損傷相關(guān)分子
——針刺起效過(guò)程中的“前哨兵”

李亞男，徐枝芳，呂中茜，公一囡，馬 婕，郭 義

(天津中醫(yī)藥大學(xué)，天津 301617)

針灸療法作為中醫(yī)療法的重要組成部分已經(jīng)在中國(guó)應(yīng)用了數(shù)千年，盡管有部分高質(zhì)量證據(jù)證明針灸對(duì)某些疾病有效，但針灸進(jìn)入主流醫(yī)學(xué)仍然面臨兩大挑戰(zhàn)：一是缺乏有力的證據(jù)排除針灸安慰效應(yīng)；二為針灸如何起效缺乏公認(rèn)的科學(xué)機(jī)理[1]。筆者所在團(tuán)隊(duì)提出針刺作為一種機(jī)械性刺激，通過(guò)施行提插或捻轉(zhuǎn)手法，造成穴區(qū)微損傷及局部物理和化學(xué)信息變化，在針刺效應(yīng)啟動(dòng)中發(fā)揮重要作用[2]。損傷相關(guān)分子(Damage-associated molecular patterns，DAMPs)是組織或細(xì)胞受到損傷、缺氧及應(yīng)激等刺激后釋放到細(xì)胞間隙或血液循環(huán)中的一類(lèi)內(nèi)源性危險(xiǎn)信號(hào)，可被Toll樣受體、RIG-1樣受體或NOD樣受體等模式識(shí)別受體(Pattern Recognition Receptors，PRRs)識(shí)別，進(jìn)而誘發(fā)組織局部炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，釋放炎性因子，有助于機(jī)體做出防御反應(yīng)，進(jìn)而消除內(nèi)、外源致病因素，使機(jī)體內(nèi)環(huán)境恢復(fù)穩(wěn)態(tài)。兩者具有密不可分的關(guān)系，因此本研究系統(tǒng)分析了損傷相關(guān)分子參與針刺起效過(guò)程的相關(guān)研究，并討論研究如下。

1 針刺的固有屬性

針刺是一種微創(chuàng)傷性機(jī)械刺激，提插捻轉(zhuǎn)等針刺手法會(huì)引起穴區(qū)的物理變化，如局部組織發(fā)生形變、位移、結(jié)締組織纏繞與肌纖維斷裂等，造成穴區(qū)組織適度損傷。損傷組織可能釋放損傷相關(guān)分子引起局部良性(有序且可控的)炎癥反應(yīng)，包括白細(xì)胞、肥大細(xì)胞浸潤(rùn)，釋放血管活性物質(zhì)如組胺、P物質(zhì)和腺苷等，刺激神經(jīng)，擴(kuò)張局部血管，增強(qiáng)血液和淋巴循環(huán)[2]，啟動(dòng)穴區(qū)一系列化學(xué)信息變化，如免疫細(xì)胞募集、信號(hào)通路激活及化學(xué)物質(zhì)釋放，使得穴位微環(huán)境物理-化學(xué)耦合應(yīng)答，通過(guò)級(jí)聯(lián)放大引起后續(xù)生物學(xué)效應(yīng)，激活穴區(qū)小網(wǎng)絡(luò)，調(diào)節(jié)機(jī)體神經(jīng)-內(nèi)分泌-免疫大網(wǎng)絡(luò)，產(chǎn)生針效[3]。因此，針刺所引起的局部微創(chuàng)可能是穴區(qū)及后續(xù)系統(tǒng)反應(yīng)的源頭。

