不同純化程度香菇柄多糖的乙酰化修飾及降血糖活性

李順?lè)澹?許方方， 崔國(guó)梅， 王安建， 魏書(shū)信， 劉麗娜， 田廣瑞， 高帥平

(河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 農(nóng)副產(chǎn)品加工研究中心， 河南 鄭州 450002)

香菇(Lentinusedodes)是中國(guó)栽培面積和產(chǎn)量最大的食用菌[1]，不僅富含營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，還含有大量多糖、酚酸類(lèi)以及活性蛋白等生物大分子物質(zhì)，具有藥用保健功效[2]。香菇柄是香菇商品化處理中的副產(chǎn)物，占香菇總重的20%～30%[3-4]；由于其呈纖維化，適口性差，只有少量被加工利用，大部分被廢棄，造成極大的資源浪費(fèi)。香菇柄同菌蓋一樣由菌絲組成，同樣含有豐富的碳水化合物、蛋白質(zhì)、氨基酸等[5]。

研究表明，多糖具有提高免疫力、抗病毒等多種生物活性，而多糖的理化性質(zhì)、分子量、聚合度、主鏈糖苷鍵連接方式、支鏈的分枝數(shù)目以及多糖的空間構(gòu)象等與其藥理作用關(guān)系密切[2]。將某些化學(xué)基團(tuán)引入多糖大分子鏈中，不僅可改變多糖的理化性質(zhì)，增強(qiáng)生物活性，而且還可以產(chǎn)生新的活性，如乙?；噱X(qián)柳多糖可激活樹(shù)突細(xì)胞，提高抗突變能力[6]；硫酸化修飾枸杞多糖可顯著促進(jìn)免疫淋巴細(xì)胞增殖提高免疫力[7]等。目前，常用的化學(xué)修飾多糖方法有乙?；?、硫酸酯化、羧甲基化等[8-12]。許多研究結(jié)果證實(shí)，多糖經(jīng)過(guò)乙?；揎椇笊锘钚燥@著提高[8,13-14]。Tang等[15]研究發(fā)現(xiàn)，羊肚菌多糖經(jīng)乙?；揎椇蟮目寡趸钚砸约皩?duì)肝癌細(xì)胞和結(jié)腸癌細(xì)胞的抑制活性高于其硫酸酯化修飾多糖和羧甲基化修飾多糖。α-淀粉酶抑制劑和α-葡萄糖苷酶抑制劑可減緩人體腸道對(duì)淀粉等物質(zhì)的降解和葡萄糖的消化吸收。體外抑制α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶活性試驗(yàn)可以測(cè)定多糖降血糖生理活性[16]。生物活性成分純化有利于明晰生物活性物質(zhì)的作用機(jī)理，但可能會(huì)由于其他成分的去除而降低多糖活性[2,17]。尚未見(jiàn)純化程度對(duì)乙?；揎椀亩嗵怯绊懛矫娴膱?bào)道。因此，本研究主要對(duì)香菇柄多糖進(jìn)行脫蛋白和柱層析分離純化，對(duì)純化前后多糖含量及乙?；揎椙昂笙愎奖嗵沁M(jìn)行初步結(jié)構(gòu)分析，并對(duì)其體外降血糖活性進(jìn)行評(píng)價(jià)，以期為香菇柄多糖的利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

香菇柄購(gòu)自鄭州信基調(diào)味品市場(chǎng)，經(jīng)50 ℃烘干至含水率低于8%，粉碎過(guò)40目篩后備用。

α-淀粉酶、α-葡萄糖苷酶、3,5-二硝基水楊酸、4-硝基苯-α-D-吡喃葡萄糖苷，上海源葉生物科技有限公司；重蒸酚、葡萄糖、無(wú)水乙醇、氯化鈉、氫氧化鈉、溴化鉀等均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

FA2004C型分析天平，上海越平科學(xué)儀器有限公司；UV- 1800型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)，島津儀器(蘇州)有限公司；RV8V- C型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，德國(guó)IKA集團(tuán)；LD- Y300A型高速萬(wàn)能粉碎機(jī)，上海頂帥電器有限公司；DF- 10型恒溫磁力攪拌器，鞏義市予華儀器有限公司；H2050R型臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)，湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開(kāi)發(fā)有限公司；Nicolet iS5型傅里葉紅外光譜儀，美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1香菇柄多糖的制備及多糖和蛋白質(zhì)含量的測(cè)定

