不同干燥方法對余甘子抗氧化成分及抑制酪氨酸酶活性的影響

吳 梅， 李樹全， 李小嬌， 趙典遠(yuǎn)， 鄭永仁

(1.云南中醫(yī)藥大學(xué) 中藥學(xué)院/云南省南藥可持續(xù)利用研究重點實驗室， 云南 昆明 650500； 2.云南省高校外用給藥系統(tǒng)與制劑技術(shù)研究重點實驗室， 云南 昆明 650500； 3.云南中醫(yī)藥大學(xué) 科研實驗中心， 云南 昆明 650500)

0 引言

【研究意義】余甘子又名滇橄欖，來源于大戟科(Euphorbiaceae)葉下珠屬植物余甘子(PhyllanthusemblicaL.)的果實，具有清熱涼血、消食健胃、生津止咳之功效[1]。余甘子是印度傳統(tǒng)醫(yī)藥阿育吠陀中最常用的藥漿“三果漿”的原料之一，使用頻率極高，在我國藏醫(yī)藥中亦占有十分重要地位，作為藏族習(xí)用藥材收錄于《中國藥典》，此外亦應(yīng)用于傣族、彝族等10余個少數(shù)民族醫(yī)藥，但在中醫(yī)方劑中較少應(yīng)用，李時珍在《本草綱目》中將其移入果部，多做果品食用[2-3]。余甘子鮮果味酸澀，且極難貯存，冷藏可減緩變質(zhì)，但也只能延長保鮮6～9 d；其常規(guī)干燥方法為曬干，干燥過程中顏色逐漸加深成棕褐色或墨綠色，隨著果實褐變其化學(xué)成分也發(fā)生變化，如沒食子酸的含量逐漸增加[4]。因此，研究余甘子的干燥加工方法對其功能性食品的開發(fā)具有重要意義。【前人研究進展】自由基對生命過程起著重要的調(diào)控作用，過量自由基會引起生物膜及DNA的氧化性損傷，與癌癥、動脈硬化等疾病以及衰老密切相關(guān)，抗氧化物質(zhì)可通過切斷過氧化鏈?zhǔn)椒磻?yīng)而抑制自由基損傷，維生素C及植物多酚是膳食中重要的抗氧化物質(zhì)，廣泛存在于水果、蔬菜及谷物中[5-7]。余甘子是一種營養(yǎng)價值較高的果品，富含維生素C等維生素、有機酸、蛋白質(zhì)、粗纖維以及鎂鉀等礦物質(zhì)，含有豐富的植物多酚，同時余甘子具有較強的清除自由基、抗氧化活性[8-11]。加工方法及貯藏條件均影響余甘子中維生素C、植物多酚的含量，如張福平等[12-13]研究表明，鮮果若不及時干燥，維生素C的含量損失接近70%，低溫貯藏有利于余甘子營養(yǎng)物質(zhì)的保存；徐涓等[14]用高溫蒸汽處理余甘子果汁，可減輕因酶促導(dǎo)致的褐變，減輕維生素C的氧化分解以及多酚類物質(zhì)的氧化聚合?！狙芯壳腥朦c】余甘子干燥方法除直接曬干外，民間亦采用蒸后曬干、冷凍貯藏后再解凍曬干以及去皮后曬干，能減輕果實褐變，但不同干燥方法對余甘子中維生素C、植物多酚含量及抗氧化作用的影響尚不明確?！緮M解決的關(guān)鍵問題】通過測定不同干燥方法加工的余甘子中維生素C、植物多酚含量以及對酪氨酸酶活性的抑制作用，以期建立余甘子科學(xué)、合理的干燥加工方法，為余甘子在功能性食品方面的開發(fā)利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 余甘子 余甘子采自云南省普洱市景谷，經(jīng)鑒定為大戟科植物余甘子(P.emblicaL.)的果實。鮮品去核后，采用以下干燥加工方法：直接曬干，記作PE-曬干；去皮后曬干，記作PE-去皮；冷凍24 h后解凍再曬干，記作PE-凍后；烘干(50℃)，記作PE-烘干；真空冷凍干燥，記作PE-凍干；蒸2 min、8 min或32 min后曬干，分別記作PE-蒸2、PE-蒸8、PE-蒸32。

