HPLC-RID法測定食品中果糖、葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、乳糖的方法學驗證

李瓊

（山西省食品研究所（有限公司），山西太原 030024）

糖類是自然界最多的有機化合物，是食品中的重要風味成分和營養(yǎng)成分，其種類和含量是評價食品品質的重要質量指標。在食品加工工藝中，糖類對改變食品的形態(tài)、組織結構、物化性質以及色、香、味等感官指標起著十分重要的作用。因此，準確測定食品中各種糖的含量對食品品質改良、加工儲藏技術選擇、新產(chǎn)品開發(fā)等都具有重要意義。

隨著檢測技術的蓬勃發(fā)展，越來越多的檢測手段被運用到糖類檢測中，而高效液相色譜法因其高效、高靈敏度、重復性好等優(yōu)點，被廣泛用于產(chǎn)品中多種糖含量的測定中。我國現(xiàn)行的相關檢測標準有GB 5009.8—2016《食品安全國家標準食品中果糖、葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、乳糖的測定》，其第一法高效液相色譜-示差折光檢測（HPLC-RID）法適用于谷物類、乳制品、果蔬制品、蜂蜜、糖漿、飲料等食品中果糖、葡萄糖、蔗糖、麥芽糖和乳糖的測定。為了獲得穩(wěn)定、可靠和準確的數(shù)據(jù)，本試驗從校準曲線、檢出限、正確度、精密度等方面對該方法在本實驗室的適用性進行了驗證。

1 材料與方法

1.1 材料和儀器

樣品：沙棘汁飲料、蒙牛酸酸乳、麗美思紅棗濃漿、麗和堂蜂蜜、娃哈哈雪碧、娃哈哈雪碧纖維+、麻花，均購于當?shù)爻小?/p>

試劑：乙腈，色譜純；乙酸鋅、亞鐵氰化鉀，分析純；石油醚，沸程30 ℃～60 ℃。

標準品：果糖，CAS 號:57-48-7，純度99.7%；葡萄糖，CAS號:50-99-7，純度99.7%；蔗糖，CAS號:57-50-1，純度99.7%；麥芽糖，CAS 號:69-79-4，純度94.4%；乳糖，CAS 號:63-42-3，純度99.5%。

儀器：1260 液相色譜儀，帶示差折光檢測器，配氨基色譜柱（柱長250 mm，內徑4.6 mm，膜厚5μm），安捷倫科技有限公司；KS-5200DE 液晶超聲波清洗器，昆山潔力美超聲儀器有限公司；BSA224S 電子分析天平，賽多利斯科學儀器（北京）有限公司；AXTGL16M 臺式高速冷凍離心機，鹽城市安信實驗儀器有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 樣品制備

1.2.1.1 沙棘汁飲料、酸酸乳、紅棗濃漿

稱混勻后的試樣5 g（精確到0.001 g）于100 mL容量瓶中，加水約50 mL 溶解，緩慢加入乙酸鋅溶液和亞鐵氰化鉀溶液各5 mL，定容至刻度，超聲30 min，過濾，濾液用0.45μm微孔濾膜過濾至樣品瓶，上機測定。

1.2.1.2 蜂蜜

稱取混勻后的試樣1 g（精確到0.001 g）于50 mL容量瓶，加水定容至50 mL，充分搖勻，過濾，濾液用0.45μm微孔濾膜過濾至樣品瓶，上機測定。

1.2.1.3 雪碧

將混勻后試樣倒入蒸發(fā)皿中，在水浴上微熱攪拌去除二氧化碳，吸取50.0 mL 移入100 mL 容量瓶中，緩慢加入乙酸鋅溶液和亞鐵氰化鉀溶液各5 mL，定容至刻度，搖勻，靜置30 min，過濾，濾液用0.45μm微孔濾膜過濾至樣品瓶，上機測定。

1.2.1.4 麻花

稱取10 g（精確到0.001 g）粉碎均勻的試樣于100 mL 具塞離心管中，加入50 mL 石油醚，振搖2 min，1 800 r/min 離心15 min，去除石油醚后重復以上步驟至去除大部分脂肪。蒸發(fā)殘留的石油醚，將樣品轉移至100 mL 容量瓶中，用50 mL 水分2 次沖洗離心管，洗液并入100 mL 容量瓶中，緩慢加入乙酸鋅溶液和亞鐵氰化鉀溶液各5 mL，定容至刻度，超聲30 min，過濾，濾液用0.45μm 微孔濾膜過濾至樣品瓶，上機測定。

1.2.2 標準溶液配制

分別稱取上述經(jīng)過96 ℃干燥2 h 的果糖、葡萄糖、蔗糖、麥芽糖和乳糖各5 g，加水定容于250 mL，配制成質量濃度20 mg/mL 糖標準貯備液，分別稀釋成質量濃度1.0 mg/mL、2.0 mg/mL、4.0 mg/mL、6.0 mg/mL、10.0 mg/mL標準使用溶液。