2 損傷相關(guān)分子

當(dāng)機(jī)體處于應(yīng)激狀態(tài)，或受到無(wú)菌性創(chuàng)傷和炎癥刺激時(shí)，細(xì)胞內(nèi)或細(xì)胞間質(zhì)均能產(chǎn)生一類(lèi)生物活性物質(zhì)，使得免疫系統(tǒng)感到“危險(xiǎn)”，進(jìn)而引起機(jī)體的免疫應(yīng)答[4]。這種能夠使免疫系統(tǒng)感到“危險(xiǎn)”進(jìn)而發(fā)出警報(bào)的生物介質(zhì)就是DAMPs，又可被稱(chēng)為“警報(bào)素”。DAMPs按來(lái)源可分為細(xì)胞外基質(zhì)和細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生兩大類(lèi)。一些細(xì)胞外基質(zhì)在組織損傷后會(huì)通過(guò)蛋白質(zhì)水解釋放DAMPs，比如雙糖鏈蛋白聚糖[5]、透明質(zhì)酸[6]等。在應(yīng)激和損傷環(huán)境中，不同種類(lèi)的細(xì)胞內(nèi)也會(huì)產(chǎn)生多種DAMPs，包括線(xiàn)粒體損傷后釋放的mtDNA[7]、mROS[8]等，核內(nèi)的高遷移率族蛋白(High Mobility Group Box 1，HMGB1)[9]、白介素-1α、白介素-33[10]、熱休克蛋白[11]、S100[12]、三磷酸腺苷[13]及尿酸等。

近幾年的研究中，人們逐漸認(rèn)識(shí)到DAMPs對(duì)于人體內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)十分重要，在機(jī)體中發(fā)揮著雙刃劍的作用。一方面， DAMPs在細(xì)胞內(nèi)清除病原體參與宿主防御和組織修復(fù)、調(diào)節(jié)DNA轉(zhuǎn)錄和維持鈣平衡，在細(xì)胞增殖和分化等方面發(fā)揮重要作用。另一方面，機(jī)體活細(xì)胞受到生命威脅時(shí)，DAMPs作為一種危險(xiǎn)信號(hào)會(huì)大量分泌及釋放，加劇炎癥和自身免疫應(yīng)答，致使組織損傷，加劇感染程度，進(jìn)而誘導(dǎo)無(wú)菌性過(guò)度炎癥、敗血癥和膿毒癥等危重病癥[14]。

3 損傷相關(guān)分子參與針刺起效

3.1 針刺與HMGB1

在龐大的HMG蛋白家族中，HMGB1作為最豐富且研究最深入的蛋白分子，幾乎能在所有真核生物的多種組織中廣泛表達(dá)[15]，且在細(xì)胞內(nèi)和細(xì)胞外都具有重要作用。起初人們認(rèn)為HMGB1僅存在于細(xì)胞核中，是一種高度保守的染色質(zhì)結(jié)構(gòu)蛋白，可作為DNA分子伴侶，幫助維持核穩(wěn)態(tài)和基因組穩(wěn)定。后來(lái)Bustin M等[16]證明 HMGB1 存在于哺乳動(dòng)物的細(xì)胞質(zhì)中，其主要功能是調(diào)節(jié)細(xì)胞死亡，且已被證明是一種重要的促自噬蛋白，可提高細(xì)胞存活率并抑制程序性凋亡細(xì)胞死亡。HMGB1的主要結(jié)構(gòu)是同源區(qū)域(稱(chēng)為A和B框)以及C端結(jié)構(gòu)域，根據(jù)結(jié)構(gòu)功能分析，HMGB1可具有促炎與抑炎雙向作用，其促炎活性定位于B盒，而A盒因本身可以減弱B盒肽的促炎作用被認(rèn)為具有抗炎活性，且在與酸性C尾端融合之后，抗炎活性會(huì)增強(qiáng)[17]。