1.1.2 試劑 沒食子酸對照品(J&K, 純度99%)、維生素C對照品(中國食品藥品檢定研究院，批號：1021H023，純度100%)、曲酸對照品(J&K, 純度99%)、酪氨酸酶(上海源葉，1 240 U/mg)、左旋多巴(Adamas-beta，純度99%)、福林酚試劑乙(上海藍(lán)季生物)、甲醇(Fisher，色譜級)，其他試劑均為分析純，試驗用水為娃哈哈純凈水。

1.1.3 儀器 真空冷凍干燥機(新芝SCIENTZ-30F)、高效液相色譜儀(Waters e2695，配2489UV-Vis 檢測器)、紫外分光光度計(島津UV-2450)、多功能酶標(biāo)儀(TECAN Spark 10 M)、水浴鍋(Leica HI1210)、電子分析天平(島津AUW220D)、超聲波清洗器(昆山禾創(chuàng)KH7200B，400 W，40 kHz)。

1.2 方法

1.2.1 余甘子總多酚含量測定 采用福林酚比色法測定總多酚含量[15]。

1) 系列標(biāo)準(zhǔn)溶液的制備。參考《茶葉中茶多酚和兒茶素類含量的檢測方法》(GB/T 8313—2008)，取適量沒食子酸對照品，精密稱定，加50%甲醇溶解，配制成濃度分別為5.28 mg/L、10.56 mg/L、21.12 mg/L、31.68 mg/L、42.24 mg/L、52.80 mg/L的系列標(biāo)準(zhǔn)溶液。

2) 供試品溶液的制備。精密稱定供試品粉末50 mg，置具塞錐形瓶中，精密加入50 mL 50%甲醇，稱定重量，水浴回流1 h，放冷，用50%甲醇補足質(zhì)量，搖勻，過濾，取續(xù)濾液，即得。

3) 測定方法。分別精密吸取系列標(biāo)準(zhǔn)溶液與供試品溶液各1 mL至具塞試管中，加10%福林酚試劑5 mL搖勻，靜置5 min后，再加入7.5%碳酸鈉溶液4 mL搖勻，室溫下避光靜置1 h后，在波長765 nm處測定吸光度，按干燥品計算總多酚含量。

1.2.2 余甘子維生素C含量測定 參照文獻[16]的方法適當(dāng)調(diào)整。

1) 色譜條件。采用Inertsil ODS-SP色譜柱(4.6 mm × 250 mm，5 μm)；以甲醇-0.15 mmol/L磷酸二氫鉀溶液(5∶95)為流動相；檢測波長為243 nm；流速0.4 mL/min；柱溫30℃。

2) 對照品溶液的制備。精密稱取維生素C對照品，用6% 醋酸(冷新沸水配制)溶解，制成每1 mL中含有維生素C 80 μg，臨用前配制。

3) 供試品溶液的制備。精密稱定供試品粉末0.1 g，置具塞錐形瓶中，精密加入6% 醋酸50 mL，稱定重量，超聲處理20 min(控制溫度<10℃)，用6%醋酸補足質(zhì)量，搖勻，過0.45 μm微孔濾膜，取續(xù)濾液，即得。

4) 測定方法。分別精密吸取對照品溶液與供試品溶液各5～10 μL，注入液相色譜儀，測定，按干燥品計算維生素C的含量。

1.2.3 余甘子抗氧化活性測定 采用酪氨酸酶活性抑制試驗評價抗氧化活性[17]。

1) 對照品溶液的制備。精密稱取曲酸對照品，用磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液(pH 6.8)溶解，逐級稀釋成1 mg/mL、0.2 mg/mL、0.04 mg/mL、0.008 mg/mL系列濃度，臨用前配制，用于試驗有效性驗證。

2) 供試品溶液的制備。精密稱定供試品粉末1 g，置具塞錐形瓶中，精密加入50 mL水，稱定重量，超聲處理20 min(控制溫度<10℃)，用水補足質(zhì)量，搖勻，過0.45 μm微孔濾膜，取續(xù)濾液，再逐級稀釋，制成20 mg/mL、10 mg/mL、5 mg/mL、2.5 mg/mL系列濃度。

