貴州巖溶山區(qū)白三葉根際高效溶磷菌的篩選

韋 鑫， 舒健虹*， 曾慶飛， 李亞嬌， 張禮維

(1. 貴州省草業(yè)研究所， 貴州 貴陽(yáng) 550006； 2.黔西南州農(nóng)業(yè)農(nóng)村發(fā)展中心， 貴州 興義 562400)

0 引言

【研究意義】磷元素是植物細(xì)胞的重要組成部分，對(duì)植物細(xì)胞的生長(zhǎng)和增殖有重要作用，且參與植物光合作用、糖和淀粉利用等活動(dòng)，在植物能量代謝和物質(zhì)運(yùn)輸活動(dòng)中扮演重要角色[1-2]。植物缺磷時(shí)，會(huì)表現(xiàn)出生長(zhǎng)延緩、矮小瘦弱、葉色發(fā)暗易脫落、根系發(fā)育不良等現(xiàn)象，影響農(nóng)產(chǎn)品品質(zhì)。植物主要通過(guò)根部的磷轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白從土壤中吸收磷元素，能被植物吸收的通常是無(wú)機(jī)磷酸鹽，即H2PO4-和HPO42-磷酸鹽離子[3-4]。而磷酸鹽離子易與土壤中的Ca2+、Fe3+、Fe2+、Al3+等離子形成難溶性的磷酸鹽，很難直接被植物吸收利用[5-6]。有研究報(bào)道，土壤中95%以上的磷為植物難以直接利用的無(wú)效磷[7]，我國(guó)約有75%的土壤缺磷[8]。化學(xué)磷肥的使用可以在短期內(nèi)顯著增加土壤有效磷含量，但其中的有效磷很快會(huì)被土壤中的化合物和粘粒吸附和沉淀，從而變成植物難以直接利用的形態(tài)。研究顯示，化學(xué)磷肥當(dāng)季的利用率不到30%，甚至?xí)蚚9]?；瘜W(xué)磷肥的大量使用，不僅增加農(nóng)民投資成本，還會(huì)造成生態(tài)環(huán)境污染。因此，土壤溶磷菌的開(kāi)發(fā)與利用，是安全有效開(kāi)發(fā)土壤磷庫(kù)資源的方式之一?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】根際溶磷菌(Phosphate solubilizing bacteria, PSB)作為有益微生物在植物根際土壤中廣泛存在，其可通過(guò)產(chǎn)生有機(jī)酸和酶，把土壤中不能被植物利用的無(wú)機(jī)或有機(jī)磷轉(zhuǎn)化為植物可利用的有效磷，促進(jìn)植物磷素的供應(yīng)和生長(zhǎng)[10]。朱穎[11]從三葉草根際中分離獲得既能溶解有機(jī)磷又能溶解無(wú)機(jī)磷的溶磷菌株。李顯剛[12]從百脈根和白三葉根際分離的溶磷菌株，對(duì)百脈根及白三葉有促生作用。蔡璐等[13]從白三葉根際獲得溶磷能力較強(qiáng)的菌株，且菌株對(duì)植物生物量提升促進(jìn)效果明顯。程宇陽(yáng)[14]從蘋(píng)果園白三葉根際分離的溶磷菌株，不僅能促進(jìn)白三葉的生長(zhǎng)，還能增加土壤中有效磷含量?！狙芯壳腥朦c(diǎn)】目前報(bào)道的溶磷菌種類(lèi)和數(shù)量較多，但針對(duì)白三葉根際溶磷菌的研究報(bào)道不多。白三葉作為世界上分布最廣的牧草之一，在畜牧業(yè)中占有重要地位，也是貴州省分布較為廣泛的一種天然野生豆科牧草。從野生白三葉根際分離篩選具有溶磷能力的菌株，發(fā)掘適用于本地農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的根際溶磷菌，豐富不同植物根際溶磷菌的研究?！緮M解決的關(guān)鍵問(wèn)題】采集貴州省境內(nèi)不同生境的白三葉根際土壤，從中分離、純化出溶磷細(xì)菌并進(jìn)行分子鑒定，利用培養(yǎng)液溶磷量測(cè)定，篩選出貴州巖溶山區(qū)環(huán)境中溶磷能力強(qiáng)的高效溶磷菌株，為植物根際溶磷菌的開(kāi)發(fā)利用和生態(tài)農(nóng)業(yè)發(fā)展提供資源材料。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 土壤樣品 從貴州省黔南、黔東南、六盤(pán)水和畢節(jié)地區(qū)不同生境的巖溶山區(qū)，按照5點(diǎn)取樣法采集白三葉健康植株根系及附著的根際土壤，常規(guī)方法混合后裝入無(wú)菌封口袋中，帶回實(shí)驗(yàn)室4℃冰箱保存。共采集白三葉根系和根際土壤7份，土壤采集地信息見(jiàn)表1。