HMGB1對(duì)生命體是不可或缺的，有文獻(xiàn)表明HMGB1敲除新生小鼠會(huì)因染色體HMGB1缺乏導(dǎo)致致命的低血糖癥[18]。細(xì)胞內(nèi)HMGB1可以通過(guò)介導(dǎo)巨噬細(xì)胞自噬來(lái)保護(hù)小鼠免受內(nèi)毒素血癥和細(xì)菌感染的侵害[19]。近期有系列研究認(rèn)為HMGB1在針刺的啟動(dòng)中可能發(fā)揮重要的作用。穴位是皮膚神經(jīng)源性炎癥點(diǎn)，針刺可引起穴區(qū)局部一系列的組織損傷，促進(jìn)炎性介質(zhì)如HMGB1、TLR4、TNF-α、IL-6和趨化因子的釋放，隨后激活細(xì)胞ERK、p38、JNK或NF-κB信號(hào)通路，觸發(fā)啟動(dòng)穴位微環(huán)境時(shí)序性級(jí)聯(lián)反應(yīng)，進(jìn)一步促進(jìn)HMGB1的合成釋放，形成一個(gè)正反饋循環(huán)，從而激活機(jī)體的先天和適應(yīng)性免疫[20]，促進(jìn)組織修復(fù)損傷。團(tuán)隊(duì)未發(fā)表的數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)針刺可上調(diào)正常大鼠與佐劑性關(guān)節(jié)炎(Adjuvant-induced arthritis,AIA)大鼠穴區(qū)HMGB1蛋白，中和穴區(qū)HMGB1可降低針刺效應(yīng)。研究證明電針可增強(qiáng)穴區(qū)HMGB1乙?；潭?，進(jìn)而提高其活性及受體CD24表達(dá)，緩解慢性壓迫性損傷大鼠的神經(jīng)病理性疼痛[21]。以上研究均提示針刺可通過(guò)上調(diào)穴區(qū)HMGB1蛋白發(fā)揮針刺鎮(zhèn)痛效應(yīng)。

針刺同樣對(duì)效應(yīng)器官的HMGB1有調(diào)節(jié)作用，文獻(xiàn)表明針刺可通過(guò)α7nAChR依賴(lài)性膽堿能信號(hào)抑制腦組織中HMGB1的釋放[22]，發(fā)揮抗炎作用，對(duì)抵抗短暫性腦缺血性損傷有重大意義[23]。針對(duì)嚴(yán)重?zé)釗p傷所致的急性肺損傷，電針ST36可顯著降低肺組織中HMGB1蛋白含量，下調(diào)血漿中IL-1β、IL-6等炎性細(xì)胞因子水平并改善肺組織損傷，提示針刺在全身性炎癥反應(yīng)的治療中頗具前景[24]。在治療疼痛方面，也有文獻(xiàn)顯示電針可以提高神經(jīng)病理性疼痛大鼠的痛閾值，改善痛覺(jué)行為反應(yīng)，其機(jī)制可能與抑制海馬區(qū)域HMGB1及其下游TNF-α、IL-1β等效應(yīng)因子水平有關(guān)[25]。故當(dāng)機(jī)體發(fā)生損傷、炎癥和細(xì)胞死亡等情況時(shí)，HMGB1會(huì)從損傷細(xì)胞中釋放，在效應(yīng)器官發(fā)揮促炎效應(yīng)，而針刺可下調(diào)效應(yīng)器官HMGB1表達(dá)達(dá)到抗炎效應(yīng)。

3.2 針刺與三磷酸腺苷

三磷酸腺苷(Adenosine triphosphate，ATP)是一種核苷酸，不僅參與細(xì)胞的能量代謝、DNA復(fù)制和轉(zhuǎn)錄過(guò)程中聚合酶的核酸化過(guò)程，還作為一種信號(hào)分子作用于細(xì)胞膜的嘌呤受體，參與外周和中樞神經(jīng)系統(tǒng)細(xì)胞外信號(hào)的傳遞以及細(xì)胞內(nèi)信號(hào)的轉(zhuǎn)導(dǎo)[26]。針效的產(chǎn)生離不開(kāi)針刺的物理刺激在穴區(qū)局部組織轉(zhuǎn)化為化學(xué)信息，沿復(fù)雜的神經(jīng)-內(nèi)分泌-免疫網(wǎng)絡(luò)途徑傳導(dǎo)整合，到達(dá)效應(yīng)器官發(fā)揮調(diào)節(jié)作用，而具有雙重身份的ATP在針刺起效過(guò)程中發(fā)揮著重要的作用。2010年， 美國(guó)Goldman教授等在《Nature Neuroscience》中發(fā)表的1篇論文中提到：腺苷作為一種抗傷害作用的神經(jīng)調(diào)節(jié)劑針刺后可在小鼠穴位局部釋放，與腺苷A1受體(A1 Adenosine Receptors,A1Rs)結(jié)合，發(fā)揮鎮(zhèn)痛效應(yīng)[27]。后又有研究發(fā)現(xiàn)不同時(shí)間點(diǎn)針刺AIA大鼠，穴區(qū)ATP濃度變化趨勢(shì)不同，且痛閾與穴區(qū)ATP濃度呈正相關(guān)，提示穴區(qū)局部ATP可能參與了針刺鎮(zhèn)痛時(shí)間特征的外周響應(yīng)[28]。而近幾年有學(xué)者將微透析法和膜片鉗技術(shù)結(jié)合，成功地實(shí)時(shí)檢測(cè)到針刺過(guò)程中大鼠足三里穴位釋放的ATP，為研究針刺信號(hào)的啟動(dòng)機(jī)制提供了一條新的途徑[29]。筆者團(tuán)隊(duì)前期研究也表明針刺過(guò)程中足三里穴區(qū)腺苷物質(zhì)明顯上升，于行針30 min達(dá)到峰值。綜上，針刺穴區(qū)局部ATP含量增加，ATP在被酶降解為一系列生物活性代謝物后，產(chǎn)生的腺苷可激活神經(jīng)元腺苷A1受體的表達(dá)，在針刺鎮(zhèn)痛中發(fā)揮積極作用。