3) 測定方法。精密吸取樣品溶液、磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液(pH 6.8)及酪氨酸酶溶液(100 U/mL)充分混勻(表1)，置37℃水浴孵育10 min，再加入左旋多巴溶液(1 mg/mL)，反應(yīng)5 min，在475 nm處測定吸光度。

表1 酪氨酸酶活性測定反應(yīng)液配比

酪氨酸酶活性抑制率=[1-(T-T0)/(C-C0)]×100%

1.3 數(shù)據(jù)分析

采用單因素方差分析(ANOVA)及Tukey多重比較分析數(shù)據(jù)間顯著性差異；Probit回歸分析估計酪氨酸酶活性抑制作用的IC50(95%置信限)；相關(guān)性分析采用 Spearman檢驗，檢驗水準(zhǔn)P<0.05。以上數(shù)據(jù)均使用SPSS 17.0進行統(tǒng)計分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 余甘子總多酚的含量

由圖1可見，建立沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線，線性回歸方程為y= 0.008 4x+ 0.056 3(R2=0.999 2)，沒食子酸為5.28～52.80 mg/L，線性關(guān)系良好。

由表2可見，不同干燥方法加工的余甘子中總多酚含量均較高，其中，真空冷凍干燥的余甘子中總多酚含量最高，達37.39 mg/g，冷凍24 h后解凍再曬干的余甘子總多酚含量最低，僅23.78 mg/g，與其他干燥方式有顯著性差異；直接曬干、去皮曬干、蒸后曬干及烘干等方法間無顯著性差異，總多酚含量為28.60～30.74 mg/g(F7,16=73.21，P<0.05)。

圖 1 沒食子酸的標(biāo)準(zhǔn)曲線

表2 不同干燥方法處理余甘子總多酚、維生素C含量及酪氨酸酶的活性

2.2 余甘子維生素C的含量

2.2.1 方法學(xué)考察

1) 系統(tǒng)適應(yīng)性試驗。經(jīng)測定，色譜峰分離度良好(R>1.5)，理論塔板數(shù)大于3 000，符合含量測定要求(圖2)。

注：A,陰性對照；B,維生素C對照品；C,供試品。

2) 線性關(guān)系。經(jīng)測定，以峰面積為縱坐標(biāo)(y)、進樣量(μg)為橫坐標(biāo)(x)，線性回歸方程為y= 8×106x+ 52 897(R2=0.999 6)，維生素C為0.025～1.242 μg，線性關(guān)系良好。

3) 精密度試驗。相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為0.42%(n=6)，表明儀器精密度良好。

4) 穩(wěn)定性試驗。RSD為2.97%(n=6)，表明樣品溶液在室溫下放置7 h內(nèi)穩(wěn)定。

5) 重復(fù)性試驗。RSD為2.07%(n=6)，表明該方法重復(fù)性好。

6) 加樣回收率試驗。平均加樣回收率為94.8%，RSD為2.61%(n=9)，表明該方法準(zhǔn)確可靠。

2.2.2 維生素C含量 由表2可見，不同干燥方法對余甘子中維生素C的含量有顯著性影響(F7,16=394.57，P<0.05)，其中，真空冷凍干燥的維生素C含量最高，達20.44 mg/g；直接曬干的為17.33 mg/g，去皮曬干、烘干與其無顯著性差異；冷凍24 h后解凍再曬干的維生素C含量僅14.75 mg/g，與上述干燥方法有顯著性差異；蒸后曬干的維生素C含量顯著下降，為10.51～10.78 mg/g，蒸2 min、8 min、32 min后曬干間無顯著性差異。

2.3 余甘子的抗氧化活性

2.3.1 有效性驗證 陽性對照曲酸抑制酪氨酸酶活性的IC50為0.076 mg/mL，在有效范圍0.05～0.15 mg/mL內(nèi)，表明該試驗體系有效。