1.2.3 儀器條件

流動相：乙腈+水=70+30（體積比）；流動相流速：1.0 mL/min；柱溫：40 ℃；進樣量：20μL；示差折光檢測器條件：溫度40 ℃。

1.2.4 試驗方法

將標準系列工作液分別在上述色譜條件下進行測定，以標準工作液的質量濃度為橫坐標，以峰面積為縱坐標繪制標準曲線，并對校準曲線進行分析。分別測定沙棘汁飲料、酸酸乳、紅棗濃漿、麻花等樣品中的果糖、葡萄糖、蔗糖、麥芽糖和乳糖，選出合適的樣品進行加標回收、精密度、重復性等驗證試驗，并對測定數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學分析。

2 結果與分析

2.1 校準曲線

果糖、葡萄糖、蔗糖、麥芽糖和乳糖標準系列線性方程及相關系數(shù)測定結果見表1。

表1 線性方程及相關系數(shù)

由表1 可知，在質量濃度1.0 mg/mL～10 mg/mL范圍內，5 種糖標準曲線的相關系數(shù)均＞0.99，滿足GB/T 27417—2017《合格評定化學分析方法確認和驗證指南》中校準曲線的要求。

2.2 樣品測定結果

在相同的液相色譜條件下，分別將制備好的試樣溶液注入高效液相色譜儀中，測定結果見表2。

表2 樣品中果糖、葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、乳糖測定結果

2.3 回收率試驗

以雪碧纖維素+為檢測對象，準確吸取50.00 mL樣品9 份，分別加入糖標準貯備液（其中果糖、麥芽糖質量濃度20.6 mg/mL、葡萄糖蔗糖20.0 mg/mL、乳糖20.80 mg/mL）3.0 mL、20.0 mL、40.0 mL，進行3 組回收率試驗，每組3 份，按1.2.1.3 處理后進行測定。分別計算果糖、葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、乳糖不同添加水平的平均回收率，試驗結果見表3。

表3 方法回收率試驗結果

由表3可知，3個添加水平果糖、葡萄糖、蔗糖、乳糖、麥芽糖的含量均＞100 mg/kg，回收率均在95.83%～104.75%范圍內，回收率符合GB/T 27417—2017《合格評定化學分析方法確認和驗證指南》中回收率的要求，即被測組分含量＞100 mg/kg，回收率范圍為95%～105%，表明該方法回收率良好，能滿足實驗室分析檢測的要求。

2.4 精密度試驗

以雪碧纖維素+為檢測對象，準確吸取50.0 mL樣品3 份，分別加入質量濃度為20.0 mg/mL 的糖標準貯備液3.0 mL、20.0 mL、40.0 mL，按1.2.1.3 處理后進行測定，每個濃度水平重復測定6 次，計算相對標準偏差（RSD），結果見下頁表4。

表4 方法的精密度試驗

由表4 可知，該方法在低、中、高3 個添加水平5 種糖測定結果的RSD范圍分別為2.45%～2.61%、0.94%～1.13%、0.62%～1.00%，滿足GB/T 27417—2017《合格評定化學分析方法確認和驗證指南》中精密度的要求，即被測組分含量為0.1%～1%范圍內，RSD＜3.8%；被測組分含量在1%～10%范圍內，RSD＜2.7%。

2.5 重復性試驗

以雪碧纖維素+為檢測對象，準確移取50 mL樣品6 份，各加入糖標準貯備液10.0 mL，按1.2.1.3 處理，測定其重復性，計算相對標準偏差（RSD），方法的重復性試驗結果見表5。

由表5 結果可知，該方法重復性良好，RSD為1.01%～1.99%，符合GB/T 27417—2017《合格評定化學分析方法確認和驗證指南》中精密度的要求。

表5 方法的重復性試驗

2.6 方法檢出限

根據(jù)GB 5009.8—2016 中檢出限要求，以雪碧纖維素+為檢測對象，準確吸取50.00 mL 樣品2份，分別加入1mL 質量濃度為20.0 mg/mL 的糖標準貯備液，按1.2.1.3 處理后上機測定，果糖、葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、乳糖的測定結果分別為0.050 g/100 mL、0.080 g/100 mL、0.042 g/100 mL、0.040 g/100 mL、0.050 g/100 mL，均有結果檢出，表明能滿足標準中檢出限的要求。

3 結論

試驗結果表明，校準曲線在1.0 mg/mL～10 mg/mL范圍內線性良好，果糖、葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、乳糖的線性方程分別為y=164 343.957 97x-3 536.278 98、y=140 125.076 95x+9 569.939 39、y=173 951.655 64x-456.633 10、y=131 176.391 06x+2 527.364 22、y=104 646.710 56x-1 114.805 84，相關系數(shù)分別為0.999 99、0.999 50、1.000 00、0.999 72、0.999 80；加標回收率為95.83%～104.75%，精密度試驗在低、中、高3 個添加水平5 種糖測定結果的RSD范圍分別為2.45%～2.61%、0.94%～1.13%、0.62%～1.00%，重復性試驗RSD為1.01%～1.99%，驗證結果滿足GB/T 27417—2017《合格評定化學分析方法確認和驗證指南》中相關要求。該方法線性良好、易操作、重現(xiàn)性良好、測量結果準確，能夠滿足實驗室檢測需求。