3.3 針刺與熱休克蛋白

熱休克蛋白(Heat shock proteins，HSPs)是當(dāng)機(jī)體處于高溫、缺氧、創(chuàng)傷和缺血等情況下為保護(hù)機(jī)體細(xì)胞和組織免受傷害而合成的一組高度保守且功能多樣的應(yīng)激蛋白。HSP在病理?xiàng)l件下通過(guò)啟動(dòng)其他蛋白質(zhì)折疊、修復(fù)，促進(jìn)變性蛋白質(zhì)的重新折疊以及不可修復(fù)蛋白質(zhì)的降解等介導(dǎo)信號(hào)傳導(dǎo)、細(xì)胞凋亡、炎癥反應(yīng)及氧化應(yīng)激等病理生理過(guò)程，從而發(fā)揮細(xì)胞保護(hù)作用[30]。HSP家族分為高分子量和小分子量的HSP，高分子量HSP主要細(xì)胞功能是通過(guò)ATP依賴(lài)的變構(gòu)組織來(lái)結(jié)合和折疊新生蛋白質(zhì)；小分子HSP或熱休克蛋白β(HspBs)是不依賴(lài)ATP的分子伴侶，在胚胎發(fā)育、心肌形成、腫瘤生物標(biāo)志物形成以及蛋白質(zhì)折疊中發(fā)揮重要作用[31]。

針刺作為一種機(jī)體的創(chuàng)傷刺激，在腦缺血[32]、心肌缺血再灌注[33]和抑郁癥[34]等方面通過(guò)調(diào)節(jié)HSP分子來(lái)達(dá)到預(yù)防或者治療的目的。楊永清教授發(fā)現(xiàn)正常大鼠針刺后穴區(qū)局部熱休克蛋白、微管蛋白、血清白蛋白等參與免疫過(guò)程的蛋白顯著上調(diào)[35]。同時(shí)在病理?xiàng)l件下電針可激活穴位局部的HSP，使其表達(dá)明顯增加，改善內(nèi)臟高敏感模型大鼠的痛閾[36]。對(duì)于患有阿爾茨海默癥的SAMP8小鼠，針刺可通過(guò)減少氧化蛋白損傷并促進(jìn)Hsp84和Hsp86表達(dá)來(lái)延緩其大腦衰老[37]。有文獻(xiàn)表明，HSP70在多種疾病中發(fā)揮保護(hù)作用，針刺大多上調(diào)其表達(dá)。在急性胃黏膜損傷大鼠模型上，針刺可以使胃黏膜TGF-α和HSP70表達(dá)增強(qiáng)，且留針時(shí)間越長(zhǎng)療效越好，因此針刺能修復(fù)大鼠胃黏膜損傷可能與HSP70等內(nèi)源性保護(hù)物質(zhì)的合成有關(guān)[38]。由此可見(jiàn)，針刺大多增加穴區(qū)HSP的含量，但在效應(yīng)器官會(huì)根據(jù)HSP分子本身對(duì)機(jī)體產(chǎn)生的積極或消極影響來(lái)上調(diào)或下調(diào)其表達(dá)，更好地發(fā)揮針刺療效。

