結(jié)直腸癌免疫微環(huán)境及免疫治療策略的研究進(jìn)展*

楊長江，趙龍，林易霖，葉穎江，王杉，申占龍

北京大學(xué)人民醫(yī)院胃腸外科/北京大學(xué)人民醫(yī)院外科腫瘤研究室/北京市結(jié)直腸癌診療研究重點實驗室 北京 100044

結(jié)直腸癌（colorectal cancer，CRC）是嚴(yán)重危害人類健康的常見消化道惡性腫瘤，目前已成為全球第二大癌癥死亡原因[1]。結(jié)直腸癌傳統(tǒng)的治療方式包括手術(shù)治療、化療和放療。近年來，通過重新激活宿主免疫系統(tǒng)對惡性腫瘤細(xì)胞殺傷能力的免疫治療在腫瘤治療領(lǐng)域取得了令人矚目的成績。其中，程序性細(xì)胞死亡蛋白1（programmed death protein-1，PD-1）、程序性細(xì)胞死亡配體1（programmed death ligand-1，PD-L1）以及細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞相關(guān)抗原4（cytotoxic T-lymphocyte-associated antigen-4，CTLA-4）等的免疫檢查點抑制劑（immune checkpoint inhibitors，ICIs）在晚期結(jié)直腸癌的治療中已顯示出顯著的益處[2]。目前，納武利尤單抗、帕博利珠單抗等ICIs已獲批用于治療DNA錯配修復(fù)缺陷（mismatch repair-deficient，dMMR）及微衛(wèi)星高度不穩(wěn)定（microsatellite instability-high，MSI-H）的轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌[3]。一般來說，無DNA錯配修復(fù)缺陷（mismatch repair-proficient，pMMR）及微衛(wèi)星穩(wěn)定（microsatellite stable，MSS）患者的預(yù)后比dMMR/MSI-H患者差，且對ICIs治療不敏感[4]。原因為pMMR/MSS患者的細(xì)胞毒性淋巴細(xì)胞浸潤水平較低，難以產(chǎn)生有效的抗腫瘤免疫反應(yīng)。了解結(jié)直腸癌免疫微環(huán)境中不同類型免疫細(xì)胞的浸潤水平及其功能對于評估結(jié)直腸癌患者免疫治療的預(yù)后，優(yōu)化結(jié)直腸癌免疫治療策略具有重要的意義[5]。本文回顧了結(jié)直腸癌免疫微環(huán)境中不同類型的免疫細(xì)胞的作用，并討論了針對不同類型免疫細(xì)胞的潛在治療方法，旨在更好地了解結(jié)直腸癌免疫微環(huán)境的組成及其作用，優(yōu)化當(dāng)前結(jié)直腸癌免疫治療策略，提升免疫治療效果。

1 結(jié)直腸癌免疫微環(huán)境的組成及其作用

結(jié)直腸癌免疫微環(huán)境的組成成分包括T細(xì)胞、B細(xì)胞、巨噬細(xì)胞及其相關(guān)信號分子等，不同類型的免疫細(xì)胞在結(jié)直腸癌的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮著不同的作用。

（1）CD8+T細(xì)胞：腫瘤浸潤淋巴細(xì)胞（tumorinfiltrating lymphocytes，TILs）是結(jié)直腸癌免疫微環(huán)境的主要成分，主要包括T細(xì)胞和B細(xì)胞。T細(xì)胞是腫瘤免疫微環(huán)境中含量最豐富和最具特征性的免疫細(xì)胞，包括CD8+T細(xì)胞和CD4+T細(xì)胞。CD8+T細(xì)胞即細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞（cytotoxic T lymphocytes，CTLs），是適應(yīng)性免疫的關(guān)鍵組成部分，同時也是抗腫瘤免疫反應(yīng)的主要效應(yīng)細(xì)胞。CTLs可識別腫瘤抗原，通過穿孔素、顆粒酶、Fas配體等直接殺傷腫瘤細(xì)胞，同時還可以分泌白細(xì)胞介素-2（interleukin-2，IL-2）、干擾素-γ（interferon-γ，IFN-γ）以及腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）等進(jìn)一步增強對腫瘤細(xì)胞的殺傷作用[6]。然而，不可忽視的是，腫瘤細(xì)胞為了逃避免疫攻擊，可以通過表達(dá)免疫檢查點分子、分泌白細(xì)胞介素-10（interleukin-10，IL-10）、轉(zhuǎn)化生長因子β（transforming growth factor-β，TGF-β）等抑制性細(xì)胞因子等多種方式抑制CTLs對腫瘤細(xì)胞的殺傷活性[7]。PD-L1和PD-1是重要的免疫檢查點分子，腫瘤細(xì)胞和基質(zhì)細(xì)胞通過高表達(dá)PD-L1，與T細(xì)胞上的PD-1結(jié)合后，可以抑制T細(xì)胞活化，使殺傷性T細(xì)胞轉(zhuǎn)變?yōu)楹慕咝訲細(xì)胞，失去對腫瘤細(xì)胞的殺傷作用，從而促進(jìn)腫瘤的免疫逃逸[8]。CTLA-4在調(diào)節(jié)T細(xì)胞功能方面也發(fā)揮著重要的作用。它是一種跨膜蛋白，主要表達(dá)于活化的T細(xì)胞細(xì)胞膜表面，與B7分子結(jié)合后可向T細(xì)胞傳遞抑制性信號，誘導(dǎo)T細(xì)胞耗竭，靶向抑制CTLA-4可恢復(fù)T細(xì)胞的殺傷能力[9]。目前PD-1、PD-L1、CTLA-4已成為抗腫瘤免疫治療的重要靶點。