1.3.1.1 香菇柄粗多糖的制備

香菇柄粉加入體積分?jǐn)?shù)為85%的乙醇回流脫脂。揮干乙醇后，將香菇柄粉與蒸餾水按照料液比1∶15(g∶mL)進(jìn)行混勻，沸水浸提2 h，4 000 r/min離心10 min，收集上清液，沉淀再重復(fù)浸提1次，合并2次上清液。將上清液減壓濃縮后，加入3倍體積無(wú)水乙醇，置4 ℃過(guò)夜沉淀，再經(jīng)4 000 r/min離心10 min(4 ℃)，沉淀用無(wú)水乙醇淋洗3次，經(jīng)干燥后即為香菇柄粗多糖。

1.3.1.2 脫蛋白多糖的制備

稱取粗多糖粉5.0 g，溶于250 mL水中，調(diào)pH值為7.0，加入質(zhì)量濃度為7 mg/mL中性蛋白酶，50 ℃攪拌酶解3 h，沸水滅酶15 min，冷卻后4 000 r/min離心10 min，取上清液，加入3倍體積無(wú)水乙醇，4 ℃沉淀多糖，在4 ℃環(huán)境經(jīng)5 000 r/min離心10 min，收集沉淀，干燥后即為脫蛋白多糖[17]。

1.3.1.3 柱層析純化多糖

DEAE Sephadex A- 25經(jīng)預(yù)處理后裝柱( 1.5 cm×60 cm)、平衡，將多糖樣品用蒸餾水溶解后配成質(zhì)量濃度為4 mg/mL的溶液，取3 mL過(guò)柱子。洗脫液分別為蒸餾水、0.1 mol/L的NaCl溶液、0.3 mol/L的NaCl溶液和0.1 mol/L的NaOH溶液，流速為2 mL/min，每管收集5 mL，每種洗脫液分別收集40管[18]。每管多糖的含量采用苯酚- 硫酸法[19]測(cè)定，根據(jù)洗脫曲線收集各洗脫組分。蒸餾水洗脫組分得率最高，其余各洗脫組分得率較低。因此，以蒸餾水洗脫組分為柱層析多糖進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

1.3.1.4 多糖和蛋白質(zhì)含量測(cè)定

采用苯酚- 硫酸法[19]測(cè)定多糖含量；采用考馬斯亮藍(lán)G- 250法[20]測(cè)定蛋白質(zhì)含量。

1.3.2香菇柄多糖的乙?；揎?/p>

采用NaOH- 乙酸酐法對(duì)香菇柄多糖進(jìn)行修飾[21]，乙酸酐溶液用量5 mL，反應(yīng)結(jié)束后經(jīng)透析、醇沉、干燥，即為乙?；嗵牵謩e標(biāo)記為乙?；侄嗵恰⒁阴；摰鞍锥嗵?、乙?；鶎游龆嗵?，用于后續(xù)測(cè)定。

1.3.3乙酰基取代度的測(cè)定

采用酸堿滴定法測(cè)定乙?；〈萚22]。

1.3.4紫外光譜分析

將香菇柄多糖及其乙?；嗵侵瞥少|(zhì)量濃度為0.2 mg/mL的水溶液，于190～800 nm波長(zhǎng)處進(jìn)行掃描，獲得紫外光譜圖。

1.3.5紅外光譜分析

稱取香菇柄多糖及其乙?；嗵菢悠犯? mg，分別與200 mg經(jīng)過(guò)干燥的溴化鉀在瑪瑙研缽中研磨均勻，壓片后用傅里葉紅外光譜儀在4 000～400 cm-1范圍內(nèi)進(jìn)行光譜掃描。

1.3.6剛果紅實(shí)驗(yàn)

按照參考文獻(xiàn)[23]進(jìn)行剛果紅實(shí)驗(yàn)，測(cè)定三螺旋結(jié)構(gòu)。移取2.0 mL質(zhì)量濃度為1.0 mg/mL的香菇柄多糖及其乙酰化多糖樣品溶液，加入80 μmol/L的剛果紅試劑2.0 mL，搖勻。加入一定量的2.0 mol/L NaOH溶液，使各樣品溶液的NaOH濃度達(dá)到0～0.5 mol/L。掃描各溶液在190～800 nm波長(zhǎng)處的紫外可見(jiàn)光譜，得到最大吸收波長(zhǎng)。

