煙草靶斑病病原生物學(xué)與綜合防控措施研究進(jìn)展

祖慶學(xué) 張翼飛 馮裕洋

（貴陽市煙草公司開陽縣分公司，貴州開陽 550300）

煙草靶斑病（tobacco target spot）由立枯絲核菌（Rhizoctonia solani）引起，因在煙草葉片上產(chǎn)生環(huán)帶狀壞死斑點(diǎn)而得名，最早于20 世紀(jì)初在美國煙區(qū)被發(fā)現(xiàn)[1]。該病害給許多國家的煙草生產(chǎn)造成了危害和損失[2-3]。20 世紀(jì)末，在我國還未發(fā)現(xiàn)有煙草靶斑病發(fā)生時(shí)[4]，煙草病理學(xué)專家談文教授就專門介紹了這種病害在國外暴發(fā)流行的情況[3]。 21 世紀(jì)初，吳元華等[5]在遼寧丹東煙區(qū)進(jìn)行了煙草靶斑病的調(diào)查和系統(tǒng)性的鑒定工作，完成了該病害在我國的最早報(bào)道。隨后在廣西煙區(qū)病害調(diào)查過程中，在百色、河池和賀州等地的煙草上均發(fā)現(xiàn)了靶斑病[6]。針對(duì)我國煙草上發(fā)生的這種新病害，孫宏宇[7]就煙草靶斑病的流行條件和防治技術(shù)措施進(jìn)行了專題綜述，為該病害的防控提供了指導(dǎo)。在這之后，吉林[8]、黑龍江[8]、云南[9]、湖南[10]等煙區(qū)也都先后發(fā)現(xiàn)了靶斑病，涵蓋了我國大部分煙葉生產(chǎn)區(qū)。 各地針對(duì)這種病害的病原學(xué)和綜合防治技術(shù)措施開展了大量富有成效的工作，積累了寶貴的經(jīng)驗(yàn)。

立枯絲核菌寄主范圍很廣，包括了茄科的煙草、茄子、番茄、辣椒，其他科屬的黃瓜、西瓜、葫蘆、白菜、甜菜等多種農(nóng)作物以及一些種類的雜草[2，11-13]。該病原菌可以在煙草的所有生長階段侵染植株[2-3]，還可以引起苗期立枯病[7]。立枯絲核菌具有生活史比較特殊、遺傳分化比較復(fù)雜等特點(diǎn)[1]，且煙草靶斑病的田間癥狀還與部分葉斑病等病害存在相似性，這都給靶斑病鑒定識(shí)別和防控增加了難度。 本文從煙草靶斑病的識(shí)別鑒定、病原生物學(xué)、發(fā)生流行規(guī)律與綜合防控措施等4 個(gè)方面歸納總結(jié)了國內(nèi)外煙草靶斑病的相關(guān)研究，對(duì)相關(guān)方面仍不明確的方向進(jìn)行了討論與展望，以期為煙草靶斑病的快速準(zhǔn)確識(shí)別與高效綠色防控提供指導(dǎo)，為我國各煙區(qū)煙葉生產(chǎn)工作與立枯絲核菌生物學(xué)研究等提供參考。