（2）CD4+T細(xì)胞：CD4+T細(xì)胞可通過分泌多種細(xì)胞因子來調(diào)節(jié)其他免疫細(xì)胞的功能，在激活其他免疫細(xì)胞（B細(xì)胞、CTLs等）、調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)過程中起關(guān)鍵作用。CD4+T細(xì)胞可進(jìn)一步分化為具有廣泛功能的T細(xì)胞亞群，包括輔助性T細(xì)胞（helper T cells，Th cells）Th1、Th17細(xì)胞和調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（regulatory T cells，Tregs）等。Th1細(xì)胞的主要功能在于激活CTLs等免疫細(xì)胞的效應(yīng)功能，輔助殺傷腫瘤細(xì)胞，增強抗腫瘤免疫反應(yīng)[10]。Th17則通過分泌如白細(xì)胞介素-17（interleukin-17，IL-17）、白細(xì)胞介素-21（interleukin-21，IL-21）和白細(xì)胞介素-22（interleukin-22，IL-22）等細(xì)胞因子發(fā)揮免疫抑制功能，促進(jìn)腫瘤生長和轉(zhuǎn)移[11]。研究發(fā)現(xiàn)，結(jié)直腸癌中較高的Th1細(xì)胞浸潤水平與患者更好的無病生存率相關(guān)，而Th17細(xì)胞的浸潤則與不良預(yù)后有關(guān)[12]。此外，CD4+T細(xì)胞中還包含一類經(jīng)典的免疫細(xì)胞——免疫抑制性Tregs，這類細(xì)胞表達(dá)特征性分子叉頭盒蛋白P3（forkhead box P3，F(xiàn)OXP3），并且可通過抑制IL-2分泌、釋放腺苷和分泌TGF-β、IL-10等抑制性細(xì)胞因子來負(fù)調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)，促進(jìn)腫瘤進(jìn)展[13]。Katz等[14]通過免疫組化分析表明，較高的FOXP3:CD4和FOXP3:CD8比率與結(jié)直腸癌患者較短的5年總生存期（overall survival，OS）相關(guān)，是結(jié)直腸癌患者預(yù)后的獨立預(yù)測指標(biāo)。然而，近年來一些研究發(fā)現(xiàn)結(jié)直腸癌中FOXP3+Tregs較高水平浸潤與較理想的無復(fù)發(fā)生存期和疾病特異性存活相關(guān)，F(xiàn)OXP3+Tregs較低水平浸潤患者的預(yù)后較差[15]。這種矛盾可能來源于腫瘤免疫微環(huán)境中Tregs的異質(zhì)性。Saito等[16]發(fā)現(xiàn)結(jié)直腸癌中Tregs可分為終末分化的免疫抑制亞群和促炎亞群，免疫抑制性Tregs浸潤水平升高與結(jié)直腸癌患者較差的預(yù)后相關(guān)。