1.3.7多糖的降血糖活性測(cè)定

體外抑制α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶活性試驗(yàn)測(cè)定香菇柄多糖與香菇柄乙酰化多糖的降血糖作用。

1.3.7.1 α-淀粉酶抑制活性測(cè)定

采用3,5-二硝基水楊酸(DNS)比色法[12]，測(cè)定多糖和乙?；嗵堑摩?淀粉酶抑制活性。具體步驟：在各個(gè)試管中加入一定量不同質(zhì)量濃度梯度的樣品溶液，補(bǔ)充濃度為0.2 mol/L的磷酸鈉緩沖液(pH值6.8)至1.0 mL，加入α-淀粉酶溶液(10 U/mL)1 mL，37 ℃水浴15 min，加入質(zhì)量濃度為10 g/L淀粉溶液1 mL，37 ℃水浴15 min，加入DNS試劑1 mL置于沸水浴中反應(yīng)15 min，迅速冷卻至室溫，隨后加入3 mL蒸餾水稀釋，在540 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度值，計(jì)算酶活性抑制率。

1.3.7.2 α-葡萄糖苷酶抑制活性測(cè)定

用4-硝基苯-α-D-吡喃葡萄糖苷(PNPG)作底物，在各試管中加入不同質(zhì)量濃度梯度的樣品溶液，補(bǔ)充0.2 mol/L的磷酸鈉緩沖液(pH值6.8)至3.0 mL，加入α-葡萄糖苷酶(7.5 U/mL)與PNPG(5 mmol/L)各0.5 mL，搖勻，37 ℃水浴反應(yīng)30 min后，加入1 mol/L的碳酸鈉溶液1 mL終止反應(yīng)，于405 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度值，計(jì)算酶活性抑制率[24]。

1.4 數(shù)據(jù)處理

所有實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，數(shù)據(jù)用平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差(mean±SD)表示。采用SPSS軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行差異顯著性分析，用GraphPad Prism軟件繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 純化對(duì)多糖和蛋白質(zhì)含量的影響

香菇柄多糖乙酰化修飾取代度及多糖和蛋白質(zhì)含量見(jiàn)表1。由表1可知，隨著多糖純化的不斷進(jìn)行，多糖含量(純度)不斷增加，質(zhì)量分?jǐn)?shù)由純化前的36.42%(粗多糖)和41.87%(乙酰化粗多糖)升高至純化后的88.57%和81.27%(經(jīng)脫蛋白和柱層析后的多糖、乙?；嗵?。但多糖得率卻顯著降低，如粗多糖及其乙酰化多糖經(jīng)脫蛋白后得率由83.25%和48.83%降至56.67%和40.17%，再經(jīng)柱層析后得率降至21.85%和35.42%；而蛋白質(zhì)含量由純化前的17.12%降低至純化后的0.69%。乙酰化多糖的變化趨勢(shì)與未乙?；嗵窍嗨?，且乙?；蠖嗵呛偷鞍踪|(zhì)含量均有不同程度降低。各多糖乙?；〈染?.3左右，說(shuō)明純化對(duì)乙?；〈葻o(wú)顯著影響。

表1 香菇柄多糖乙酰化修飾取代度及多糖和蛋白質(zhì)含量

2.2 純化對(duì)多糖紫外光譜和紅外光譜的影響

香菇柄多糖及其乙?；嗵堑淖贤夤庾V見(jiàn) 圖1。由圖1可知，與粗多糖相比，脫蛋白多糖和柱層析多糖在260、280 nm處的紫外吸光值均呈現(xiàn)出明顯的下降趨勢(shì)，尤其是柱層析純化多糖在260、280 nm處無(wú)明顯的紫外吸光值，并且乙?；嗵桥c未乙?；嗵墙Y(jié)果相似。圖1結(jié)果與表1中蛋白質(zhì)含量測(cè)定結(jié)果一致。