1 煙草靶斑病的識(shí)別鑒定

立枯絲核菌侵染葉片組織的最初病狀是形成一個(gè)直徑2~3 mm 的圓形壞死斑點(diǎn)，對(duì)著光線能夠呈現(xiàn)出網(wǎng)格結(jié)構(gòu)[3，11]。 在適宜的條件下，部分壞死斑點(diǎn)會(huì)隨著病原菌侵染的加劇而擴(kuò)展為5 cm 左右的大病斑，外形不規(guī)則，深褐色，具有明顯的同心輪紋狀結(jié)構(gòu)。大病斑中心部分殘余葉片組織相對(duì)薄脆，容易脫落，使整個(gè)病斑如同子彈穿孔過的靶紙，因而該病得名“靶斑病”[2-3，11]。 但是，赤星病等幾種真菌性葉斑病中晚期的病狀也可以出現(xiàn)同心輪紋病斑，容易造成田間識(shí)別的混淆。 Shew 等[2]比較了2 種煙草葉斑病的病狀，發(fā)現(xiàn)靶斑病的初侵染圓斑非常明顯，即使在壞死區(qū)域進(jìn)一步擴(kuò)大之后也能夠看到殘留的痕跡，成為區(qū)別靶斑病與赤星病的重要依據(jù)。靶斑病壞死病斑的周圍具有一層黃色暈圈，是病原菌繼續(xù)侵染的表現(xiàn)[11]，該黃色暈圈在病原菌侵染初期、壞死病斑還是小圓形時(shí)期就存在，是靶斑病區(qū)分氣候斑等非侵染性病害的主要指標(biāo)。在條件適宜的情況下，煙草靶斑病壞死病斑正反兩面都會(huì)被一層白色絲狀菌絲覆蓋，覆蓋的密度和范圍存在差異，是該病害的重要病征[5]。 在煙草植株上，靶斑病的發(fā)生集中在中下部葉片上，當(dāng)然也會(huì)因條件適宜向上部葉片傳播，可以達(dá)到約1.5 m 的高度[14]。 另外，立枯絲核菌還可以侵染煙草幼苗的根或莖基部，造成潰瘍狀壞死、斷裂，進(jìn)一步導(dǎo)致苗床大面積猝倒，這個(gè)類型的癥狀被歸為煙草立枯病。 煙草立枯病是該病原菌引起的另一種主要的煙草病害，該病害與靶斑病的發(fā)生既有聯(lián)系又有區(qū)別。

在光學(xué)顯微鏡下觀察煙草靶斑病產(chǎn)生的白色絲狀物病征，可以很清楚地觀察到立枯絲核菌粗壯的菌絲，寬度約10 μm；菌絲分枝的部位往往非常接近直角，分枝點(diǎn)外部有一定程度的縊縮；菌絲隔膜明顯，產(chǎn)生在分枝點(diǎn)附近，但不是在直接分枝的縊縮部位，這種“T”形菌絲分枝結(jié)構(gòu)是立枯絲核菌重要的形態(tài)學(xué)鑒定指標(biāo)[12]，也是靶斑病鑒定過程中顯微鏡觀察檢測(cè)的重點(diǎn)對(duì)象。另外，在靶斑病病斑處還能觀察到立枯絲核菌的子實(shí)體。 立枯絲核菌擔(dān)子梗的尺寸同普通菌絲接近，頂部膨大的擔(dān)子寬度可達(dá)14 μm[5]，擔(dān)子的頂端著生4 個(gè)無色長橢圓形擔(dān)孢子（4.0~5.5 μm×7.0~10.0 μm）[1]。

隨著分子生物學(xué)手段的日漸成熟，轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)間（internal transcribed spacer，簡稱ITS）等分子標(biāo)記被應(yīng)用到煙草靶斑病的病原菌鑒定中，成為傳統(tǒng)形態(tài)學(xué)識(shí)別鑒定的重要補(bǔ)充[13，15]。 在此基礎(chǔ)上，我國的研究人員開發(fā)了一系列基于分子生物學(xué)工具的靶斑病快速檢測(cè)手段。肖艷松等[10]針對(duì)立枯絲核菌ITS 區(qū)域的特異性片段設(shè)計(jì)了引物， 使用該特異性引物，根據(jù)PCR 反應(yīng)的產(chǎn)物條帶大小就可確定種類，節(jié)省了ITS 片段序列測(cè)定與數(shù)據(jù)庫比對(duì)的時(shí)間和成本。趙艷琴等[16]利用TaqMan 探針技術(shù)，針對(duì)立枯絲核菌的ITS 分子標(biāo)記，實(shí)現(xiàn)了對(duì)土壤中病殘?bào)w的檢測(cè)；由于結(jié)合了實(shí)時(shí)定量PCR 技術(shù)，該檢測(cè)手段還可以對(duì)病殘?bào)w含量實(shí)現(xiàn)定量分析，初步揭示了靶斑病病殘?bào)w的存留規(guī)律。

2 煙草靶斑病的病原生物學(xué)