（3）B細(xì)胞：B細(xì)胞是體液免疫的主要效應(yīng)細(xì)胞，可以通過分泌細(xì)胞因子、介導(dǎo)腫瘤抗原的呈遞、抗體依賴性細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒作用（antibody dependent cell-mediated cytotoxicity，ADCC）、激活補體等方式影響腫瘤的發(fā)展及其對免疫治療的反應(yīng)。Edin等[17]研究發(fā)現(xiàn)結(jié)直腸癌中較高水平的CD20+B細(xì)胞浸潤與較低的病理分期和顯著改善的疾病特異性生存相關(guān)，同時CD20+B細(xì)胞的浸潤水平與CD8+T細(xì)胞的浸潤水平呈高度正相關(guān)。此外，B細(xì)胞參與三級淋巴結(jié)構(gòu)（tertiary lymphoid structures，TLSs）的形成，TLSs由CD20+B細(xì)胞、CD4+濾泡輔助性T細(xì)胞（T follicular helpers，Tfhs）和濾泡樹突狀細(xì)胞等構(gòu)成[18]。越來越多的證據(jù)表明TLSs是一種有效的抗腫瘤免疫反應(yīng)結(jié)構(gòu)[19]。Posch等[20]通過對109例結(jié)直腸癌患者的腫瘤組織標(biāo)本分析發(fā)現(xiàn)大部分患者腫瘤組織中可觀察到TLSs，并且在dMMR/MSI-H結(jié)直腸癌腫瘤組織中更常見。此外，Posch等還發(fā)現(xiàn)TLSs的形成與較低的疾病復(fù)發(fā)風(fēng)險和較好的預(yù)后相關(guān)，這表明TLSs在結(jié)直腸癌相關(guān)免疫反應(yīng)及疾病進(jìn)展中發(fā)揮重要作用。

（4）巨噬細(xì)胞：腫瘤免疫微環(huán)境中富含巨噬細(xì)胞，巨噬細(xì)胞被認(rèn)為是實體瘤中浸潤最豐富的免疫細(xì)胞群之一[21]。巨噬細(xì)胞主要通過腫瘤細(xì)胞釋放的C-C 趨 化 因 子 （C-C motif chemokine， CCL）CCL2、CCL3、CCL4、CCL5等從外周募集[22]。腫瘤免疫微環(huán)境中巨噬細(xì)胞具有高度異質(zhì)性，可分為具有促炎、免疫活化、抗腫瘤特性的M1型巨噬細(xì)胞及具有免疫抑制、促腫瘤特性的M2型巨噬細(xì)胞。Lee等[23]通過對232例結(jié)直腸癌患者腫瘤組織標(biāo)本中巨噬細(xì)胞的預(yù)后預(yù)測價值分析發(fā)現(xiàn)M2型巨噬細(xì)胞浸潤水平較高的患者的無進(jìn)展生存期（progression free survival，PFS）和OS顯著縮短。CD163是M2型巨噬細(xì)胞的特征性分子標(biāo)志物，Wei等[24]研究發(fā)現(xiàn)，腫瘤侵襲前沿間質(zhì)組織中CD163的高表達(dá)與上皮—間質(zhì)轉(zhuǎn)化、間質(zhì)的循環(huán)腫瘤細(xì)胞比例及較差的預(yù)后相關(guān)。Yang等[25]基于對81例結(jié)直腸癌患者腫瘤組織標(biāo)本的免疫組化分析發(fā)現(xiàn)M2型巨噬細(xì)胞浸潤與較高的淋巴血管浸潤、腫瘤侵襲、TNM分期以及較差的OS相關(guān)。就功能方面而言，M2型巨噬細(xì)胞可通過多種方式促進(jìn)腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移。一方面，M2型巨噬細(xì)胞可通過促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)重塑[26]、誘導(dǎo)上皮—間質(zhì)轉(zhuǎn)化[24]促進(jìn)腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移；另一方面，M2型巨噬細(xì)胞通過分泌VEGF促進(jìn)腫瘤血管生成[27]，同時通過分泌免疫抑制性細(xì)胞因子IL-10和TGF-β促進(jìn)腫瘤免疫逃逸[28]，最終促進(jìn)結(jié)直腸癌的進(jìn)展。