3.4 針刺與S100蛋白

在既往30年里，S100蛋白一直是廣泛研究的對(duì)象，該蛋白家族可以通過(guò)充當(dāng)細(xì)胞內(nèi)Ca2+傳感器和細(xì)胞外因子來(lái)調(diào)節(jié)細(xì)胞反應(yīng)，當(dāng)與Ca2+結(jié)合后，S100蛋白構(gòu)象發(fā)生改變，暴露其與靶蛋白的結(jié)合位點(diǎn)，進(jìn)而通過(guò)與相應(yīng)的效應(yīng)靶蛋白相互作用，發(fā)揮其在調(diào)節(jié)體內(nèi)鈣平衡、平滑肌收縮、細(xì)胞增殖和凋亡、炎癥反應(yīng)等生理和病理過(guò)程中重要的生物學(xué)功能[39]。研究發(fā)現(xiàn)電針通過(guò)降低認(rèn)知功能障礙大鼠模型血清S-100β蛋白來(lái)減少腦損傷并促進(jìn)神經(jīng)再生[40]。在AIA小鼠中觀察到脊髓周?chē)难装Y生物標(biāo)記物GFAP、S100B和RAGE的水平上調(diào)，電針則可以使這些炎癥生物標(biāo)志物表達(dá)下調(diào)，進(jìn)而減輕AIA小鼠炎性疼痛，具有良好的鎮(zhèn)痛效果[41]。S100A9被認(rèn)為是炎癥中最重要的氧化劑清除劑之一，有研究表明S100A9基因在哮喘早期氣道反應(yīng)階段顯著增加[42]，而針刺可下調(diào)S100A9基因表達(dá)3倍之多[43]。同時(shí)S100A9蛋白表達(dá)降低可以刺激ROS的產(chǎn)生和抑制p38MAPK磷酸化[44]，從而促進(jìn)大鼠氣道平滑肌細(xì)胞的增殖，這在哮喘氣道重塑中起重要作用。因此，針刺大多作用于效應(yīng)器官部位的S100蛋白，且通過(guò)下調(diào)其表達(dá)發(fā)揮治療作用。

在針效啟動(dòng)和發(fā)展過(guò)程中，各DAMPs并不是一座座“孤島”，而是相互之間緊密聯(lián)系、協(xié)同合作。在針刺導(dǎo)致局部組織微損傷后，DAMPs(包括HMGB1、ATP及HSP等)由死細(xì)胞被動(dòng)釋放或應(yīng)激細(xì)胞主動(dòng)分泌，激活TLR和炎癥小體[45]，創(chuàng)造促炎環(huán)境，募集所需細(xì)胞到達(dá)損傷部位，快速啟動(dòng)免疫反應(yīng)，吞噬死亡細(xì)胞和細(xì)胞碎片等來(lái)清潔傷口，最終促進(jìn)再生過(guò)程[46]。

4 小結(jié)

針刺起效的普適性作用原理是其作為一種微小創(chuàng)傷，可通過(guò)上調(diào)穴區(qū)HMGB1、ATP等DAMPs，參與針刺啟動(dòng)過(guò)程。而在效應(yīng)器官部位針刺對(duì)DAMPs的調(diào)節(jié)作用則具有特殊性，對(duì)于發(fā)揮促炎活性的部分DAMPs可下調(diào)其表達(dá)，但一些發(fā)揮保護(hù)作用的DAMPs如HSP70、HSP84等可被針刺激活并在效應(yīng)器官增加表達(dá)量，起到更好的治療效果。因此，針刺雖然是一種損傷刺激，但其具有啟動(dòng)機(jī)體調(diào)節(jié)自穩(wěn)態(tài)能力，而DAMPs作為針刺起效過(guò)程中的“前哨兵”，可被其雙向調(diào)控，促進(jìn)機(jī)體自我修復(fù)調(diào)節(jié)能力，恢復(fù)內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)，達(dá)到更好的治療效果。但目前關(guān)于針刺過(guò)程中DAMPs多為單一碎片化研究，與針刺引起的物理變化尚未建立起相互聯(lián)系、相互影響的復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)概念，且物理-化學(xué)因素之間的耦合互作關(guān)系缺乏系統(tǒng)研究，有待于進(jìn)一步探索。