煙草靶斑病的病原菌是立枯絲核菌（Rhizoctonia solani），最早由德國科學(xué)家Kühn 在1858 年描述建立。根據(jù)其有性世代擔(dān)子與擔(dān)孢子的形態(tài)結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，該病原菌一度被稱作瓜亡革菌（Thanatephorus cucumeris）[1，5]。目前，國際真菌分類系統(tǒng)（Index Fungorum）采用了立枯絲核菌（Rhizoctonia solani）這一名字來命名該病原菌。 經(jīng)過許多科學(xué)家的補(bǔ)充完善，Sneh 等[17]系統(tǒng)性地總結(jié)完善了立枯絲核菌的一系列分類特點(diǎn)，包括菌絲含褐色素、具有“T”形分枝結(jié)構(gòu)、尖端含有多個(gè)細(xì)胞核以及桶孔隔膜等。 根據(jù)形態(tài)特點(diǎn)和分子標(biāo)記的系統(tǒng)進(jìn)化分析， 立枯絲核菌被歸屬到擔(dān)子菌門（Basidiomycota）雞油菌目（Cantharellales）角擔(dān)菌科（Ceratobasidiaceae）[18]。 立枯絲核菌在馬鈴薯葡萄糖瓊脂（potato dextrose agar，簡稱PDA）培養(yǎng)基上的菌落培養(yǎng)4 d 之后就會(huì)出現(xiàn)淺褐色，菌落周邊的菌絲有輕微的色帶，但是培養(yǎng)基上沒有變色的暈圈[10，19]，這也是該病原菌識(shí)別鑒定的一個(gè)指標(biāo)。 人工培養(yǎng)基上的生長試驗(yàn)結(jié)果表明，立枯絲核菌營養(yǎng)生長的適宜條件為常溫（25 ℃）、中性（pH 值=7）、黑暗和高濕度[20]。 立枯絲核菌可以產(chǎn)生深褐色菌核，人工培養(yǎng)基上的生長試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，立枯絲核菌產(chǎn)生菌核的適宜條件為略偏酸性（pH 值5~7）、高濕度（相對(duì)濕度90%）和黑暗[20]。 立枯絲核菌在適宜的條件下可進(jìn)行有性生殖，產(chǎn)生子實(shí)體。該病原菌的子實(shí)體是擔(dān)子與擔(dān)孢子，可以在葉片病斑中產(chǎn)生，也可以在土壤表面的營養(yǎng)物質(zhì)中產(chǎn)生[3]。立枯絲核菌產(chǎn)生子實(shí)體的過程在人工培養(yǎng)條件下不太容易發(fā)生[1]，一些研究指出，培養(yǎng)基的堿性條件和培養(yǎng)環(huán)境中二氧化碳富集是立枯絲核菌完成有性生殖的關(guān)鍵[21]。

菌絲融合（hyphal anastomosis）是絲狀真菌普遍發(fā)生的現(xiàn)象，具有一定的遺傳物質(zhì)交流的功能。 Parmeter 等[22]利用立枯絲核菌的菌絲融合現(xiàn)象對(duì)該類群進(jìn)行了劃分，建立了菌絲融合群（anastomosis group，簡稱AG）的體系。Ogoshi[23]與Sneh 等[17]又先后對(duì)立枯絲核菌菌絲融合群的體系進(jìn)一步完善，基本明確了各個(gè)融合群的范圍。病害研究中，通常采用載玻片定位融合法來觀察立枯絲核菌菌絲融合現(xiàn)象， 即將標(biāo)準(zhǔn)融合群菌株與待測(cè)菌株在放有載玻片的培養(yǎng)基上對(duì)峙培養(yǎng)，屬于相同融合群菌株的菌絲接觸之后，可以在顯微鏡下觀察到細(xì)胞壁溶解與細(xì)胞質(zhì)融合的現(xiàn)象，比較典型的融合反應(yīng)還包括了細(xì)胞核的流動(dòng)[13]。進(jìn)入21 世紀(jì)，ITS 分子標(biāo)記也被應(yīng)用到立枯絲核菌菌絲融合群體系區(qū)分中[15]，并且能夠與多個(gè)融合群的鑒定結(jié)果相匹配[1]，給融合群的鑒定提供了便利。另外，在部分融合群的鑒定中，一些傳統(tǒng)的菌絲融合不明顯的類別也可通過ITS 的序列分析進(jìn)行完善[24]。González-García 等[12]結(jié)合分子標(biāo)記系統(tǒng)發(fā)育理論更新了立枯絲核菌融合群劃分體系，對(duì)相關(guān)的劃分依據(jù)也進(jìn)行了完善。