2 結(jié)直腸癌免疫治療策略

（1）靶向T細(xì)胞的治療策略：ICIs主要通過靶向阻斷T細(xì)胞或腫瘤細(xì)胞表面的免疫檢查點蛋白或配體來恢復(fù)機(jī)體免疫功能。目前研究最廣泛的ICIs是靶向PD-1、PD-L1以及CTLA-4的抑制劑。帕博利珠單抗是靶向PD-1的ICIs之一，NCT01876511試驗確定了其對結(jié)直腸癌的治療作用。NCT01876511試驗包括11例dMMR結(jié)直腸癌患者和21例pMMR結(jié)直腸癌患者，其中dMMR患者的免疫治療相關(guān)客觀緩解率和無進(jìn)展生存率分別為40%和78%，pMMR患者分別為0%和11%。dMMR患者的中位PFS和OS未達(dá)到，而pMMR患者的中位PFS和OS分別為2.2個月和5.0個月[4]。KEYNOTE-164（NCT02460198）是一項評估帕博利珠單抗治療難治性dMMR/MSI-H轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌患者的Ⅱ期臨床試驗。試驗結(jié)束時，A組患者（既往接受≥二線治療）的中位隨訪時間為31.3個月，客觀緩解率為33%，中位PFS為2.3個月。B組患者（既往≥一線治療）中位隨訪時間為24.2個月，客觀緩解率為33%，中位PFS為4.1個月。A組與治療相關(guān)的3～4級不良事件的發(fā)生率為16%，B組為13%。該試驗證實了帕博利珠單抗對dMMR/MSI-H轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌患者的療效，使得dMMR/MSI-H轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌率先進(jìn)入免疫治療時代[29]。KEYNOTE-177（NCT02563002）是一項Ⅲ期臨床試驗，評估了帕博利珠單抗單藥一線治療dMMR/MSI-H轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌患者的療效。研究共納入307例既往未接受治療的dMMR/MSI-H轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌患者，并隨機(jī)分配至帕博利珠單抗組或化療聯(lián)合靶向治療組。結(jié)果表明帕博利珠單抗相較于化療聯(lián)合靶向治療可顯著改善初治型dMMR/MSI-H轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌患者的腫瘤緩解情況和PFS（16.5個月vs.8.2個月）。帕博利珠單抗已于2017年被FDA批準(zhǔn)用于治療不可切除或dMMR/MSI-H轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌患者。

另一種PD-1抑制劑是納武利尤單抗。納武利尤單抗在dMMR/MSI-H轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌患者中顯示出良好的治療效果。CheckMate 142試驗旨在評估以納武利尤單抗為基礎(chǔ)的治療對轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌患者的有效性和安全性。這項研究包含三個隊列，其中一個隊列是研究納武利尤單抗單藥用于標(biāo)準(zhǔn)治療失敗的dMMR/MSI-H轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌患者，在入組的74例患者中23例患者達(dá)到客觀緩解，客觀緩解率為31%。68.9%（51/74）的患者獲得了＞12周的疾病控制，12個月無進(jìn)展生存率和總生存率分別為50%和73%[30]。CheckMate 142試驗的另一個隊列研究內(nèi)容是評估納武利尤單抗和納武利尤單抗聯(lián)合伊匹木單抗治療對于既往化療失敗的dMMR/MSI-H轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌患者的療效。與納武利尤單抗單藥治療相比，納武利尤單抗聯(lián)合伊匹木單抗免疫治療對于接受過標(biāo)準(zhǔn)治療的dMMR/MSI-H的復(fù)發(fā)性或轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌患者具有較好的安全性和顯著的臨床療效[31]。此外，近期研究發(fā)現(xiàn)，一線使用納武利尤單抗聯(lián)合低劑量伊匹單抗具有強大而持久的臨床益處，并且具有較好的耐受性，有望成為dMMR/MSI-H轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌患者新的一線治療方法[32]。

（2）靶向巨噬細(xì)胞的治療策略：鑒于巨噬細(xì)胞對腫瘤免疫調(diào)控的重要作用，靶向巨噬細(xì)胞已經(jīng)成為免疫治療的新熱點，目前的研究已嘗試多種靶向巨噬細(xì)胞的抗腫瘤治療策略，包括抑制巨噬細(xì)胞募集和分化，逆轉(zhuǎn)巨噬細(xì)胞促腫瘤表型和靶向巨噬細(xì)胞效應(yīng)分子等[33]。由于腫瘤免疫微環(huán)境中的巨噬細(xì)胞主要表現(xiàn)為M2型，因此誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞從M2型到M1型的極化被視為一種具有臨床應(yīng)用前景的治療方法。Georgoudaki等[34]發(fā)現(xiàn)通過靶向抑制巨噬細(xì)胞表面受體（macrophage receptor with collagenous structure，MARCO）可以在結(jié)腸癌小鼠模型中將M2型巨噬細(xì)胞極化為M1型并誘導(dǎo)抗腫瘤活性。Halama等[35]發(fā)現(xiàn)靶向抑制C-C趨化因子受體5（C-C chemokine receptor type 5，CCR5）可以調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞從M2型向M1型極化發(fā)揮抗腫瘤作用，并在晚期難治性結(jié)直腸癌肝轉(zhuǎn)移患者的Ⅰ期臨床試驗中得到證實。此外巨噬細(xì)胞集落刺激因子1（colony stimulating factor-1，CSF-1）在巨噬細(xì)胞分化和血管生成中起重要作用，目前以集落刺激因子1受體（colony stimulating factor 1 receptor，CSF1R）抑制劑為代表的靶向巨噬細(xì)胞抗腫瘤治療已經(jīng)進(jìn)入臨床前階段[36]。RG7155（emactuzumab）是一種人源化單克隆抗體，可與CSF1R結(jié)合并阻斷其二聚化。在結(jié)直腸癌小鼠模型中，使用RG7155治療可減少腫瘤組織中浸潤的M2型巨噬細(xì)胞數(shù)量并升高CD8+T細(xì)胞浸潤水平，提示使用RG7155治療是一種有希望的靶向巨噬細(xì)胞的治療方法[37]。筆者團(tuán)隊通過對接受CSF1R抑制劑治療的小鼠進(jìn)行單細(xì)胞測序發(fā)現(xiàn)SPP1+腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞（tumor associated macrophages，TAMs）可能是導(dǎo)致CSF1R抑制劑耐藥的關(guān)鍵因素，抑制SPP1+TAMs活性或減少其數(shù)量可能是提升CSF1R抑制劑療效的有效途徑[38]。