圖1 純化對(duì)香菇柄多糖及其乙?；嗵亲贤夤庾V的影響

圖2 純化對(duì)香菇柄多糖及其乙?；嗵羌t外光譜的影響

2.3 純化對(duì)多糖三螺旋結(jié)構(gòu)的影響

香菇柄多糖及其乙?；嗵桥c剛果紅在不同濃度NaOH溶液中的最大吸收波長(zhǎng)λmax的變化見(jiàn) 圖3。由圖3可知，對(duì)照溶液(水)與剛果紅的混合溶液λmax未發(fā)生紅移，香菇柄粗多糖、脫蛋白多糖和柱層析多糖及其對(duì)應(yīng)的乙?；嗵桥c剛果紅的混合溶液λmax均發(fā)生了紅移。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：香菇柄粗多糖、脫蛋白多糖和柱層析多糖及其對(duì)應(yīng)的乙酰化多糖均具有三螺旋結(jié)構(gòu)；在NaOH濃度范圍內(nèi)，隨著純化的不斷進(jìn)行，粗多糖、脫蛋白多糖和柱層析多糖λmax分別紅移了11.73、5.90、5.73 nm，其對(duì)應(yīng)的乙酰化多糖分別紅移了8.67、6.90、5.83 nm，多糖及其乙?；嗵堑募t移幅度逐漸減小。

圖3 純化對(duì)不同NaOH濃度下香菇柄多糖及其 乙酰化多糖與剛果紅配合物λmax變化的影響

2.4 純化對(duì)多糖降血糖活性的影響

α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶抑制劑作為糖尿病患者的口服降血糖藥引起了很多關(guān)注，其能夠延緩葡萄糖或果糖的釋放，抑制餐后血糖的上升[12,23]。香菇柄多糖及其乙?；嗵菍?duì)α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶的抑制活性結(jié)果見(jiàn)圖4。

由圖4(a)可知，在1.0～5.0 mg/mL質(zhì)量濃度內(nèi)，香菇柄多糖及其乙?；嗵菍?duì)α-淀粉酶的抑制活性均隨著質(zhì)量濃度的增大而增加，但在相同質(zhì)量濃度下各多糖及其對(duì)應(yīng)乙?；嗵菍?duì)α-淀粉酶的抑制活性無(wú)顯著差異(P>0.05)。香菇柄粗多糖、脫蛋白多糖、柱層析多糖及其對(duì)應(yīng)乙酰化多糖對(duì)α-淀粉酶的IC50值分別為3.03、3.08、2.94、2.79、2.81、2.69 mg/mL。α-淀粉酶抑制率結(jié)果表明，乙?；嗵菍?duì)α-淀粉酶的抑制活性高于未乙酰化多糖，但純化并未能顯著提升多糖對(duì)α-淀粉酶的抑制活性。

圖4 乙酰化修飾香菇柄多糖對(duì)α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶的抑制作用

從圖4(b)可知，在試驗(yàn)濃度范圍內(nèi)，隨著多糖質(zhì)量濃度的增大，多糖對(duì)α-葡萄糖苷酶抑制率也逐步增加。當(dāng)多糖質(zhì)量濃度達(dá)到0.2 mg/mL時(shí)，粗多糖及其乙酰化粗多糖對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制率分別為67.55%±2.38%和87.83%±0.60%；繼續(xù)增大多糖質(zhì)量濃度，其對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制活性并未表現(xiàn)出顯著的增高。脫蛋白多糖對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制活性低于粗多糖和柱層析多糖，而乙?；娠@著提高多糖對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制活性。徐雅琴等[23]對(duì)黑穗醋栗果實(shí)多糖乙?；揎椇蛷堺惓痰萚16]對(duì)茯磚茶多糖乙酰化修飾后也得到了與本研究相似的結(jié)果。

研究結(jié)果表明，香菇柄多糖及其乙?；嗵菍?duì)兩種酶具有劑量依賴性抑制活性，且乙?；娠@著提高多糖對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制活性。結(jié)合表1結(jié)果可知，純化雖提高了多糖的純度，但多糖損失嚴(yán)重，且多糖活性未能得到大幅的提高，這可能是由于純化過(guò)程造成了與多糖具有協(xié)同作用的其他活性成分含量的減少。

3 結(jié) 論

1)隨著多糖純化的不斷進(jìn)行，香菇柄多糖及其乙?；嗵侵卸嗵堑寐示@著降低。純化對(duì)乙?；〈葻o(wú)顯著影響，未造成多糖結(jié)構(gòu)的破壞。多糖經(jīng)乙?；揎椇缶霈F(xiàn)了乙酰基的特征吸收峰。不同程度純化后，香菇柄多糖及其對(duì)應(yīng)的乙?；嗵蔷哂腥菪Y(jié)構(gòu)。

2)香菇柄多糖及其乙酰化多糖對(duì)α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶具有劑量依賴性抑制活性。乙?；娠@著提高多糖對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制活性。