煙草靶斑病一些比較久遠(yuǎn)的報(bào)道沒有進(jìn)行菌絲融合群的劃分[11]。 開展相關(guān)的分析之后，美國煙區(qū)早期報(bào)道的幾例立枯絲核菌根據(jù)菌絲融合反應(yīng)被鑒定為融合群AG-2-2[11]，后續(xù)一些研究中分離到的融合群也是這個(gè)融合群[24-25]。 最早被鑒定為融合群AG-3的立枯絲核菌是在南非煙區(qū)分離得到的煙草靶斑病的病原菌[14]。 隨后，在美國煙區(qū)也根據(jù)菌絲融合反應(yīng)鑒定到了融合群AG-3[19]，并且該融合群的發(fā)生也出現(xiàn)了上升趨勢(shì)[26-27]。 近年來，阿根廷煙區(qū)靶斑病病原菌先后鑒定出了融合群AG-2-1[28]和AG-4[29]，具有一定的獨(dú)特性。在我國煙區(qū)，遼寧省的丹東和鐵嶺煙區(qū)分離得到的病原菌根據(jù)菌絲融合反應(yīng)和ITS 分子標(biāo)記被鑒定為融合群AG-3，開啟了我國立枯絲核菌融合群歸屬問題的研究[30]。 在這之后，在東北地區(qū)吉林通化煙區(qū)、黑龍江哈爾濱和牡丹江煙區(qū)[8]與西南地區(qū)云南臨滄和普洱煙區(qū)[9]，也分離得到并鑒定出了屬于融合群AG-3 的立枯絲核菌菌株，確定了這一融合群在我國分布范圍廣泛。除此之外，我國煙區(qū)也有其他融合群的報(bào)道。廣西壯族自治區(qū)百色、河池和賀州煙區(qū)分離得到的引起靶斑病的立枯絲核菌，經(jīng)過與標(biāo)準(zhǔn)菌絲融合和ITS 序列分析發(fā)現(xiàn)，屬于融合群AG-2-2 和AG-4，這2 種融合群在我國其他地區(qū)還沒有被報(bào)道[6，31]。

3 煙草靶斑病的發(fā)生流行規(guī)律

煙草靶斑病具有潛育期短、流行速度快的特點(diǎn)，在環(huán)境條件適宜時(shí)可以反復(fù)侵染、大面積傳播，造成嚴(yán)重危害[5]。 立枯絲核菌主要在土壤中完成越冬。 根據(jù)目前的研究，立枯絲核菌在土壤中的殘留可歸納為3 種形式。 一是立枯絲核菌寄主范圍較廣[12，20]，除了煙草外，還有多種煙草產(chǎn)區(qū)常見的農(nóng)作物和煙田周邊容易出現(xiàn)的雜草等可以作為立枯絲核菌的寄主，使其完成越冬存留的過程。 二是立枯絲核菌在不利環(huán)境條件下可以產(chǎn)生結(jié)構(gòu)堅(jiān)固、抗逆性強(qiáng)的菌核結(jié)構(gòu)，能在土壤中存活比較長的時(shí)間。三是立枯絲核菌也可營腐生生活，直接利用土壤中的有機(jī)質(zhì)存活[1]。Gutierrez 等[32]研究發(fā)現(xiàn)，栽種過前茬感病煙株的器皿約84%存在立枯絲核菌的病殘?bào)w，其中約63%的器皿病殘?bào)w可以存活1 年，這些病殘?bào)w主要包括了休眠菌絲和菌核，平均殘留深度約為1 cm。存活下來的休眠菌絲和菌核在條件適宜的情況下可于土壤表面或者病殘?bào)w周圍發(fā)育出子實(shí)體，產(chǎn)生擔(dān)孢子，完成侵染循環(huán)的初侵染過程。