表1 土壤采集地的生境信息

1.1.2 培養(yǎng)基 PKO(Pikovaskaia,s)無(wú)機(jī)磷培養(yǎng)基[15]：Ca3(PO4)23.0 g，酵母粉0.5 g， (NH4)2SO4·7H2O 0.2 g，NaCl 0.2 g，KCl 0.2 g，MgSO4·7H2O 0.03 g，MnSO40.03 g，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.003 g，蒸餾水1 000 mL，pH 7.0，固體培養(yǎng)基用于溶磷菌株的分離篩選，液體培養(yǎng)基用于菌株溶磷能力測(cè)定。LB(Luria-Bertani)培養(yǎng)基[16]：牛肉膏10 g，蛋白胨5 g，NaCl 5 g，蒸餾水1 000 mL，pH 7.0，用于菌株的活化及菌種保存。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 白三葉根際溶磷菌的分離 采用PKO(Pikovaskaia,s)無(wú)機(jī)磷培養(yǎng)基分離和篩選根際溶磷菌。取20 g牧草根際土壤(帶根系)，放入無(wú)菌研缽中加少量水進(jìn)行研磨后，采用平板稀釋法進(jìn)行溶磷菌的分離，將土壤懸液按比例稀釋到10-6～10-4后分別涂布到PKO平板上，28℃培養(yǎng)7 d，觀察平板上菌落生長(zhǎng)及菌落周?chē)囵B(yǎng)基透明圈變化情況，挑選培養(yǎng)基透明圈比較明顯的菌落進(jìn)行純化培養(yǎng)，觀察菌株在PKO培養(yǎng)基上的形態(tài)特征。使用LB培養(yǎng)基進(jìn)行菌株擴(kuò)繁，菌株使用25%的甘油，存于2 mL凍存管內(nèi)，放于―20℃冰箱中保存。

1.2.2 溶磷菌株的鑒定 將獲得的溶磷菌株在PKO平板上培養(yǎng)5 d后，送往北京擎科生物科技有限公司昆明測(cè)序部進(jìn)行16S rRNA基因序列測(cè)定，使用通用引物27f(5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′)和1492r(5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′)。將菌株基因序列在NCBI網(wǎng)站上進(jìn)行BLAST序列比對(duì)，尋找相似菌株，對(duì)菌株進(jìn)行初步分類(lèi)鑒定。

1.2.3 高效溶磷菌株的篩選 挑取菌株長(zhǎng)勢(shì)較好的單菌落，在LB培養(yǎng)基中擴(kuò)繁培養(yǎng)5 d，取0.5 mL菌懸液接種到50 mL PKO液體培養(yǎng)基中，接入等量無(wú)菌水作對(duì)照(CK)，每個(gè)菌株設(shè)置3個(gè)重復(fù)，28℃、150 r/min振蕩培養(yǎng)7 d，得到菌株培養(yǎng)液。培養(yǎng)液pH測(cè)定：使用pH計(jì)(PHS-3C，上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司)進(jìn)行培養(yǎng)液測(cè)定；菌株溶磷量測(cè)定：將菌株培養(yǎng)液10 000 r/min、4℃離心15 min，取1 mL上清液，鉬銻抗比色法測(cè)定菌株溶磷量[17]。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用Excel 2010和SPSS 19.0對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 白三葉根際土壤溶磷菌菌株的菌落特征及分子鑒定

從表2可看出白三葉根際土壤溶磷菌的菌落特征和菌株分子鑒定結(jié)果。

表2 溶磷菌菌株的菌落特征與分子鑒定

2.1.1 菌落特征 白三葉根際土壤(PD4、PD5、PD6、PD14、PD17、PD18和PD21)中分離出有溶磷性的菌株14株。菌株在PKO培養(yǎng)基上多為淡黃色、黃色、乳白色、淡褐色的光滑濕潤(rùn)的圓形或不規(guī)則形菌落。

2.1.2 分子鑒定 分離的14株溶磷菌株中有10個(gè)菌株屬于假單胞菌屬(Pseudomonassp.)，2株屬于腸桿菌屬(Enterobactersp.)，1株屬于泛菌屬(Pantoeasp.)。PD21-5在NCBI網(wǎng)站上blast結(jié)果顯示與uncultured bacterium(登錄號(hào)：EU881114.1)相似性為99.63%，僅根據(jù)16S rRNA基因序列分析，暫時(shí)無(wú)法進(jìn)行分類(lèi)地位判斷。

