將外源轉(zhuǎn)座子轉(zhuǎn)化至宿主細(xì)胞，并隨機(jī)插入至宿主基因組中，使基因表達(dá)發(fā)生變化，從而產(chǎn)生新的性狀。該技術(shù)雖可快速、準(zhǔn)確、規(guī)?；瘜ふ诣b定與某一表型相關(guān)的基因，但需要DNA鏈斷裂，安全性低，且并不適用于廣泛的宿主特性。基于CRISPR轉(zhuǎn)座子編輯系統(tǒng)是一種新型的、強(qiáng)大的遺傳編輯系統(tǒng)，它允許供體DNA的多重位點(diǎn)插入，并且不必依賴低效的同源重組和宿主細(xì)胞修復(fù)機(jī)制，因此可以大大提高插入效率和供體DNA的大小，安全性更高；特別是pSPIN系統(tǒng)，不僅消除了抗生素和多啟動(dòng)子的承載，簡(jiǎn)化了遺傳轉(zhuǎn)化過(guò)程，而且該系統(tǒng)還可以同其他操作系統(tǒng)聯(lián)合使用，并具有廣泛的宿主適應(yīng)特性，是CRISPR相關(guān)轉(zhuǎn)座子編輯系統(tǒng)的亮點(diǎn)。雖然目前還未有關(guān)于該系統(tǒng)在乳酸菌研究中的報(bào)道，但新型乳酸菌遺傳功能分析、功能基因的精準(zhǔn)靶向和高效整合技術(shù)一直是生物技術(shù)研究的焦點(diǎn)，基于CRISPR轉(zhuǎn)座子基因編輯系統(tǒng)有望突破該瓶頸，為乳酸菌功能基因研究提供可靠的技術(shù)指導(dǎo)。當(dāng)然，關(guān)于CRISPR轉(zhuǎn)座子編輯系統(tǒng)的優(yōu)化與安全性應(yīng)用還需要更進(jìn)一步地研究，比如精確的基因調(diào)節(jié)或無(wú)痕插入、詳細(xì)的生化結(jié)構(gòu)機(jī)制等。

5 總 結(jié)

乳酸菌是食品工業(yè)微生物中一類非常重要的細(xì)菌, 也是眾所周知的維持人及動(dòng)物健康的重要益生菌群。隨著對(duì)乳酸菌功能研究的逐漸深入，人們對(duì)乳酸菌制品的要求也越來(lái)越高，菌種改良也就顯得十分必要。利用基因編輯技術(shù)來(lái)改良乳酸菌，增強(qiáng)與修飾乳酸菌的生物學(xué)功能，篩選出安全穩(wěn)定、生態(tài)效應(yīng)強(qiáng)、更利于生產(chǎn)的優(yōu)良菌種。而轉(zhuǎn)座子技術(shù)的出現(xiàn)改變了以往人們認(rèn)為遺傳物質(zhì)是固定排列在染色體上的觀念，使得基因組編輯更為高效、簡(jiǎn)便。傳統(tǒng)的基因編輯技術(shù)已很難滿足乳酸菌復(fù)雜的功能研究，精準(zhǔn)高效的基因編輯技術(shù)憑借其優(yōu)勢(shì)將會(huì)使乳酸菌在醫(yī)療、農(nóng)業(yè)及食品工業(yè)中獲得更為廣泛的應(yīng)用。