2.3.2 酪氨酸酶活性 由表2可見，不同方法干燥余甘子均具有抑制酪氨酸酶活性的作用，其中，直接曬干和真空冷凍干燥的余甘子抑制作用的IC50分別為9.8 mg/mL和10.3 mg/mL，而蒸2 min后曬干、蒸8 min后曬干、蒸32 min后曬干、冷凍24 h后解凍再曬干的IC50>12 mg/mL。抑制作用為直接曬干>真空冷凍干燥>去皮后曬干>50℃烘干>蒸32 min后曬干>蒸2 min后曬干>冷凍24 h后解凍再曬干>蒸8 min后曬干。

2.4 余甘子中維生素C、總多酚及酪氨酸酶活性抑制作用間的相關(guān)性

經(jīng)相關(guān)性分析，余甘子中維生素C含量與總多酚含量間無顯著相關(guān)性(r=0.567，P>0.05)；余甘子中維生素C含量與酪氨酸酶活性抑制作用間呈正相關(guān)性(r=0.816，P<0.05)；余甘子中總多酚含量與酪氨酸酶活性抑制作用間無顯著相關(guān)性(r=0.570，P>0.05)。

3 討論

余甘子可用干品或鮮食，但鮮果與干果的化學(xué)成分有顯著差異，主要是鞣質(zhì)類成分，其干燥過程、貯藏過程及含量測定的提取環(huán)節(jié)等導(dǎo)致大分子鞣質(zhì)水解或縮合，如訶黎勒酸水解產(chǎn)生柯里拉京和訶子次酸，而柯里拉京又可繼續(xù)水解生成沒食子酸和鞣花酸，干果(不包括真空冷凍干燥)中沒食子酸、鞣花酸等小分子鞣質(zhì)的含量遠(yuǎn)高于鮮果[18-20]。余甘子主要有效成分為沒食子酸、鞣花酸及柯里拉京[21-22]。因此，本研究中雖然真空冷凍干燥的余甘子中維生素C及總多酚的含量均最高(與鮮果成分相近)，但抑制酪氨酸酶活性作用卻略弱于直接曬干的余甘子。毛正睿[23]研究表明，熱風(fēng)烘干、自然風(fēng)干與真空冷凍干燥的余甘子均具有較強的羥基自由基清除作用；熱風(fēng)烘干、自然風(fēng)干對a-淀粉酶活性的抑制作用明顯強于真空冷凍干燥。余甘子具有清熱利咽、調(diào)節(jié)口腔微生態(tài)、促腸蠕動緩解便秘及抗氧化延緩衰老等作用[24-27]，在功能性食品領(lǐng)域有廣闊市場，在開發(fā)不同保健功能時使用干鮮果應(yīng)有所選擇。

余甘子果核中主要含有脂肪酸類成分，鞣質(zhì)含量遠(yuǎn)低于果肉，且抗氧化作用遠(yuǎn)不及果肉[28]。故本試驗均采用去核后再干燥的加工方式，一定程度提高了干燥效率。直接曬干是最常用的干燥方法，簡便經(jīng)濟，但果實表面顏色較深；去皮后再曬干的余甘子表面產(chǎn)生1層白霜，干后顏色較淺且澀味減弱；烘干(50℃)的干燥效率較高，口感上有較強膠質(zhì)感。上述3種方法加工的余甘子在維生素C及總多酚含量上均無顯著性差異。本試驗中冷凍24 h后解凍再曬干的余甘子顏色較淺，但在維生素C及總多酚含量上均有顯著降低，不適合作為余甘子的干燥方法；蒸會導(dǎo)致余甘子中維生素C的含量顯著降低，雖然余甘子所含豐富的有機酸及多酚類成分有利于維生素C的穩(wěn)定，直接曬干、去皮曬干及烘干(50℃)的余甘子中維生素C較真空冷凍干燥約降低15%，但仍對高溫敏感。不同干燥方式對余甘子化學(xué)成分及功效的影響還有待進一步深入研究。

4 結(jié)論

真空冷凍干燥、直接曬干、去皮后曬干及烘干(50℃)的余甘子中均含有豐富的維生素C及總多酚，其中，真空冷凍干燥的含量最高；以對酪氨酸酶活性抑制作用的強弱為評價指標(biāo)，直接曬干及真空冷凍干燥是余甘子最佳的干燥方法，維生素C含量與抑制作用的強弱正相關(guān)。