2.2 白三葉根際土壤溶磷菌株的溶磷量及其與培養(yǎng)液pH的相關(guān)性

2.2.1 溶磷量 由表3可知，白三葉根際土壤溶磷菌株的溶磷能力有較大差異，14株菌株的溶磷量在41.96～239.84 μg/mL。其中，PD6-10菌株溶磷量最高，達(dá)239.84 μg/mL；PD6-9菌株其次，為230.40 μg/mL，兩者均極顯著高于其他菌株；PD4-5菌株第三位，為210.48 ug/mL，極顯著高于除PD6-10和PD6-9外的其他菌株；PD4-1和PD4-11菌株也相對(duì)較高，分別為164.06 μg/mL和160.87 μg/mL，極顯著高于除上述菌株外的其余菌株?？傮w看，溶磷量居前三位的菌株分別是PD6-10、PD6-9和PD4-5，溶磷量在210.48～239.84 μg/mL，屬高效溶磷菌株。

表3 白三葉根際土壤溶磷菌株的溶磷量

2.2.2 溶磷量與菌株培養(yǎng)液pH的相關(guān)性 培養(yǎng)7 d后，菌株培養(yǎng)液pH與對(duì)照相比均有所下降，菌株P(guān)D6-9、PD6-10和PD4-5的培養(yǎng)液pH較低，分別為4.04、4.22和4.23，與其他菌株差異顯著。通過(guò)菌株培養(yǎng)液pH與溶磷量的相關(guān)性分析，二者之間呈極顯著負(fù)相關(guān)關(guān)系(P<0.01)。

3 討論

不同土壤不同環(huán)境中溶磷菌的數(shù)量存在很大差異[18]。本研究從野生白三葉根際土壤(PD4、PD5、PD6、PD14、PD17、PD18和PD21)中共分離出14株溶磷細(xì)菌，其中從PD4土樣(新成土)中分離出溶磷菌株4株，分離占比最高，為28.57%。經(jīng)過(guò)16S rRNA基因序列比對(duì)，初步鑒定分離獲得的溶磷菌屬于假單胞菌屬(Pseudomonassp.)、腸桿菌屬(Enterobactersp.)和泛菌屬(Pantoeasp.)均屬已見(jiàn)報(bào)道的溶磷菌種類(lèi)[14]。

溶磷菌株在固體培養(yǎng)基上，溶磷能力受產(chǎn)生有機(jī)酸種類(lèi)和分子擴(kuò)散能力的影響[19]，所以采用液體培養(yǎng)基進(jìn)行定量分析其溶磷能力更科學(xué)合理[20-21]。研究結(jié)果表明，高效溶磷菌PD6-10、PD6-9和PD4-5的溶磷量為210.48～239.84 μg/mL，在相同培養(yǎng)條件和培養(yǎng)時(shí)間下，高效溶磷菌溶磷量高于李顯剛[12]的研究結(jié)果，低于程宇陽(yáng)[14]的研究結(jié)果，菌株溶磷量的高低也受磷源和培養(yǎng)條件的影響。

溶磷菌的溶磷量與培養(yǎng)液pH之間的相關(guān)關(guān)系在不同的研究中結(jié)論不一，楊慧等[22]認(rèn)為，溶磷量與pH之間沒(méi)有相關(guān)性；但NIJKAMP等[23-25]研究顯示，溶磷細(xì)菌通過(guò)產(chǎn)酸從而獲得溶磷能力，認(rèn)可度較高的溶磷機(jī)理是菌株產(chǎn)生有機(jī)酸，通過(guò)羥基與難溶性磷酸鹽上的金屬離子螯合，使難溶性磷轉(zhuǎn)變?yōu)榭扇苄粤譡26]。該研究中細(xì)菌溶磷量與培養(yǎng)液pH呈極顯著負(fù)相關(guān)關(guān)系，說(shuō)明從野生白三葉根際分離出的溶磷菌溶磷能力與細(xì)菌產(chǎn)酸密切相關(guān)，與部分研究者的研究結(jié)論一致。溶磷菌有多種溶磷機(jī)理，產(chǎn)酸是其中的一種，更多種類(lèi)的溶磷機(jī)理有待進(jìn)一步研究。

4 結(jié)論

從貴州省不同生境采集的7份白三葉根際土壤樣品中篩選出根際溶磷菌14株，菌株在PKO培養(yǎng)基上為淡黃色和乳白色光滑濕潤(rùn)的圓形或不規(guī)則形菌落。從中篩選出高效溶磷菌株3株，編號(hào)為PD4-5、PD6-9和PD6-10，均屬于假單胞菌屬(Pseudomonassp.)，其溶磷量分別為210.48 ug/mL、230.40 ug/mL和239.84 ug/mL，其培養(yǎng)液pH分別為4.23、4.04和4.22，菌株溶磷量與培養(yǎng)液pH呈極顯著負(fù)相關(guān)關(guān)系。