立枯絲核菌侵染煙草葉片主要是采取直接侵入的方式。 首先，擔(dān)孢子在煙草葉片表面萌發(fā)，產(chǎn)生一根芽管和吸器，穩(wěn)定地附著到葉片表面。 然后，立枯絲核菌突破煙葉表面的角質(zhì)層和表皮組織的細(xì)胞壁，侵入表皮組織細(xì)胞中，并形成一團(tuán)具有不同形狀和大小的侵染體[12]。 在這個(gè)過程中，立枯絲核菌會(huì)產(chǎn)生大量蛋白酶、幾丁質(zhì)酶、糖苷酶和磷脂酶等胞外水解酶，協(xié)助直接侵入過程[33]。 立枯絲核菌的菌絲直接從氣孔侵入的過程也被觀察到[25]。在田間人工接種立枯絲核菌擔(dān)孢子的試驗(yàn)表明，煙草葉片在侵染12 h后就可以產(chǎn)生初侵染病斑[34]。 立枯絲核菌的侵染體在條件適宜的情況下，會(huì)進(jìn)一步向周邊組織逐步擴(kuò)散：在微觀層面上，是周邊組織細(xì)胞質(zhì)基質(zhì)成分發(fā)生變化，導(dǎo)致葉肉細(xì)胞壞死；在宏觀層面上，表現(xiàn)為葉肉組織分批壞死，最終形成同心輪紋狀壞死病斑[12]。劉欣茹等[34]開展連續(xù)觀察試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，煙草靶斑病病斑從發(fā)生到最終形成穿孔需要7~8 d。煙草靶斑病病斑上發(fā)育的子實(shí)體可以產(chǎn)生擔(dān)孢子，完成侵染循環(huán)的再侵染過程。

國內(nèi)多項(xiàng)研究表明，煙草靶斑病發(fā)生與發(fā)展適宜的環(huán)境條件是高濕度，其發(fā)生往往與煙區(qū)連續(xù)降雨有關(guān)。美國煙區(qū)20 世紀(jì)80 代中期靶斑病大流行，推測(cè)同前一年夏天的極端暴雨天氣存在關(guān)聯(lián)[11]。 我國遼寧煙區(qū)21 世紀(jì)初首次報(bào)道靶斑病的案例中，煙區(qū)也出現(xiàn)了生長季節(jié)降水多、田間相對(duì)濕度高的情況[5]。 劉欣茹等[34]在云南煙區(qū)開展的擔(dān)孢子接種試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，擔(dān)孢子在相對(duì)濕度100%的情況下可以很快地完成侵染過程。 曹哲銘等[35]在吉林煙區(qū)開展了靶斑病流行規(guī)律分析，通過使用數(shù)學(xué)模型擬合病情指數(shù)隨時(shí)間發(fā)展的變化趨勢(shì)發(fā)現(xiàn)，體現(xiàn)病害較快增長的邏輯斯蒂模型（logistic model）最符合靶斑病的發(fā)生規(guī)律。根據(jù)相關(guān)系數(shù)分析，吉林煙區(qū)5 月和6 月的降雨量和濕度是影響靶斑病流行最重要的指標(biāo)。

4 煙草靶斑病的綜合防控措施

美國煙區(qū)開展的大批量煙草種質(zhì)資源篩選試驗(yàn)表明，煙草對(duì)立枯絲核菌的抗病性有限，可以選用的抗病品種不多[36]，因而農(nóng)業(yè)防治是病害綜合防控的重要組成部分。目前，國內(nèi)外主要的煙草種植產(chǎn)區(qū)均進(jìn)行煙苗的培育和移栽，育苗設(shè)備和基質(zhì)（尤其是連續(xù)使用的設(shè)備和基質(zhì)）必須經(jīng)過充分消毒才能最大限度地避免病殘?bào)w的留存[32]。 土壤改良也是破壞靶斑病田間流行循環(huán)的手段[37]。 在阿根廷煙區(qū)，根據(jù)病情指數(shù)的記錄和實(shí)時(shí)定量PCR 的測(cè)定發(fā)現(xiàn)，使用桉樹枝條誘集、換用不發(fā)病田塊和非農(nóng)業(yè)用地田塊的土壤就可以有效抑制靶斑病的發(fā)生。 這個(gè)現(xiàn)象可能與土壤中有機(jī)質(zhì)與拮抗細(xì)菌的含量相關(guān)[38]。