（3）靶向B細(xì)胞的治療策略：除T細(xì)胞和髓系細(xì)胞外，開發(fā)基于B細(xì)胞的免疫治療策略對于結(jié)直腸癌治療也有較好的臨床應(yīng)用前景。B細(xì)胞通過充當(dāng)抗原提呈細(xì)胞、產(chǎn)生高親和力抗體和分泌抗腫瘤細(xì)胞因子來支持抗腫瘤免疫反應(yīng)并促進(jìn)免疫治療反應(yīng)，因此增強腫瘤免疫微環(huán)境中抗腫瘤B細(xì)胞的活性可能是靶向B細(xì)胞免疫治療的有效途徑。筆者團(tuán)隊發(fā)現(xiàn)人膜聯(lián)免疫球蛋白IgG1重鏈基因hIgG1-G396R突變可增強B細(xì)胞的活性，向結(jié)腸癌模型的小鼠體內(nèi)過繼輸注hIgG1-G396R同源體，小鼠體內(nèi)的高反應(yīng)性B細(xì)胞可明顯抑制腫瘤生長[39]。此外，近年有研究發(fā)現(xiàn)了一種在腫瘤免疫微環(huán)境中發(fā)揮抑制作用的B細(xì)胞——調(diào)節(jié)性B細(xì)胞（regulatory B cells，Bregs）。Bregs已被證明在抑制與腫瘤相關(guān)的免疫反應(yīng)中發(fā)揮著關(guān)鍵作用[40]。Yarchoan等[41]發(fā)現(xiàn)使用絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）抑制劑治療可抑制Bregs活性，并減少結(jié)直腸癌小鼠模型中腫瘤引流淋巴結(jié)中的Bregs數(shù)量，但不影響抗腫瘤B細(xì)胞功能，從而增強抗腫瘤免疫力，這提示靶向抑制Bregs細(xì)胞功能可能是潛在的結(jié)直腸癌免疫治療策略，但是仍需要進(jìn)一步研究結(jié)直腸癌中Bregs細(xì)胞相關(guān)分子標(biāo)志物，確定關(guān)鍵的Bregs靶點以提升治療效果。

3 小結(jié)與展望

越來越多的證據(jù)表明免疫微環(huán)境在結(jié)直腸癌發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮關(guān)鍵作用，是影響結(jié)直腸癌患者免疫治療生存預(yù)后的重要因素。近年來，免疫治療已成為腫瘤治療領(lǐng)域的研究熱點，包含ICIs在內(nèi)的多種靶向免疫微環(huán)境的治療策略已經(jīng)在結(jié)直腸癌中取得了一定的成效。然而不可忽視的是，免疫治療在結(jié)直腸癌中的療效仍有待進(jìn)一步提升。深入挖掘結(jié)直腸癌免疫微環(huán)境中不同類型免疫細(xì)胞的功能特性與關(guān)鍵分子，發(fā)現(xiàn)更多具有臨床應(yīng)用價值的治療靶點，探索更優(yōu)的聯(lián)合治療策略將有助于進(jìn)一步提升免疫治療的效果，同時指導(dǎo)臨床醫(yī)師對結(jié)直腸癌患者進(jìn)行更加個體化的治療?？傊[瘤浸潤免疫細(xì)胞在腫瘤免疫微環(huán)境中發(fā)揮著重要作用，隨著免疫細(xì)胞在結(jié)直腸癌中的作用的不斷闡明和更多治療靶點的發(fā)現(xiàn)，將推動結(jié)直腸癌的免疫治療向更加個體化、科學(xué)化的方向發(fā)展。

利益沖突聲明全體作者均聲明不存在與本文相關(guān)的利益沖突。