化學(xué)農(nóng)藥的使用仍然是煙草靶斑病最為有效的防控方式[1]。 孫宏宇[7]在我國煙草靶斑病開始被發(fā)現(xiàn)時(shí)就專題綜述了國外已經(jīng)開展的一些化學(xué)防治技術(shù)。在這之后，我國遼寧煙區(qū)也開展了許多藥效試驗(yàn)，取得了大量成果。 國內(nèi)煙草靶斑病被報(bào)道之后，伏 穎等[39]選用10 種殺菌劑進(jìn)行立枯絲核菌的室內(nèi)毒力測(cè)定，結(jié)果表明，烯唑醇的抑菌效果最好，其他4 種藥劑也表現(xiàn)出了一定的抑菌效果。 在遼寧煙區(qū)，50%腐霉利·噁霉靈800 倍液對(duì)煙草靶斑病能達(dá)到60%的相對(duì)防效，相關(guān)配方也已優(yōu)化出來[40]；間隔7 d 施用2 次苯醚甲環(huán)唑·丙環(huán)唑和20%噻氟酰胺能達(dá)到70%以上的相對(duì)防效[41]。 這些藥效試驗(yàn)的結(jié)果值得我國各地?zé)焻^(qū)在靶斑病防治時(shí)借鑒。

許多研究表明，一些物理防治和生物防治方法也具有良好的煙草靶斑病防控效果。在美國煙區(qū)，干熱風(fēng)（70~80 ℃）處理可以達(dá)到很好的苗床消毒效果，基本能夠消除立枯絲核菌[32]。 在津巴布韋，從土壤中篩選出的哈茨木霉（Trichoderma harzianum）菌株T77被擴(kuò)繁之后添加到化學(xué)殺菌劑中控制苗期的立枯絲核菌[42]。 從我國遼寧煙區(qū)的植煙土壤中分離篩選到的灰色鏈霉菌（Streptomyces griseus）菌株S128 經(jīng)過擴(kuò)大發(fā)酵之后對(duì)立枯絲核菌具有同商業(yè)菌株接近的抑菌效果[43]，另一株淀粉酶產(chǎn)色鏈霉菌（S.diastatochromogenes）菌株TA1123 抑菌活性物質(zhì)的代謝過程也得到了研究[44]。生物農(nóng)藥嘧肽霉素和多抗霉素的復(fù)配液（1.8%）可以顯著抑制立枯絲核菌菌絲的生長，通過電導(dǎo)率測(cè)定，基本揭示了生物農(nóng)藥對(duì)病原菌細(xì)胞膜通透性產(chǎn)生負(fù)面影響的作用機(jī)理[45]。

5 展望

煙草靶斑病于21 世紀(jì)初在我國被發(fā)現(xiàn)之后，在遼寧、吉林、黑龍江、廣西、云南和湖南等煙區(qū)都有發(fā)生。 在國外開展的煙草靶斑病的流行條件和防治技術(shù)措施等相關(guān)研究的基礎(chǔ)上[7]，我國煙區(qū)也積累了許多關(guān)于病原學(xué)與綜合防控措施的成果。目前，立枯絲核菌的侵染與傳播途徑基本明確，流行暴發(fā)所適合的高濕度條件在國內(nèi)外煙區(qū)的研究成果中也吻合，極端天氣之后的預(yù)防性施藥應(yīng)該是防治的重要節(jié)點(diǎn)。 立枯絲核菌的融合群分化具有一定的寄主傾向性[20]，目前在國內(nèi)外的分布規(guī)律也不完全一致，引起煙草靶斑病和煙草立枯病的融合群也存在著一些差異[19]，成為相關(guān)領(lǐng)域深入研究的一個(gè)方向。另外，我國遼寧等煙區(qū)篩選出若干對(duì)靶斑病防控效果明顯的低毒殺菌劑，值得其他地區(qū)借鑒，而篩選的生防劑型成為綠色防控的重要組成部分。在煙葉生產(chǎn)中，靶斑病應(yīng)與赤星病等其他真菌類葉斑病害統(tǒng)防統(tǒng)治。